Среди наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (ИППП), урогенитальный трихомониаз (трихомоноз) занимает особое место. Это обусловлено рядом обстоятельств и прежде всего тем, что трихомониаз — не инфекция в современном понимании этого термина, а протозойная инвазия, что, как правило, не учитывается при постановке диагноза и ведении пациентов.

По данным ВОЗ [1], в мире ежегодно регистрируется около 160 млн случаев трихомонадной инфекции, при этом частота бессимптомных форм составляет 50%. По данным отчетности №9 «Сведения о заболеваниях, передаваемых преимущественно половым путем, грибковых, кожных заболеваниях и чесотке» за 1994—2004 гг., в России лидирующее место в заболеваемости ИППП занимал трихомониаз. В 1996 г. на 100 тыс. населения зарегистрировано 339 случаев заболевания трихомониазом; в 2005 г. — 215,5, в 2006 г. — 199,5 случаев.

Осложнением трихомонадной инфекции являются преждевременные роды, низкий вес и увеличение смертности новорожденных, предрасположенность к ВИЧ и СПИД, рак шейки матки и предстательной железы [2, 3].

Несмотря на многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов, позволившие понять структурно-функциональные характеристики Trichomonas vaginalis, особенности ее взаимодействия с клетками, вовлеченными в патологический процесс, а также создать комплекс клинико-лабораторного обследования и ведения больных, трихомониаз остается сложной медико-социальной и биологической проблемой. Связано это с высоким уровнем заболеваемости, патогномоничностью течения и наличием значительного количества сочетанных (смешанных, вялотекущих и малосимптомных форм инфекций урогенитального тракта), продолжительностью обследования и разночтением результатов исследований при постановке диагноза, определенными трудностями при терапевтических воздействиях [4].

В лабораторной диагностике трихомониаза используются регламентированные (микроскопическое и культуральное исследование) и нерегламентированные (ПЦР-анализ, ДНК (РНК)-диагностика, серологические исследования) методы.

Микроскопические методы наиболее распространены в практическом здравоохранении, как простые, доступные, быстрые и дешевые. Однако они не обладают высокой эффективностью, сложны в интерпретации результатов, особенно при выявлении нетипичных форм трихомонад.

В течение последних 10—15 лет у пациентов с мочеполовым трихомониазом увеличилась частота выявления метаболически малоактивных особей паразита, лишенных органоидов движения (блефаропласта, жгутиков и ундулирующей мембраны) [5]. «Своеобразные» малоподвижные клетки в нативных препаратах отличаются в окрашенных мазках от «классических» трихомонад [6]. Они имеют, как правило, округлую форму и исчезают после специфической терапии. Относительно способов их размножения мнения авторов разделились: одним удалось получить живые типичные культуры при посеве «круглых» форм, другим — нет. Это позволило предположить, что «атипичные» формы трихомонад являются отмершими клетками или особями, вступившими в шизогонию, т.е. множественное деление. Именно такая неопределенность морфологии позволила ряду авторов приписывать мифические свойства трихомонадам, отводя им ведущую роль в этиологии и патогенезе остеомиелита, ишемической болезни сердца, атеросклероза, канцерогенеза и др. [7, 8].

Сложности световой микроскопии, связанные с обнаружением нетипичных форм трихомонад, обусловлены непониманием между врачами клинической лабораторной диагностики и клиницистами: с одной стороны, врач клинической лабораторной диагностики ограничен в своих действиях регламентирующими документами, предписывающими диагностику заболевания только по «классическим» формам простейших, с другой — понятен вопрос клинициста при получении ответа об обнаружении в препарате форм простейших, морфологически сходных с трихомонадами. Предстоит выяснить, действительно ли существуют безжгутиковые неподвижные формы или это результат манипуляций в процессе приготовления препарата.

Несмотря на относительно малые размеры, T. vaginalis имеет весьма сложные морфологию и метаболизм. Трихомонада обладает выраженной модификационной изменчивостью и потенциально высокими адаптационными возможностями. Фенотип клетки меняется в зависимости от физико-химических условий среды и фазы роста [9, 10].

Цель исследования — изучение с помощью трансмиссионной электронной микроскопии адаптационной изменчивости T. vaginalis под влиянием мутагена (нитрозогуанидина).

