Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Махнева Н.В.

Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии Департамента здравоохранения

Давиденко Е.Б.

Московский научно-практический центр дерматовенерологии и косметологии;
Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского

Белецкая Л.В.

ФГУ "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. В.И. Шумакова" Минздрава России, Москва

Метод меченых антител как "золотой стандарт" диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов

Авторы:

Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В.

Подробнее об авторах

Просмотров: 6847

Загрузок: 116


Как цитировать:

Махнева Н.В., Давиденко Е.Б., Белецкая Л.В. Метод меченых антител как "золотой стандарт" диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов. Клиническая дерматология и венерология. 2013;11(4):22‑29.
Makhneva NV, Davidenko EB, Beletskaia LV. A labeled antibody method as the "gold standard" diagnosis of autoimmune bullous dermatitides. Russian Journal of Clinical Dermatology and Venereology. 2013;11(4):22‑29. (In Russ.)

Рекомендуем статьи по данной теме:
IgM-за­ви­си­мый бул­лез­ный пем­фи­го­ид. Кли­ни­чес­кая дер­ма­то­ло­гия и ве­не­ро­ло­гия. 2025;(2):191-197
Экспрес­сия тран­сфер­ри­но­вых ре­цеп­то­ров 1 и β1-ин­тег­ри­нов кор­ре­ли­ру­ет со ста­ту­сом ре­цеп­то­ров эс­тро­ге­нов и им­мун­ной ин­фильтра­ци­ей при ра­ке мо­лоч­ной же­ле­зы. Ар­хив па­то­ло­гии. 2024;(4):23-30

Аутоиммунные буллезные дерматозы — гетерогенная группа хронических органоспецифических аутоиммунных заболеваний кожи и слизистых оболочек с общим патогенетическим механизмом — вовлечением в патологический процесс аутоантител, взаимодействующих со специфическими молекулами адгезии десмосом эпидермиса, базальной мембраны и дермо-эпидермального соединения [1—3]. Несмотря на достигнутые успехи в изучении патогенеза этих дерматозов на уровне молекулярно-биологических исследований проблема остается одной из важных в дерматологии. Это связано с клиническим сходством и/или атипичными проявлениями буллезных дерматозов, особенно на ранних этапах их развития, с сомнительными результатами симптома Никольского, не позволяющими врачу у постели больного с уверенностью поставить клинический диагноз. Установление точного диагноза с целью дифференциальной диагностики, подбора адекватных методов терапии (разные формы патологии требуют разные схемы лечения) и выбора тактики ведения пациента является одной из серьезных задач в клинике буллезных дерматозов.

Данные по дополнительному применению к клиническому обследованию некоторых лабораторных методов свидетельствуют о том, что во многих случаях они способствуют уточнению диагноза [4, 5]. Так, более полувека назад иммунофлюоресценция как метод меченых антител, «ворвавшись» в медицину, совершила технологическую революцию в изучении патогенеза и разработке новых методов диагностики ряда заболеваний аутоиммунного происхождения, таких как истинная пузырчатка, буллезный пемфигоид, герпетиформный дерматит Дюринга, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз [6].

Несмотря на свой «возраст» метод меченых антител (прямой и непрямой методы иммунофлюоресценции) во всем мире считается одним из «золотых стандартов» и единственным иммунопатологическим инструментом в диагностике буллезных дерматозов, с помощью которых удается выявить фиксированные иммунные комплексы (иммуноглобулины и компоненты комплемента) в тканях больного и наличие в сыворотке циркулирующих аутоантител, направленных к антигенам тканей кожи [7].

Основные принципы использования метода меченых антител

Суть метода меченых антител, в частности иммунофлюоресценции, заключается в использовании люминесцентного варианта реакции антиген—антитело, происходящей при соединении антигенов с соответствующими специфическими антителами, меченными флюоресцирующими красителями. Метод используется в двух модификациях — прямой и непрямой. Иммунологическая реакция антиген—антитело происходит непосредственно на предметном стекле [6, 8].

