Изменение функциональной активности волосяных фолликулов и нарушение цикла их развития может привести к выпадению волос (алопеции). Однако вопрос о существовании прямой связи между функциональной активностью волосяных фолликулов и качеством формируемого ими волоса практически не изучен.

Стержень волоса на 80% состоит из белков (кератинов). Высокомолекулярные кератины (так называемые тяжелые, молекулярная масса которых превышает 20 кД) обладают низкой растворимостью и образуют фибриллы, находящиеся в слое кортекса. Они окружены матриксом, состоящим из легких низкомолекулярных кератинов с молекулярной массой 6—20 кД. Легкие кератины растворимы в воде и при повреждении кутикулы волоса или при ослаблении связей с другими белками кортекса могут вымываться из стержня волоса. Показано, что вымывание белков усиливается при повреждении кутикулы в результате отбеливания и химической завивки [1, 2]. В свою очередь повреждение кутикулы может открывать внешним воздействиям более глубокие слои стержня волоса, что ведет к дальнейшему ослаблению связей между белками кортекса [3].

Это означает, что усиление процесса вымывания белков из волоса может отражать не только внешние повреждения, затрагивающие кутикулу, но и изменение структуры кортекса, прежде всего увеличение содержания слабосвязанных белков [1]. Такие слабосвязанные белки постепенно вымываются из стержня волоса, а при механической гомогенизации волоса в водной среде переходят в раствор (растворимые белки).

Остается неизвестным, зависит ли увеличение содержания слабосвязанных белков только от внешних воздействий или может быть следствием нарушения функциональной активности волосяных фолликулов при алопеции.

Цель работы — оценка количества слабосвязанных белков волос пациентов с андрогензависимой алопецией (АГА) и телогеновым выпадением (ТВ) волос. В работе оценивали скорость вымывания белков из стержня волоса в стандартных условиях. Результаты сопоставляли с данными для здоровых добровольцев. Затем волосы подвергали механической дезинтеграции в водной среде и оценивали содержание растворимых белков. Материал для исследований (волосы) брали с теменной и затылочной зоны волосистой части головы.

Измерение поглощения света проводили на спектрофотометре Shimadzu UV-1700, флюоресценцию проб измеряли на спектрофлюориметре Hitachi F 4000.

Использовали следующие реактивы: бычий сывороточный альбумин (БСА; «Sigma»), кератин из эпидермиса человека («Sigma»), L-триптофан («Calbiochem»), карбонатный буферный раствор 0,1 М, рН 10,2.

Объектом исследований служили волосы пациентов с АГА (20 человек, из них 2 мужчины; возраст 35±10 лет) и ТВ (46 человек, из них 3 мужчины; возраст 33±9 лет), а также здоровых добровольцев (ЗД) — лиц без трихологической патологии (30 человек, из них 5 мужчин; возраст 26±12 лет).

Волосы извлекали с помощью пинцета из зоны темени и затылка. Материал помещали в отдельные герметичные пластиковые пакеты и хранили при 8 °С.

Вымывание белка проводили следующим образом: фрагменты волос длиной около 10 мм взвешивали и помещали в карбонатный буферный раствор (0,1 М, рН 10,2) так, чтобы соотношение массы волос и буферного раствора составляло 1:250. Инкубировали пробы при комнатной температуре в течение 30 мин при постоянном мягком встряхивании. Отбирали жидкость и осаждали механические примеси центрифугированием при 900 об/мин в течение 15 мин. Полученные пробы вымываемого белка использовали для измерений.

Анализ динамики вымывания белков (рис. 1)

После получения вымываемого белка волосы помещали в ручной гомогенизатор Поттера и растирали до получения однородной суспензии в буферном растворе. Нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием (900 об/мин, 30 мин). Отбирали прозрачный супернатант, содержащий растворимые белки.

Для оценки белка волос были опробованы три метода: биуретовый, Лоури и поглощение света в ультрафиолетовой части спектра.

Результаты пересчитывали на белковый эквивалент, используя в качестве стандарта БСА, и нормировали на вес пробы волос (мг белка/г волос).

Оценку белков в реакции с биуретовым реактивом проводили с использованием набора реактивов RANDOX (Великобритания), для метода Лоури применяли реактивы компании «Sigma». Биуретовый метод был принят в качестве референтного, поскольку его результаты почти не зависят от специфики исследуемого белка. Этот метод с успехом применялся при работе с большим количеством материала (20 мг в 1 мл буферной среды) [2].

Метод Лоури [4] также применялся для исследования вымываемых белков [3], однако и в этом случае вносили 10—15 мг волос в 1 мл водной среды.

В нашей работе при использовании метода Лоури получены значительно заниженные результаты по сравнению с биуретовым методом. Причина, по-видимому, заключается в том, что фенольный реактив Фолина реагирует с ароматическими аминокислотами белка, особенно с тирозином, а, по нашим данным, в экстрактах волос молярная доля тирозина мала.

Предложенный нами третий метод — поглощение света в области 240 нм — оказался чувствительнее к белку волос, чем биуретовый метод, и позволил проводить измерения в диапазоне 1—2 мг волос в 1 мл. Полученные нами спектры поглощения вымываемого белка (рис. 2),

Для того чтобы избежать резких колебаний за счет случайных смещений пика поглощения, в дальнейшем измеряли поглощение при длине волны 240 нм.

При измерении растворимого белка волос ЗД биуретовым методом концентрация белка составила 9 мг/г волоса, метод Лоури — 0,9 мг/г, а по поглощению света — 10 мг/г, т.е. практически как при применении биуретового реактива.

Несмотря на обнаруженные расхождения между методом оценки белка по поглощению при длине волны 240 нм и методом Лоури, мы выявили линейную зависимость между данными обоих методов при анализе растворимого белка волос ЗД (рис. 3).