Исследовали отделяемое разных отделов урогенитального тракта (уретры — у мужчин; уретры, цервикального канала и влагалища — у женщин) 25 больных урогенитальным трихомониазом, подтвержденным клинически и регламентированными (световая микроскопия, культуральное исследование) методами лабораторной диагностики. Материал для исследования забирали стерильными одноразовыми дакроновыми зондами или одноразовыми стерильными ложечками Фолькмана с глубины 3—5 см. Проводили посев полученного материала на питательную среду для культивирования трихомонад (НПО «Питательные среды», Махачкала). Микроскопический контроль посевов осуществляли через 1 сут, а затем ежедневно. При появлении осадка на дне пробирок его помещали на предварительно подогретое предметное стекло в каплю теплого (37 °С) стерильного 0,9% раствора NaCl, закрывали покровным стеклом и микроскопировали при опущенном конденсоре (окуляр 10, объектив 40, увеличение 400). Использовали микроскоп проходящего и отраженного света для медико-биологических исследований «Axio Imager» (Германия).

Урогенитальные трихомонады определяли по характерным толчкообразным движениям тела простейшего, непрерывным движениям жгутиков на головном конце и ундулирующей мембраны, расположенной на боковой части тела.

Для исследования ультраструктуры влагалищных трихомонад использовали метод ультратонких срезов. Осадок культуры трихомонад переносили в центрифужную пробирку, содержавшую 2,5% забуференный 0,1 М какодилатным буфером (рН 7,2—7,4) глутаральдегид и помещали на 1—2 ч в холодильник при 4 °С. Затем осадок промывали 0,25 М раствором сахарозы и фиксировали OsO₄. После обезвоживания в спиртах восходящей концентрации (50, 70, 96 и 100%) в течение 1 ч и оксида пропилена или ацетона (30 мин), материал заключали в эпоксидные смолы: эпон-аралдит и спурр. Для пропитки использовали оксида пропилена и смолу в соотношениях 2:1, 1:1 и 1:2. Полимеризацию несколько часов проводили при 37 °С, затем при 49 и 60 °С до готовности (полное затвердевание капсулы). Срезы готовили на ультрамикротоме «Reichert-Jung» (Австрия). Для этого материал наносили на медную сетку, покрытую пленкой из формвар, контрастировали насыщенным водным раствором урацилацетата и гидрооксидом свинца. Препараты изучали с помощью просвечивающей (трансмиссионной) микроскопии (электронный микроскоп JEM-100M).

Для исследования фенотипической изменчивости трихомонад использовали химический раздражитель — мутаген нитрозогуанидин, широко применяемый для индукции мутаций у микроорганизмов. Рабочую концентрацию мутагена получали путем его разведения ацетатным буфером (рН 7,4) или питательной средой для выращивания трихомонад. К суточной культуре простейших добавляли мутаген в дозе 500 мкг/мл. Продолжительность воздействия составляла 15 и 30 мин. Для остановки действия мутагена опытные образцы 3 раза отмывали буфером или питательной средой соответственно. Микроскопию нативных препаратов осуществляли по описанной методике. Оставшуюся культуру трихомонад хранили в термостате при 37 °С в течение 12 сут, ежедневно микроскопируя осадок.

При исследовании в электронном микроскопе контрольной культуры трихомонад выявлены разные морфотипы простейших — грушевидной, амебовидной и округлой формы. Поверхность клеток ровная (рис. 1).

Двигательный аппарат простейших представлен жгутиками (4 передних и 1 возвратный; рис. 2),

Жгутики у места прикрепления образуют Г-образный изгиб и заканчиваются электронно-плотным цилиндрическим образованием — блефаропластом (кинетосомой). Блефаропласт рассматривается как регулятор двигательного аппарата трихомонад.

От блефаропласта тянется коста — исчерченный фибриллярный тяж. По своему строению коста похожа на коллагеновые волокна. Функцию косты связывают с движением. Она располагается у основания возвратного жгутика и поддерживает ундулирующую мембрану.

Иногда в препаратах видна ундулирующая мембрана в виде удлиненной трубчатой, волнистой складки (парус) с круглым концом, длина ее различна. По периферии мембрана покрыта трехслойной плазматической пелликулой. В формировании основания ундулирующей мембраны участвуют перипласт и цитоплазма. В ней содержатся пузырьки, иногда лизосомы, что указывает на участие ундулирующей мембраны вместе со жгутиками в захватывании пищевых частиц [11]. В цитоплазме трихомонад чаще у основания ундулирующей мембраны встречаются «решетчатые» структуры.

