К вопросу о лабораторной диагностике урогенитального трихомониаза с учетом концентрации Trichomonas vaginalis в биологическом материале

Урогенитальный трихомониаз — широко распространенная инфекция, передаваемая половым путем, возбудителем которой является Trichomonas vaginalis — простейший одноклеточный микроорганизм, приспособившийся в процессе эволюции к паразитированию в органах мочеполовой системы человека. В связи с неспецифическими клиническими проявлениями диагноз трихомонадной инфекции основывается на результатах лабораторных исследований. Основными методами, используемыми для выявления трихомонад в биологическом материале, являются микроскопия окрашенного препарата, культуральное исследование, а также выявление ДНК и РНК возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции НАСБА (NASBA). В многочисленных исследованиях установлено, что диагностическая чувствительность методов выявления трихомонад варьирует в широких пределах. Так, для ПЦР она находится в диапазоне 93—98,7%, для микроскопии — 50—64,9% и для культурального метода — 73—89,2% [1—5]. Несмотря на это, в нашей стране преобладающим методом при установлении диагноза трихомониаза остается микроскопия, что объясняется его относительно низкой стоимостью и быстротой исполнения [6].

В нашем предыдущем исследовании установлена аналитическая чувствительность тестов, используемых для выявления трихомонад. Наибольшей аналитической чувствительностью обладали тесты на основе методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК) — ПЦР и НАСБА. Чувствительность тестов на основе микроскопии и культурального посева была значительно ниже [7]. Однако для того, чтобы определить долю случаев трихомонадной инфекции, которая может быть установлена только с использованием МАНК, было проведено исследование по определению концентрации T.vaginalis в биологическом материале и сопоставлению полученных значений с показателями аналитической чувствительности микроскопии и посева.

Материал и методы

В ходе исследования проанализирован биологический материал (мазок из влагалища, соскоб из цервикального канала и уретры), полученный от 13 376 пациентов (11 218 женщин, 2158 мужчин), обратившихся в Центр молекулярной диагностики ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (ЦМД ЦНИИЭ) в период с марта 2009 г. по июнь 2012 г.

Экстракцию ДНК из биологического материала проводили с помощью набора ДНК-Сорб-АМ (№ФСР 2007/00183 от 13.07.09). Дальнейшее качественное исследование на наличие ДНК T. vaginalis проводили с использованием серийно выпускаемого набора реагентов «АмплиСенс Trichomonas vaginalis-FL» (№ФСР 2009/06556 от 18.11.11), согласно инструкции производителя. Реакцию амплификации с детекцией в режиме реального времени проводили на приборе Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия).

Для определения концентрации ДНК T. vaginalis в биологическом материале нами была дополнительно разработана методика количественного определения возбудителя в образце на основе ПЦР в реальном времени. В качестве мишени для ПЦР был выбран однокопийный ген трихомонады [8]. Благодаря однокопийности мишени можно определить концентрацию T. vaginalis в исследуемом материале с учетом того, что 1 копия = 1 геномный эквивалент (ГЭ)=1 клетка. Амплификацию и детекцию продуктов реакции проводили с помощью прибора Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия). Концентрацию возбудителя в образце рассчитывали с помощью программного обеспечения данного прибора относительно трех количественно охарактеризованных стандартов ДНК. Линейный диапазон методики составил 10³—10⁷ ГЭ/мл.

Результаты и обсуждение

Нами исследованы 13 376 биологических образцов. ДНК T. vaginalis была обнаружена у 210 человек (у 199 женщин и 11 мужчин). Таким образом, распространенность составила 1,77% для женщин и 0,51% для мужчин. Невысокая распространенность объясняется тем, что большая часть образцов была получена от пациентов, обратившихся в учреждения недерматовенерологического профиля с профилактическими целями, т.е. не относящихся к группе риска инфицирования инфекциями, передаваемыми половым путем.

Результаты количественного исследования свидетельствуют о том, что концентрация ДНК T. vaginalis в биологическом материале варьирует от 100 до 2,8·10⁷ ГЭ/мл (рис. 1).

Рисунок 1. Распределение концентраций ДНК T. vaginalis в биологическом материале (n=210).

Медиана концентрации составила 1,9·10⁴ ГЭ/мл.

Ранее A. Philip и соавт. [9] провели подобное исследование. Однако для количественной оценки трихомонад они использовали культивирование на твердых питательных средах. Авторы отметили, что у бессимптомных пациентов концентрация трихомонад в среднем ниже, чем у пациентов с клиническими проявлениями. При этом из 84 пациенток, у которых была обнаружена трихомонадная инфекция, жалобы и клинические проявления отсутствовали у 32. Из них в 6 случаях концентрация трихомонад варьировала от 10⁵ до 10⁶ КОЕ/мл, в 1 превышала 10⁶, а в остальных 25 варьировала от 10³ до 10⁴ КОЕ/мл. При этом концентрация ниже 10⁵ КОЕ/мл с помощью микроскопии уже не определялась.