Прямой метод иммунофлюоресценции. Прямой метод иммунофлюоресценции используют для выявления фиксированных антител (иммуноглобулинов) и полных иммунных комплексов (иммуноглобулины, компоненты комплемента). Для этого исследуют биопсию с клинически интактного участка кожи. Под местной анестезией 2,0% раствором новокаина или лидокаина проводится биопсия кожи размером 0,3—0,5×0,5 см. Для постановки точного диагноза и исключения неверных интерпретаций артефактных результатов исследования (ложноположительных и ложноотрицательных) биопсийный материал получают строго с интактного участка кожи больного.

Образец ткани помещают в чистый пенициллиновый флакон, на дне которого находится ватка, смоченная физиологическим раствором или водой для инъекций. Излишки физиологического раствора необходимо удалить из флакона для создания в нем условий, приближенных к физиологическим. Затем резиновую крышку флакона прокалывают иглой для подкожных инъекций, на кончик которой «монтируют» кусочек исследуемой ткани. Поскольку белковые структуры ткани имеют тенденцию к разрушению, транспортировка должна осуществляться немедленно. При отсутствии возможности отправить биопсийный материал немедленно, его необходимо поместить в холодильник (4 °С) и транспортировать в течение 1 сут.

Ткань биоптата замораживают при низкой температуре (–20 °С (–60 °С) и заливают гелем Tissue-Tek. Серийные срезы из замороженной нефиксированной ткани толщиной 5 мкм готовят в криостате (–20 °С), помещают на предметное стекло, подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем срезы промывают в фосфатном буфере (PBS) pH 7,0—7,4 в течение 5 мин для удаления не связанных с тканями растворимых белков и обрабатывают люминесцирующей сывороткой (метка изотиоцианатом флюоресцеина) против Ig основных классов (G, A, M), С3-компонента комплемента и фибрина во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем вновь промывают PBS в течение 5 мин и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Для предохранения срезов от выгорания в люминесцентном микроскопе в глицерин добавляют парафенилендиамин. Для морфологического контроля одновременно проводят изучение криостатных срезов, окрашенных гематоксилином и эозином, в световом микроскопе [6, 8].

Непрямой метод иммунофлюоресценции. Для исследования циркулирующих антител в сыворотке у пациента берут кровь из кубитальной вены объемом 3,0—5,0 мл в чистую сухую пробирку без реагентов в любое время суток и независимо от приема пищи. Полученный материал транспортируют в лабораторию немедленно или хранят не более 1 сут в холодильнике (4 °С) с последующей транспортировкой.

Поскольку аутоантитела при аутоиммунных буллезных дерматозах направлены к тканеспецифическим антигенам, имеющимся в органах большинства видов животных класса млекопитающих, с целью их выявления используют разные субстраты из тканей кожи и других органов человека, а также и ряда видов животных (крыс, мышей, кроликов, обезьян, телят). По нашим данным, наиболее чувствительным субстратом является пищевод кролика, кожа кролика, крысы и теленка, слизистая оболочка полости рта крысы, наименее — нормальная кожа человека и обезьяны, пищевод обезьяны, а нечувствительным — слизистая оболочка полости рта и влагалище обезьяны [6, 8].