Опорным аппаратом простейшего является аксостиль — осевой стержень, сократимый тяж, проходящий через центральную ось клетки, начинающийся от зоны блефаропласта. Он тянется вдоль простейшего и заканчивается выступающим наружу небольшим заостренным шипиком. Аксостиль полый. Стенки его имеют вид продольных параллельных трубочек. В средней части аксостиль шире, вверху и внизу уже. На поперечном срезе видны два ряда микротрубочек с зернистостью во внутреннем кольце. Цитоплазма аксостиля богата рибосомами и цистернами эндоплазматического ретикулума.

В нем находятся включения гликогена. С помощью аксостиля (шип) трихомонада прикрепляется к поверхности эпителиальной клетки и повреждает ее.

Передний конец аксостиля огибает под углом зону блефаропласта, образуя дополнительный листок — серповидную ленту микротрубочек (пельту).

Тело трихомонады, включая жгутики, ундулирующую мембрану и аксостиль, покрыто осмиофильной мембраной — перипластом. Цитоплазма зернистая, содержит рибосомы, полирибосомы, розетки гликогена. В передней трети клетки находится ядро удлиненной формы. Хроматин в ядре рассеян диффузно. Наружный листок оболочки ядра покрыт рибосомами. Около ядра наблюдаются конгломераты микрогранул.

Комплекс Гольджи расположен около ядра и представлен трубчатыми и полыми круглыми или мешотчатыми образованиями. Аппарат Гольджи участвует в образовании лизосом и накоплении продуктов, вырабатывающихся в эндоплазматическом ретикулуме.

От переднего конца с боковой поверхности жгутиков и немного отступя от ядра тянется вниз парабазальный аппарат. Он полукругом огибает ядро и, дойдя до его конца, поднимается вверх. Парабазальный аппарат представляет систему трубок, расположенных в несколько рядов. Предполагается, что в парабазальном аппарате находятся гранулы, содержащие нуклеиновые кислоты. Парабазальный аппарат принимает участие в белковом обмене.

Цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума огибают ядро на расстоянии от оболочки и разветвляются в цитоплазму.

Рибосомы многочисленны, расположены равномерно в цитоплазме клетки: в области ядра, эндоплазматического ретикулума, вблизи парабазального аппарата, базальных тел жгутиков, аксостиля и разных включений.

Влагалищная трихомонада не имеет митохондрий. Их функции выполняют гидрогеносомы (см. рис. 1 и рис. 3).

В цитоплазме расположены многочисленные, электронно-прозрачные, округлые пищеварительные вакуоли разной величины. Некоторые из них содержат коллоидное содержимое (см. рис. 1).

Под влиянием мутагена изменяется ультраструктура влагалищных трихомонад. Простейшие сохраняют прежнее строение и набор микроструктур, однако отмечены их количественные и качественные изменения.

В условиях эксперимента наблюдается объединение трихомонад в колонии (рис. 5).

Рибосомы, расположенные равномерно в цитоплазме клетки контрольных образцов, под влиянием мутагена собираются в полисомы (рис. 9).

Особенно выражены изменения со стороны гидрогеносом. В цитоплазме простейших, подвергшихся действию мутагена, наблюдается много мелких гидрогеносом. В некоторых из них сохраняется гомогенная структура. Большинство гидрогеносом приобретает плотный сегрегированный матрикс (рис. 10, 11).

Помимо крупных и мелких, наблюдаются гигантские вакуоли (см. рис. 6). Вблизи вакуолей и на границе контактов с эпителиальными клетками располагаются крупные розетки гликогена.

Таким образом, в контрольных и опытных образцах наблюдались гетерогенные формы трихомонад. При этом сохранялась нормальная морфологическая организация простейших. Мутаген не изменяет морфологическое строение T. vaginalis, а вызывает лишь количественные и качественные изменения их микроструктур. Особенно это касается органелл, являющихся у трихомонад аналогами митохондрий. Гидрогеносомы лишены ДНК и цитохромов, необходимых для осуществления окислительного фосфорилирования [12].

Влагалищные трихомонады получают питательные вещества через клеточную мембрану (пиноцитоз) и путем фагоцитоза. Волнистая мембрана помогает в этом процессе.

