Распространение сифилитической инфекции в мире остается серьезной проблемой для здравоохранения, так как в соответствии с прогнозами число случаев заражения сифилисом будет составлять до 12 млн человек в год [1].
Снижение в Российской Федерации заболеваемости сифилисом в последние 10 лет характеризуется одновременным увеличением удельного веса ранних скрытых и поздних его форм, увеличением числа случаев врожденного сифилиса [2, 3]. Это связано с тем, что в настоящее время в области сифидологии не решен целый ряд проблем, обусловленных недостаточными знаниями иммунобиологических свойств возбудителя сифилиса Treponema pallidum. К числу таких проблем в первую очередь следует отнести возникновение высокой частоты развития серорезистентности, отсутствие достоверного контроля качества лечения сифилиса, недостаточность знаний о патогенезе образования и сохранения в организме невегетативных форм жизни T. pallidum и др.
Ведущим в диагностике различных форм сифилиса остается серологический метод исследования для определения в сыворотке крови больных специфических — антитрепонемных антител (АТАт) и неспецифических — антикардиолипиновых антител (АКАт). Наличие в организме АКАт при сифилитической инфекции свидетельствует об активности сифилитического процесса, а в отсутствие заболевания — о наличии антифосфолипидного синдрома [4].
Поскольку сифилис относится к антропонозной инфекции, то для изучения заболевания на модели широко используются кролики с экспериментальным сифилисом [1, 5, 6].
Сравнительное изучение патогенных бледных трепонем (ПБТ) и культуральных бледных трепонем (КБТ), утративших в процессе культивирования патогенные свойства, позволило выявить у них общие специфические протеиновые антигенные детерминанты и использовать эти детерминанты КБТ при конструировании эффективных диагностических тестов на сифилис [7, 8].
Достоверно установлено, что введение КСТ, содержащих специфические трепонемные и общие с другими микроорганизмами антигены, в организм кроликов с экспериментальным сифилисом приводит к увеличению в их сыворотках крови как АТАт, так и АКАт. Это послужило основой для получения высокотитражных кроличьих контрольных положительных сывороток для РСК на сифилис [9].
Целью настоящих исследований является изучение особенностей влияния протеинов клеточных структур КБТ, очищенных от общих групповых неспецифических протеиновых антигенов, на течение экспериментальной сифилитической инфекции кроликов в динамике вплоть до полной негативации специфических и неспецифических серологических реакций на сифилис с их сыворотками крови.
Материал и методы
Клеточные структуры (КСТ) выделяли из биомассы КБТ 5 штаммов (V, VII, VIII, IX и Reiter, принадлежащих к различным иммунологическим группам) в соответствии с известными методиками выращивания КБТ и получения КСТ [8]. Освобождение суммарных протеинов КСТ от общих групповых антигенов проводили методом их аффинной очистки по известным методикам [10, 11]. Стандартизировали полученные очищенные протеины КСТ (ОП КСТ) по сухому весу (0,023 г/мл), разливали в ампулы по 1 мл, лиофилизировали, проводили контроль стерильности.
В опыте использовали 40 кроликов породы Шиншилла массой 3±0,3 кг, которые были разделены на 2 группы по 20 кроликов: 10 контрольных и 10 опытных животных. Для получения экспериментального сифилиса в каждой группе все кролики были одновременно заражены взвесью 108 трепонем/мл ПБТ штамма Никольс, которую вводили по 2 мл интратестикулярно каждому кролику. Взвесь ПБТ перед заражением кроликов получали из тестикул кроликов с экспериментальной сифилитической инфекцией (СИЭ) на 7—8-й день после заражения по известной методике [7] и стандартизировали до содержания 108 трепонем/мл. Всем опытным животным двух групп на 14-й день после заражения вводили внутривенно ОП КСТ в дозе 0,023 г/мл в 2 мл изотонического раствора натрия хлорида.
Микроскопические исследования материалов из пунктатов сифилитического орхита и шанкров кроликов опытной и контрольной групп (20 животных) проводили в темнопольном микроскопе. Подсчитывали количество «извитых», «зернистых», и «цистных» форм ПБТ на 100 клеток в поле зрения (в 5 полях зрения) при помощи счетчика форменных элементов крови с маркировкой клавиш: «извитые Ф», «зернистые Ф», «цистные Ф». Исследование пунктатов проводили с 7-го по 49-й день после заражения с интервалом 1 нед до срока полного отсутствия в пунктатах извитых форм ПБТ. Это связано с тем, что видимая подвижность зерен-гранул и цистных форм клеток со временем резко снижается и их дифференциальная диагностика в общем содержимом пунктатов в отсутствие извитых форм не представляется возможной.