В общей сложности микроскопически трихомонады были обнаружены только в 8 (25%) из 32 образцов. Таким образом, результаты этой работы свидетельствуют о том, что диагностическая чувствительность метода микроскопии напрямую зависела от концентрации возбудителя в образце: чем ниже концентрация, тем ниже диагностическая чувствительность.

В исследовании, проведенном A. Stary и соавт. [10], также было показано, что у значительной части пациентов с трихомониазом (45%) отсутствовали симптомы и клинические проявления инфекции и диагностическая чувствительность микроскопии у бессимптомных пациентов была меньше (70,3%), чем у пациентов с клиническими проявлениями (89,2%).

В нашем исследовании клинический статус пациентов не оценивался, однако поскольку обследованные пациенты обращались в клиники недерматовенерологического профиля, можно предположить, что у многих из них не было симптомов, и, следовательно, имелась невысокая концентрация T. vaginalis.

Ранее нами были установлены значения аналитической чувствительности используемых в лабораторной практике тестов выявления T. vaginalis, которые для ПЦР и НАСБА составили около 10 ГЭ/мл, для микроскопии — 10⁵ ГЭ/мл и для культурального посева — 10⁴ ГЭ/мл [7]. Таким образом, аналитическая чувствительность ПЦР и НАСБА на несколько порядков превысила чувствительность микроскопического и культурального методов. Полученное нами распределение концентраций ДНК T. vaginalis в биологическом материале в данном исследовании свидетельствовало о том, что в 57,1% случаев концентрация возбудителя в образцах была ниже, чем граница аналитической чувствительности микроскопии (рис. 2, а).

Рисунок 2. Распределение значений концентраций ДНК T. vaginalis в биологических образцах (n=210) и оценка диагностической чувствительности традиционных методов исходя из значений их аналитической чувствительности. а — метод микроскопии (МС), б — культуральный метод (КМ). POS — образцы, в которых концентрация ДНК T. vaginalis выше аналитической чувствительности метода; NEG — образцы, в которых концентрация ДНК T. vaginalis ниже аналитической чувствительности метода.

В 39,5% случаев концентрация была ниже, чем граница аналитической чувствительности культурального метода (см. рис. 2, б), т.е. показатели диагностической чувствительности для микроскопии и культурального посева при их использовании для выявления трихомонад у пациентов данной группы были бы равны 42,9 и 60,5% соответственно. В работе A. Pillay и соавт. [11] диагностическая чувствительность как для микроскопии, так и для культурального посева была равна 44%, т.е. показатель диагностической чувствительности для культурального метода был даже ниже, чем рассчитанное нами значение (60,5%). Вероятно, это связано с тем, что при определении аналитической чувствительности нами были созданы «идеальные» условия для культивирования трихомонад и последующей их микроскопической визуализации. В частности, культивируя лабораторный штамм T. vaginalis, мы были избавлены от наличия в культуральной среде типичного содержимого биологического материала (клетки разных типов эпителия, лейкоциты, грибковая и микробная микрофлора и продукты ее жизнедеятельности), которое может значительно ухудшать ростовые свойства среды, снижая чувствительность метода, и повышать субъективизм микроскопического и культурального исследования.

К этому следует добавить и то, что при минимальных концентрациях простейших в разведениях исследование проводилось детальнее, чем в рутинной практике врача-лаборанта. В условиях эксперимента мы заранее знали, что в материале могут содержаться трихомонады, и при микроскопии придонного слоя среды, по мере увеличения разведения культуры мы исследовали до 100 полей зрения для поиска трихомонад. В условиях рутинной клинической практики исследуются не более 10 полей зрения. Особенностью применяемых нами молекулярно-биологических тестов на основе ПЦР (АмплиСенс T. vaginalis-FL) и НАСБА (АмплиСенс T. vaginalis-РИБОТЕСТ) является наличие этапа высокоэффективной пробоподготовки, в результате которого ДНК и РНК биологического материала почти полностью очищается от находящихся в нем ингибиторов, что способствует высокой диагностической чувствительности метода. Использование в указанных тестах в качестве мишени мультикопийных фрагментов ДНК-повторов и 18S рРНК обеспечивает им высокую аналитическую чувствительность, благодаря которой в биологическом образце определяются даже единичные клетки возбудителя.

Таким образом, применяемые в клинической лабораторной практике тесты на основе ПЦР и НАСБА позволяют установить инфицирование трихомонадой у почти в 2 раза большего числа лиц, чем микроскопия и культуральный посев.