Криостатные нефиксированные срезы толщиной 4—5 мкм тщательно промывают в PBS (pH 7,0—7,4) в течение 5 мин, затем их сначала обрабатывают исследуемой (промежуточной) немеченой сывороткой больного. Эту сыворотку применяют в максимально большом числе разведений, учитывая в дальнейшем при оценке результатов самое большое разведение, которое дает четкую положительную реакцию. Обработку срезов проводят во влажной камере при комнатной температуре в течение 45—60 мин. Далее срезы промывают в течение 5 мин PBS (pH 7,0—7,4), обрабатывают меченой сывороткой против класса IgG и/или IgA человека в течение 30 мин, вновь промывают 5 мин PBS и заключают под покровное стекло в 60% нейтральный глицерин. Препараты исследуют под люминесцентным микроскопом. Одновременно ставят положительный и отрицательный контроли. В качестве отрицательного контроля используют нормальную сыворотку (здорового человека или животного) в тех же разведениях. Период инкубации на срезе равен времени инкубации испытуемой сыворотки, содержавшей антитела. В качестве положительного контроля используют сыворотку больного, содержащую антитела к изучаемому антигену и хранящуюся в замороженном виде [6].

Результаты

Как уже отмечалось, аутоиммунные буллезные дерматозы – это гетерогенная группа хронических органоспецифических аутоиммунных заболеваний кожи и слизистых оболочек. Каждое заболевание из этой группы (аутоиммунная пузырчатка, буллезный пемфигоид, герпетиформный дерматит Дюринга, приобретенный буллезный эпидермолиз, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз) имеет специфическую иммунопатологическую картину, которая позволяет с точностью дифференцировать заболевания друг от друга [1].

Аутоиммунная пузырчатка

Аутоиммунная пузырчатка — одно из самых ярких образцов аутоиммунного заболевания. Аутоантитела служат причиной нарушения связей между отдельными клетками эпидермиса, развития акантолиза и образования внутриэпидермальных пузырей [8, 9].

Аутоантитела характеризуются высокой тканевой специфичностью и реагируют только с антигенами межклеточной субстанции (белков десмосомального аппарата, молекул адгезии) многослойного плоского эпителия (кожа, слизистая оболочка полости рта, пищевода и других органов) и относятся к IgG (рис. 1, a).

Рисунок 1. Определение циркулирующих аутоантител в сыворотке крови больных аутоиммунной пузырчаткой. Непрямой метод иммунофлюоресценции (×400). a, б — обработка сывороткой больной вульгарной пузырчаткой. Реакция в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса (a) и телец Гассаля (б): a — срез кожи практически здорового человека; б — срез тимуса ребенка.
Антитела не реагируют с антигенами тканей других органов, кроме антигенов межклеточной субстанции эпителия телец Гассаля тимуса человека и животных (см. рис. 1, б) [10].

При пузырчатке паранеопластического генеза наряду с антителами к межклеточной субстанции многослойного плоского эпителия и тельцам Гассаля выявляются «дополнительные» антитела, которые специфичны для антигенов многих видов тканей. Это антитела к антигенам миоидных клетока тимуса, изотропных дисков мускулатуры, гладкой мускулатуры капилляров миокарда, соединительнотканной структуры печени и ядер ее клеточных элементов [11].

Связанные с тканями Ig и иммунные комплексы, определяемые прямым методом иммунофлюоресценции, удается выявить в эпидермисе, как в период обострения, так и во время ремиссии при отсутствии высыпаний на коже и/или слизистых оболочках. При этом в случаях вульгарной и вегетирующей пузырчатки фиксированный Ig локализуется в межклеточных пространствах преимущественно базального и шиповатого слоев эпидермиса (рис. 2, a),

Рисунок 2. Криостатные срезы кожи больных аутоиммунной пузырчаткой. Участки клинически непораженной кожи. Обработка меченой сывороткой против IgG. Прямой метод иммунофлюоресценции (×400). a — срез кожи больной вульгарной пузырчаткой. Разрыв связи между клетками базального и шиповатого слоев. Реакция в межклеточной субстанции базального и шиповатого слоев; б — срез кожи больного себорейной пузырчаткой. Разрыв связей клеток между шиповатым и зернистым слоем. Реакция в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса с секвестрацией материала на поверхность кожи. Наиболее выраженная реакция в зернистом слое эпидермиса.
при листовидной и себорейной пузырчатке — в межклеточной субстанции шиповатого и преимущественно зернистого слоев эпидермиса (см. рис. 2, б), при паранеопластической пузырчатке фиксируется в межклеточной субстанции всех слоев эпидермиса [10].