Клинические характеристики развития орхита и шанкра учитывали путем осмотра, пальпации яичек и семенников от начала до завершения видимых и определяемых пальпацией патологических изменений в контрольной и опытной группах кроликов в сроки от 7 до 84 дней (от 1 до 12 нед) каждые 4—5 дней. По развитию клинических проявлений течение первичного сифилиса разделено на 7 этапов: развивающийся орхит, развитый орхит, развивающийся шанкр, зрелый шанкр, начинающийся распад шанкра, распад шанкра, заживление шанкра, с описанием каждого этапа по методике [12]. Учитывали сроки 100% совпадения симптомов каждого этапа в группе контроля и в группе опыта.
Сроки вторичного проявления сифилиса определяли от момента появления папул на морде кроликов до отпадания корочек и появления плешивости волосяных покровов на их месте. Проводили темнопольную микроскопию отделяемого папул для определения в материале извитых форм ПБТ.
Предварительные серологические тесты сывороток крови у всех кроликов, взятых в исследование, позволили выявить отрицательные результаты в РСК с ультраозвученным трепонемным антигеном (УЗТА) и с кардиолипиновым антигеном (КА), а также в реакции микропреципитации с кардиолипином (РМП-К). Набор этих реакций использовали при проведении всех серологических исследований сывороток крови опытной и контрольной групп кроликов, выполняли по стандартным методикам [7, 13]. Забор крови и получение сывороток крови кроликов в контрольной и опытной группах проводили на 14, 21, 28, 45, 52 и 60-й день после заражения и затем ежемесячно до определения в них полной негативации титров специфических и неспецифических антител в РСК-УЗТА, РСК-К и РМП-К соответственно.
Результаты
В пунктатах из орхитов и шанкров контрольной и опытной групп кроликов с экспериментальным сифилисом (табл. 1)
Введение очищенных протеинов клеточных структур КБТ опытной группе кроликов на 14-й день после заражения привело через 7 дней (на 21-й день наблюдений) по сравнению с 14-м днем в контрольной группе к резкому увеличению в среднем в 1,75 раза числа извитых форм ПБТ (с 40 до 70%) и снижению в 2,5 раза среднего количества зернистых форм (с 50 до 20%), не затрагивая количественного изменения цистных форм ПБТ (10%).
На фоне введенного ОП КСТ к 42-му дню наблюдений прослеживались снижение среднего содержания извитых форм и более выраженная динамика нарастания зернистых форм по сравнению с цистными формами ПБТ.
Анализ соотношений форм ПБТ при одинаковом в контрольной и опытной группах кроликов среднем количестве извитых форм ПБТ (5%) позволил выявить, что в контрольной группе (на 28-й день) среднее количество зернистых форм ПБТ превышало среднее количество цистных форм в среднем в 1,4 раза, а в опытной группе (на 42-й день) — в среднем в 2,2 раза.
Длительность периода определения извитых форм ПБТ в пунктатах из орхитов и шанкров опытной группы превышало этот период в контрольной группе кроликов в среднем в 1,5 раза (42 и 28 дней соответственно).
Временны`е характеристики клинических проявлений первичного сифилиса по этапам от развивающегося орхита до заживления шанкра и вторичного сифилиса от момента появления папул на морде кроликов до образования на их местах участков плешивости в контрольной и опытной группах кроликов представлены в табл. 2.
Установлено, что в контрольной группе кроликов длительность процесса проявления первичного сифилиса от момента их заражения до заживления шанкра составила 12 нед. В то же время на фоне введения ОП КСТ на 14-й день после заражения кроликов этот период завершился за 10 нед за счет уменьшения длительности развития и распада шанкра (3—5 и 3—7 нед соответственно).
Сроки заживления шанкра в опытной и контрольной группах кроликов совпадают и составляют 35 дней.
Сроки клинических проявлений вторичного сифилиса в опытной и контрольной группах кроликов совпадают и приходятся на 23—26-ю неделю. На 23-й неделе на морде кроликов появлялись от 2 до 5 папулезных высыпаний в области надбровных дуг, переносицы и у основания ушей в различных сочетаниях. В этот период было определено при темнопольной микроскопии в отделяемом материале одной из папул наличие 2—3 трепонем у 2 кроликов опытной и контрольной групп, что подтверждает их сифилитическое происхождение.