Для оценки флюоресценции вымываемого белка пробу помещали в кювету с сечением 1×1 см и регистрировали спектр флюоресценции при длине волны возбуждения 290 нм.

Флюоресценция — чувствительный метод анализа белков, широко используемый при изучении внешних воздействий, прежде всего — ультрафиолетового излучения [5].

Результаты анализа спектров собственной флюоресценции вымываемых белков волоса и сопоставление их со спектрами кератина и триптофана (рис. 4)

Для оценки количества слабосвязанных белков нами был использован метод оценки поглощения света при длине волны 240 нм. Данные для пациентов и ЗД получены этим методом.

Статистическая обработка результатов. Для обработки результатов использовали программу Statistica 6.0. Независимые выборки (межгрупповые сравнения) сравнивали по критерию Манна—Уитни, а для связанных переменных (сравнение между зонами скальпа) использовали критерий Уилкоксона. Достоверными считали различия при р<0,05.

Задачей нашего исследования была оценка количества слабосвязанных белков, т.е. белков, вымываемых буферным раствором из стержня волоса за 30 мин (рис. 5, I)

Такая схема анализа позволила сравнивать скорость вымывания белка между группами и зонами волосистой части головы в каждой группе (см. таблицу).

Обнаруженные различия можно было соотнести с количеством растворимого белка волоса, получаемого при его механическом разрушении.

Наибольшая скорость вымывания белка обнаружена у пациентов с АГА. В зоне темени значение данного показателя у этих пациентов достоверно отличалось от такового ЗД (p<0,01) и было больше, чем в зоне затылка у этих же пациентов (p<0,02).

Поскольку скорость вымывания белка может быть следствием изменения белкового профиля в кортексе волоса, согласно выбранной схеме анализа (см. рис. 4) измеряли количество растворимого белка после разрушения волоса.

Содержание растворимого белка в волосах, полученных с зоны темени, было выше, чем у ЗД (p<0,01) и в зоне затылка (p<0,05). Этот результат подтвердил закономерности, полученные при анализе скорости вымывания белка.

В целом увеличение скорости вымывания белка в зоне темени по сравнению с зоной затылка отмечалось у 70% с АГА, в 55% случаев значения показателя были выше верхней границы значений, полученных для ЗД. В зоне затылка обнаружилось увеличение количества слабосвязанных белков по сравнению с нормой, но оно выявлялось только после разрушения волос (растворимый белок, p<0,05).

У пациентов с ТВ скорость вымывания белка превышала таковую у ЗД здоровых добровольцев преимущественно в зоне затылка (p<0,01), однако количество растворимого белка не отличалось от показателей, полученных у ЗД. Более того, содержание растворимого белка в волосах из зоны темени у этих пациентов было достоверно выше, чем в зоне затылка (p<0,05).

У ЗД достоверных различий между зонами ни при анализе скорости вымывания белка, ни при оценке растворимого белка не выявлено.

Механизмы выпадения волос при АГА и ТВ различаются. Общим является сокращение продолжительности цикла анагена у значительного количества волос с преждевременным наступлением стадии катагена и последующей стадии телогена. ТВ свойственно диффузное поредение, тогда как при андрогенетическом выпадении страдает андрогензависимая область скальпа — лоб, темя. Кроме того, причины ТВ могут быть разной природы (диета, стресс, реакция на лекарственные препараты), что обусловливает значительный разброс данных, поскольку перечисленные факторы по-разному влияют на содержание слабосвязанных белков в стержне волоса.

По-видимому, при АГА механизм, связывающий процессы регуляции жизни фолликула и синтеза белка, является общим для большинства пациентов, что позволило выявить достоверные различия по сравнению с ЗД, а также между зоной облысения (темя) и нормального роста (затылок) при анализе слабосвязанных белков.

Полученные результаты позволяют сформулировать следующие положения.

В стержне волос имеются растворимые белки, слабо связанные между собой и механическим каркасом стержня.

Чувствительным и достаточно простым методом оценки количества растворимых (слабосвязанных) белков волос может служить анализ белка по поглощению света при длине волны 240 нм.

Среднее содержание слабосвязанных растворимых белков у ЗД оценено как 18±2 мг на 1 г волос. Различий в показателях для затылочной и теменной областями головы не отмечено.

У пациентов с АГА по сравнению со ЗД наблюдается значительно (примерно в 2 раза) повышенный выход слабосвязанных белков в волосах зоны темени. Это увеличение регистрируется как при измерении скорости вымывания белков из волоса, так и при оценке количества растворимых белков после дезинтеграции волоса.

У пациентов с АГА наблюдается достоверное увеличение содержания слабосвязанных белков в волосах зоны темени по сравнению с волосами зоны затылка. Это различие обнаруживается как при измерении скорости вымывания белков, так и при оценке количества растворимых белков после дезинтеграции волоса.

У пациентов с ТВ волос обнаружено увеличение скорости вымывания белков в зоне затылка по сравнению со ЗД. При этом повышения содержания растворимых белков, измеренного после разрушения волоса, не наблюдалось.

При сравнении показателей между пациентами с АГА и ТВ по зонам волосистой части головы показано, что содержание слабосвязанных белков у пациентов с АГА в зоне темени было достоверно выше, чем у пациентов с ТВ. Это справедливо и в отношении скорости вымывания белков, и в отношении общего количества растворимых белков.

Оценка слабосвязанных белков волоса (скорости вымывания белков и общего количества растворимых белков) может быть полезным инструментом при анализе состояния волос пациентов с алопецией и для мониторинга лечения. Полученные результаты указывают на целесообразность использования при алопеции средств, укрепляющих стержень волоса.