Однако в ряде случаев, несмотря на наличие клинических проявлений заболевания, в тканях не удается выявить связанный Ig в характерной локализации. Это можно объяснить тем, что иммунные комплексы, формирующиеся в условиях избытка антигена или антител, способны растворяться в водной среде (рис. 3, a).

Рисунок 3. Криостатные срезы кожи больных вульгарной пузырчаткой. Участки клинически непораженной кожи. Обработка меченой сывороткой против IgG. Прямой метод иммунофлюоресценции (×400). a — классический прямой метод иммунофлюоресценции: фиксированный IgG в межклеточной субстанции эпидермиса не выявляется; б — модифицированный прямой метод иммунофлюоресценции: растворимые иммунные комплексы в межклеточной субстанции эпидермиса, выявленные после обработки срезов 40% этанолом.
В связи с этим был предложен модифицированный прямой метод иммунофлюоресценции (патент №209768, 27.11.97), при котором срезы обрабатывают водными смесями органических растворителей (этанола или диоксана) в концентрации 40—50% в течение 1—3 мин. При использовании водной смеси этанола или диоксана установлено, что такое мягко денатурирующее средство, как 40—60% водная смесь органических растворителей, стабилизирует связь между антителом и тканевым антигеном, препятствуя вымыванию антител из срезов. Это приводит к выявлению реакции в межклеточных пространствах в 100% случаев аутоиммунной пузырчатки (см. рис. 3, б) [5, 6].

Буллезный пемфигоид

Буллезный пемфигоид представляется наиболее частым буллезным дерматозом, аутоиммунное происхождение которого не вызывает сомнения. Об этом свидетельствуют наличие циркулирующих аутоантител, направленных против собственных антигенов, тканевое повреждение в месте фиксации иммунных комплексов, трансплацентарная передача аутоантител от матери, страдающей буллезным пемфигоидом, к новорожденному и наличие особых генетических участков, ответственных за развитие этой патологии [12].

Аутоантитела являются одной из причин разрушения базальной мембраны эпидермиса с последующим образованием подэпидермального пузыря [13]. Аутоантитела, циркулирующие в крови больных буллезным пемфигоидом, реагируют с компонентами базальной мембраны эпидермиса кожи человека и животных. Непрямым методом иммунофлюоресценции в сыворотке крови больных буллезным пемфигоидом обнаруживают IgG-аутоантитела к антигенам базальной мембраны эпидермиса (рис. 4, a),

Рисунок 4. Исследование материала больных буллезным пемфигоидом (×400). a — срез кожи донора здорового человека. Обработка сывороткой больного буллезным пемфигоидом. Непрямой метод иммунофлюоресценции. Реакция в зоне базальной мембраны эпидермиса (стрелка); б — срез кожи больного буллезным пемфигоидом. Обработка меченой сывороткой против IgG. Прямой метод прямой иммунофлюоресценции. Реакция в зоне базальной мембраны эпидермиса, на покрышке подэпидермального пузыря (стрелка).
а при отслоении эпидермиса от дермы — к антигенам эпидермальной части пузыря (см. рис. 4, б). Титр антител составляет разведения от 1:10 до 1:128. Корреляции между выявленным титром специфически реагирующих с антигенами базальной мембраной антител и интенсивностью клинических проявлений заболевания не обнаружено [14].

Для выявления фиксированных иммунных комплексов в тканях используется прямой метод иммунофлюоресценции. В криостатных срезах клинически интактных участков кожи больных буллезным пемфигоидом независимо от клинических форм его проявления выявляют фиксацию IgG в зоне базальной мембраны эпидермиса, а в месте формирования пузыря — на его покрышке (lamina lucida), что является диагностическим признаком буллезного пемфигоида (рис. 5, б).