Под влиянием мутагена наблюдается образование множественных контактов простейших между собой и с поверхностью эпителиальных клеток. Плазматическая мембрана и кортикальный слой цитоплазмы формируют псевдоподии, пластинчатые выросты, окружают предмет фагоцитоза — образуется инвагинация, и объект фагоцитоза вместе с плазматической мембраной погружается в цитоплазму. В дальнейшем образуется фагосома.

Содержимое фагосом может быть переварено за счет ферментов, имеющихся в плазматической мембране и вливающихся в фагосому лизосом. Образование лизосом связано с деятельностью аппарата Гольджи и эндоплазматического ретикулума. Основная их функция — участие во внутриклеточном пищеварении. Непереваренные частицы выбрасываются из клетки путем экзоцитоза.

По своему метаболизму T. vaginalis очень напоминают анаэробные бактерии. Их энергетическая потребность поддерживается за счет ферментов с помощью гликолиза. Глюкоза превращается в фосфоенолпируват, а затем в двойных мембранах гидрогеносом в пируват с дальнейшим преобразованием пирувата в малат и ацетат водорода [13]. Водород является побочным продуктом гидрогеносом.

Гликолиз — сложный ферментативный процесс последовательных превращений глюкозы, протекающий без участия кислорода, конечным продуктом которого является молочная кислота. В процессе гликолиза образуется аденозинтрифосфат (АТФ). В анаэробных условиях гликолиз является единственным процессом, поставляющим энергию. Биологическое значение гликолиза прежде всего заключается в образовании богатых энергией фосфорных соединений, энергетическая эффективность в анаэробных условиях составляет две молекулы АТФ на одну молекулу глюкозы. В процессе расщепления глюкозы образуется 210 кДж свободной энергии: около 126 кДж рассеивается в виде тепла, а 84 кДж (максимально) накапливается в виде богатых энергий фосфатных связей.

Реакцией простейших на стресс (мутаген) является ускорение движения жгутиков и ундулирующей мембраны [14], усиленное поглощение питательных частиц с образованием множества фагосом. Трихомонады захватывают пищевые частицы, клетки крови (лейкоциты, эритроциты), бактерии путем фагоцитоза.

Простейшее адаптирует метаболизм в соответствии с доступными источниками углерода. Половину своих углеродов трихомонада использует для поддержания внутреннего гомеостаза. Это важно, поскольку среда влагалища постоянно изменяется (рН, уровень гормонов и питательных веществ). Для экономного роста и выживания трихомонада может использовать метаболизм аминокислот [15].

Под влиянием мутагена гидрогеносомы группируются вблизи структур, связанных с движением, активным метаболизмом (жгутиков, ундулирующей мембраны, вакуолей, фагосом) и требующих в процессе своей жизнедеятельности активных затрат энергии. Роль возвратного жгутика, по мнению K. Ryan и соавт. [15], неизвестна. Предполагается, что он способствует направлению движения трихомонады. Обнаруженная нами локализация гидрогеносом у основания возвратного жгутика является косвенным подтверждением активной роли этой структуры в обеспечении движения, требующего усиленного обеспечения энергией.

Ундулирующая мембрана помогает движению частиц к цитосоме, обеспечивает подвижность простейшего, колебательные движения окружающей среды и активное передвижение в ней питательных частиц.

Полиморфизм трихомонад наблюдался как в контрольных, так и в опытных образцах. Их биологическое значение окончательно не определено, хотя появление амебовидных форм простейших обусловлено их контактами с эпителиальными клетками и усиленным питанием с образованием фагосом. Установлено, что при неблагоприятных условиях трихомонада может округляться и прятать жгутики [15].

Таким образом, под влиянием мутагена нитрозогуанидина морфологическая организация простейших не меняется. Как в контроле, так и в опыте наблюдаются гетерогенные формы трихомонад. По-видимому, форма существования простейших связана с изменением условий внешней среды и обусловлена выраженной модификационной изменчивостью и потенциально высокими адаптационными возможностями трихомонад. Под влиянием мутагена изменяется метаболическая активность простейших. Выявленные изменения гидрогеносом являются, по-видимому, результатом их повреждения.

В этих условиях активация подвижности, пино- и фагоцитоза, увеличение количества контактов простейших друг с другом и с эпителиальными клетками являются защитными реакциями трихомонад в условиях стресса (воздействие мутагена), направленными на энергетическое обеспечение процессов в клетке.