Конфокальная лазерная эндомикроскопия (КЛЭМ) — диагностическая эндоскопическая методика, разработанная для получения гистологического диагноза желудочно-кишечных заболеваний в режиме реального времени. В систематическом обзоре литературы представлены характеристика КЛЭМ, оценка применимости и диагностического значения у пациентов с желудочно-кишечными заболеваниями, особенно при скрининге или наблюдении за неоплазией желудочно-кишечного тракта.
Поиск произведен в библиотеках Medline, Elsiever, Scopus, Pubmed по ключевым словам, без временны`х ограничений. В обзор включены как проспективные, так и ретроспективные клинические исследования, которые оценивают чувствительность, специфичность или точность КЛЭМ.
С технологическим развитием эндоскопической аппаратуры улучшилось и качество эндоскопического изображения. Несмотря на то что такие методы, как хромоэндоскопия, эндоскопия высокого разрешения и увеличения (узкоспектральная, автофлуоресцентная), улучшают визуализацию поражений слизистой оболочки, для формальной гистологической диагностики клеточной и тканевой атипии следует выполнять биопсию выявленного очага.
Подозрительные области, выявленные во время эндоскопии, подвергают биопсии или удаляют. Однако есть ряд недостатков, которые могут быть связаны с биопсией или эндоскопической резекцией, включая кровотечение или перфорацию. Кроме того, биопсия или эндоскопическая резекция неопухолевых поражений требуют много времени. Было бы идеальным во время эндоскопии поставить определенный диагноз без биопсии.
Недавние технологические достижения в области миниатюризации позволили встроить конфокальный сканирующий микроскоп в обычный гибкий эндоскоп или в трансэндоскопические зонды — метод, известный как конфокальная лазерная эндомикроскопия (КЛЭМ). КЛЭМ обеспечивает микроскопическую визуализацию слизистой оболочки во время эндоскопии с увеличением в 1000 раз, что позволяет врачам-эндоскопистам получать микроскопический анализ во время гастроскопии. Это приводит к оптимизированной диагностике изменений слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, таких как атрофия слизистой оболочки желудка, эпителиальная неоплазия, кишечная метаплазия (www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/intestinal-metaplasia), и может ограничить ошибку выборки нецелевых биопсий. В настоящее время используют 2 системы эндомикроскопии: на основе эндоскопа (ЭКЛЭМ) и на основе зондовой конфокальной лазерной эндомикроскопии (ЗКЛЭМ) [1].
Родоначальником КЛЭМ является американский ученый проф. M. Minsky. В ноябре 1955 г. M. Minsky, младший научный сотрудник Гарвардского университета, направил письмо на регистрацию патента первого конфокального микроскопа, в 1957 г. его изобретение запатентовали. M. Minsky в это время занимался изучением препаратов головного мозга и нервных окончаний клеток кожи без окраски, но тогда мало что было известно о том, как функционирует мозг и как соединяются нервные клетки. В Гарварде и Принстоне он изучал биологию, нейрофизиологию и нейроанатомию в дополнение к своим математическим исследованиям.
Опередив время, метод визуализации M. Minsky не получил развития в те годы, результаты исследований обработать не представлялось возможным из-за отсутствия специальных компьютерных программ [2, 3].
М. Minsky признался, что разочарован отсутствием понимания, в его работах представлены формы многих нервных клеток, необходима была трехмерная «схема соединений». Тем не менее с помощью систем визуализации того времени и с учетом абсолютной плотности нервных клеток головного мозга было невозможно различить такие нейронные сети из-за рассеяния света. Вскоре после M. Minsky в 1960-х гг. M.D. Egger и M. Petran представили общественности многолучевой конфокальный микроскоп для исследования неокрашенного препарата ткани головного мозга [4].
Дальнейшее развитие сканирующего конфокального лазерного микроскопа связано с M.D. Egger. В 1973 г. он опубликовал изображения клеточной структуры, которые можно было различить при этом методе [5]. По мере развития и совершенствования информационных технологий в 1970—1980-х гг. появилась возможность получать цифровые изображения, поэтому интерес к конфокальной микроскопии резко увеличился [6]. В 1980-х гг. была продемонстрирована работа сдвоенного сканирующего конфокального микроскопа в ходе исследований тканей человека и животных in vivo. В конце 1979 г. физик G.F. Brakenhoff разработал конфокальный сканирующий микроскоп [7], в это же время C. Sheppard сформулировал теорию создания изображения.