Рисунок 5. Материалы больных приобретенным буллезным эпидермолизом (×400). a — криостатный срез кожи донора здорового человека, обработанный сывороткой больной приобретенным буллезным эпидермолизом. Непрямой метод иммунофлюоресценции. Фиксация IgG в зоне базальной мембраны эпидермиса, в месте обычного для заболевания отслоения эпидермиса от дермы; б — криостатный срез кожи больного приобретенным буллезным эпидермолизом. Прямой метод иммунофлюоресценции. Характерная фиксация IgG на дне (стрелка) подэпидермального пузыря (lamina densa).
В той же локализации в ряде случаев можно наблюдать и фиксацию иммуноглобулинов других классов и ранних компонентов комплемента [10, 15].

Приобретенный буллезный эпидермолиз

Приобретенный буллезный эпидермолиз — редкое аутоиммунное заболевание кожи и слизистых оболочек, в основе клинической диагностики которого лежит возникновение спонтанных или травмоиндуцированных пузырей в зрелом возрасте больного с отсутствием семейной предрасположенности [16]. Нередко заболевание протекает атипично, имитируя другие буллезные дерматозы, такие как буллезный пемфигоид, рубцующийся пемфигоид или линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз.

Одним из основных патогенетических факторов, способствующих расщеплению дермо-эпидермального соединения и образованию подэпидермального пузыря, являются аутоантитела к одному из компонентов базальной мембраны эпидермиса, в частности к коллагену VII типа. Антитела не являются специфичными только для антигенов базальной мембраны эпидермиса человека и животных, они также взаимодействуют с антигенами базальных мембран слизистой оболочки полости рта, пищевода, влагалища [17].

Большинство аутоантител в сыворотке крови пациентов относятся как к комплементактивируемым, так и комплементнеактивируемым субклассам IgG (см. рис. 5, a). При этом факт присутствия или отсутствия комплементактивирующих аутоантител субклассов IgG в крови, титр которых может достигать 1:640, не коррелирует с клиническими формами заболевания. Участие системы комплемента приводит к более выраженным клиническим проявлениям воспалительного приобретенного буллезного эпидермолиза, который клинически сходен с буллезным пемфигоидом и рубцующимся пемфигоидом. В некоторых случаях патогенетическая роль при указанной патологии принадлежит циркулирующим аутоантителам IgA или одновременно IgA и IgG. С помощью непрямого метода иммунофлюоресценции в сыворотке крови больных выявляют антитела IgG и/или IgA к антигенам базальной мембраны эпидермиса — к антигенам lamina densa [16, 17].

В ходе иммуноморфологического исследования биоптатов кожи больных приобретенным буллезным эпидермолизом первоначально были выявлены отложения IgG в зоне базальной мембраны эпидермиса, сходные с таковыми при буллезном пемфигоиде. Прямым методом иммунофлюоресценции в криостатных срезах клинически непораженных участков кожи больных приобретенным буллезным эпидермолизом отмечается выраженная фиксация IgG в виде линейных отложений в зоне базальной мембраны эпидермиса, а в месте формирования пузыря — на его дне (lamina densa), что является диагностическим признаком данного буллезного дерматоза (см. рис. 5, б). В той же локализации могут быть обнаружены IgA, IgM, С3-компонент комплемента, но с меньшей интенсивностью реакции [10, 17, 18].

Герпетиформный дерматит Дюринга

Герпетиформный дерматит Дюринга, сопровождающийся глютенчувствительной энтеропатией, встречается редко и характеризуется наличием подэпидермальных пузырей, индуцированных отложениями мелких гранул иммунных комплексов в сосочковом слое верхних отделов дермы, иногда под самой базальной мембраной эпидермиса. При этом базальная мембрана эпидермиса не вовлечена в патологический процесс, что является одним из дифференциально-диагностических признаков при сравнении с другими аутоиммунными буллезными дерматозами дермо-эпидермального соединения (буллезный пемфигоид, приобретенный буллезный эпидермолиз и линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз) [19].