Результаты исследований динамики средних титров специфических и неспецифических антител в сыворотках крови кроликов контрольной группы с экспериментальным сифилисом представлены на рис. 1,
Согласно полученным данным, в опытной и контрольной группах в сыворотках крови кроликов средние титры АТАт и АКАт в РСК совпадают на протяжении всего периода наблюдений. Установлено, что максимальные средние титры АКАт в РСК достоверно (р<0,05) больше максимальных титров АКАт в РМП-К на 45-й день, как в контрольной (1:18±2 и 1:8,4±0,5 соответственно), так и опытной группах (1:40±2 и 1:24±2 соответственно).
На 21-й день наблюдений в опытной группе по сравнению с контрольной выявлено увеличение средних титров АТАт и АКАт в РСК в 3 раза, а средних титров АКАт в РМП-К — в 3,6 раза, которые оставались высокими в течение почти 2 мес во всех реакциях. В течение 6-го месяца в опытной группе кроликов выявлена стабилизация средних титров антител во всех тестах, а в контрольной группе — в течение 6—7 мес (см. рис.1, 2). С 7-го месяца средние титры АТАт и АКАт в используемых серологических тестах в опытной и контрольной группах совпадают (или достоверно не различаются).
Сроки негативации титров АКАт в РМП-К в опытной и контрольной группах кроликов совпадают и равны 8 мес, а негативации титров АТАт и АКАт в РСК — 9,5 мес.
Обсуждение
Комплексное изучение закономерностей влияния антигена из очищенных протеинов клеточных структур КБТ на течение экспериментального сифилиса кроликов позволило выявить взаимосвязь характеристик возбудителя T. pallidum в пунктатах из яичек кроликов, клинических проявлений первичного и вторичного сифилиса кроликов и динамики изменения средних титров антитрепонемных и антикардиолипиновых антител до их полной негативации в серологических реакциях.
Введение на 14-й день после заражения кроликов ПБТ очищенных протеинов клеточных структур КБТ сопровождается резким увеличением относительного количества извитых форм ПБТ в пунктатах из яичек кроликов с одновременным увеличением в их сыворотках крови антитрепонемных и антикардиолипиновых антител. Это наряду с данными клинических проявлений подтверждает свойство ОП КСТ резко активизировать течение экспериментальной сифилитической инфекции через неделю после введения.
Несмотря на снижение относительного количества извитых форм ПБТ в пунктатах кроликов через 2—3 нед после введения ОП КСТ, на фоне стабильно высоких титров АТАт и АКАт сокращаются сроки развития и распада шанкров, тем самым сокращая сроки проявления первичного сифилиса у кроликов.
Характерной особенностью развития сифилитической инфекции кроликов на фоне введения ОП КСТ является удлинение сроков определения извитых форм ПБТ с увеличением в среднем в 2 раза зернистых форм ПБТ по сравнению с цистными формами в пунктатах из их яичек. Полученные данные свидетельствуют о ведущем значении зернистых форм в этом процессе.
Введение ОП КСТ не влияет на сроки заживления шанкра, сроки проявления и характеристики вторичного сифилиса, а также на сроки негативации специфических и неспецифических антител в сыворотках крови кроликов.
Заключение
Введение антигена из очищенных протеинов клеточных структур трепонем в организм кроликов на 14-й день после их заражения экспериментальным сифилисом приводит к резкой активизации сифилитического процесса и сокращению сроков проявления первичного сифилиса и не влияет на сроки проявления вторичного сифилиса и сроки негативации реакций на сифилис.
* Комментарий редакционной коллегии . Изучение иммунобиологических характеристик течения сифилитической инфекции на экспериментальной модели кроликов представляет значительный научный и практический интерес, но в силу известных обстоятельств в России в последние годы практически не проводится. Авторы — одни из немногих — попытались восполнить пробел знаний о развитии патологического процесса при внедрении бледной трепонемы, наряду с этим изучая динамику специфических и неспецифических антител, а также особенности клинических проявлений заболевания.
Однако нам представляется спорным создание столь сложной модели заболевания в силу неясных перспектив в понимании патогенеза заболевания, а главное — каким образом можно использовать эти данные? Кроме того, авторы проводят исследования под контролем РСК, отмененного Приказом №87 от 2001 г., на который они, тем не менее, ссылаются.
Не умаляя ценности представленных результатов, мы считаем целесообразным указать в данном исследовании направление поиска инструмента, позволяющего изучать воздействие современных бактерицидных препаратов на Treponema рallidum и/или физических факторов, оптимизирующих комплекс лечебных мероприятий.