Дифференциальная диагностика герпетиформного дерматита Дюринга важна в силу особого ведения и лечения пациента — применением безглютеновой диеты и назначением препаратов сульфонового ряда, благоприятно влияющих на состояние слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и в результате сглаживающих клинические проявления болезни [19].

Таким образом, при обработке срезов кожи больных герпетиформным дерматитом Дюринга меченой сывороткой против основных классов Ig отмечается типичная иммуноморфологическая картина гранулярных отложений, содержащих иммуноглобулин класса А, в верхних отделах дермы, иногда тесно прилегающих к эпидермису. Они либо заполняют территорию сосочков дермы или располагаются под базальной мембраной эпидермиса (рис. 6, а) [6, 10, 19].

Рисунок 6. Иммуногистохимическое исследование материала больных буллезными дерматозами (×400). a — криостатный срез клинически интактного участка кожи больной герпетиформным дерматитом Дюринга, обработанный меченой сывороткой против IgА. Прямой метод иммунофлюоресценции. Гранулы иммунных комплексов в сосочковом слое дермы (стрелка) под базальной мембраной эпидермиса; б, в — материалы больной линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом: б — криостатный срез кожи здорового человека (донора), обработанный сывороткой больной. Непрямой метод иммунофлюоресценции. Реакция в зоне базальной мембраны эпидермиса; в — криостатный срез кожи больной линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом. Прямой метод иммунофлюоресценции. Фиксация IgA строго в зоне базальной мембраны эпидермиса и на покрышке подэпидермального микропузыря (стрелка).

Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз

Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз является гетерогенной группой везикуло-буллезных заболеваний кожи и слизистых оболочек. Данный диагноз в настоящее время устанавливается только на основании данных иммунологических и иммуноморфологических исследований [20].

Основной патогенетический фактор, способствующий развитию линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза, являются аутоантитела, которые направлены к компонентам базальной мембраны эпидермиса (коллаген VII и XVII типов) и относятся к IgА (см. рис. 6, б). Титр антител в сыворотке крови cоставляет 1:20–1:80 [21, 22].

При иммуногистохимическом исследовании кожи с ее интактных участков выявляют фиксацию IgA в виде линейных отложений строго в зоне базальной мембраны, а в месте формирования подэпидермального пузыря — на его покрышке и/или дне (см. рис. 6, в). В той же локализации одновременно у некоторых больных могут быть обнаружены IgG, IgM и С3-компонент комплемента, но при меньшей степени выраженности иммуногистохимической реакции [22].

Необходимо отличать линейную фиксацию IgА в зоне базальной мембраны при этом заболевании от гранулярных отложений IgА у больных герпетиформным дерматитом Дюринга (см. рис. 6, в). Это два разных явления. Линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз наблюдают, как правило, у больных при отсутствии глютенчувствительной энтеропатии, характерной для больных герпетиформным дерматитом Дюринга. Кроме того, при линейном IgA-зависимом буллезном дерматозе фиксация антител происходит строго в зоне базальной мембраны эпидермиса.

Заключение

Таким образом, включение метода с использованием меченых антител (в частности иммунофлюоресцентного), в практику врача-дерматовенеролога позволяет с учетом данных клинических и иммунологических исследований поставить точный диагноз аутоиммунного буллезного дерматоза. Данный метод также предоставляет возможность провести дифференциальную диагностику среди отдельных форм определенного заболевания или группы заболеваний. Не менее важным являются обнаружение и учет «дополнительных» антител или иммунных комплексов, участие которых в роли патогенетических факторов может изменить и усложнить картину течения болезни, как, например, при паранеопластической пузырчатке. Правильно и своевременно установленный диагноз способствует назначению адекватных схем лечения и уменьшению риска развития осложнений.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.