В середине 1980-х гг. T. Wilson, B. Amos и J. White с коллегами из Кембриджа разработали первый конфокальный лазерно-сканирующий микроскоп [6, 8]. В 1990-х гг. были созданы более мощные лазеры, сканирующие зеркальные элементы с высокой производительностью, высокоскоростная волоконная оптика, тонкий слой диэлектрического покрытия и детекторы, позволившие снизить шумовые характеристики [9]. Основное развитие метод получил в связи с разработкой информационных систем, компьютеров и нашел применение в различных областях медицины и техники. В 2000-х гг. КЛЭМ впервые стали применять в гастроэнтерологии при изучении слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта [8]. Микроскопические изображения слизистой оболочки толстой кишки с обнаружением неоплазии и колоректального рака, полученные в ходе диагностической колоноскопии, сочетанной с КЛЭМ, опубликовали в 2004 г. [9]. В этом же году КЛЭМ использовали для диагностики пищевода Барретта (ПБ) [10].
Для диагностики заболеваний пищеварительного тракта применяют КЛЭМ двух систем: Pentax (Япония), когда конфокальный лазерный микроскоп встроен в дистальный конец гибкого эндоскопа, и Cellvizio Mauna Kea Technologies (Франция), когда микроскоп работает на основе мини-зондов, проводимых через инструментальный канал эндоскопа к зоне интереса исследуемой слизистой оболочки. Созданы разновидности мини-зондов Cellvizio: GastroFlex-UHD, ColoFlex-UHD, CholangioFlex-UHD для исследования желудочно-кишечного тракта и AlveoFlex для исследования бронхолегочной системы. Преимущество ЗКЛЭМ в том, что они совместимы со многими гибкими эндоскопами с диаметром инструментального канала 2,8 мм (табл.). В настоящее время используют систему КЛЭМ на основе зонда ЗКЛЭМ, где к исследуемой ткани проводят тонкий зонд и гистологическое изображение объекта отображается на экране.
Мини-зонды (Cellvizio) выпускает компания Mauna Kea Technologies, Париж, Франция. Компания названа в честь самой высокой горы Mauna Kea Гавайских островов в США.
Создал конфокальные мини-зонды (и основал Mauna Kea Technologies) француз S. Loiseau, который вместе со своими коллегами участвовал в нескольких проектах для NАSА. Одним из таких проектов была разработка технологии создания четких и чистых изображений отдаленных объектов за много миль от Земли. После достижения этой цели S. Loiseau решил заняться визуализацией клеточных структур у людей (области интереса «от телескопа до микроскопа»).
В настоящее время ЗКЛЭМ используют более чем в 470 больницах по всему миру (около 150 больниц в Северной Америке, 200 в Европе и более 100 в Азии, Австралии и Океании), а в Соединенных Штатах по определенным показаниям она покрывается медицинским страхованием.
Мини-зонд может быть введен через эндоскоп или прикреплен к ткани-мишени, например во время хирургической операции. Простой ввод зонда через эндоскоп или иглу для аспирационной биопсии, например, поджелудочной железы, обеспечивает многообещающий результат для применения у пациентов с различными гастроэнтерологическими заболеваниями.
Применение КЛЭМ в диагностике верхних отделов пищеварительного тракта с последующей трактовкой полученных результатов
Следуя рекомендациям по методике КЛЭМ, перед диагностическим исследованием проводят настройку оборудования, выполняют калибровку зонда. Очень важна подготовка слизистой оболочки. Муцин, покрывающий слизистую оболочку желудка, может вызвать преломление луча сканирующего лазера. Для очистки слизистой оболочки используют 0,08% раствор симетикoнa. В литературе описан опыт применения N-ацетилцистеина для подготовки слизистой oболoчки желудка при методике КЛЭМ [11]. Добиться высокоточного эндомикроскопического изображения можно, когда дистальный конец эндoмикроскопа или датчика плотно прилегает к слизистой оболочке. Для этого мини-зонд GastroFlex устанавливают перпендикулярно относительно сканируемой зоны. Чтобы добиться стойкого контакта дистального конца мини-зoнда в одном положении нужно удерживать мини-зонд не менее 2 с, не всегда это удается из-за перистальтики и дыхательной экскурсии. Для снижения перистальтики некоторые авторы предлагают использовать снижающий активность перистальтики препaрaт — гиосцин бутилбромид [12] в дозировке 2 таблетки (20 мг) за 40 мин до обследования. Кoнфoкальные изoбрaжения не похожи на гистологические препараты, поскольку они имеют горизонтальную ориентацию срезов. Гистологические препараты не похожи на конфокальное изображение, полученное во время исследования, так как при КЛЭМ нельзя увидеть одновременно структуру как подслизистого, так и слизистого слоя [13].
КЛЭМ должен проводить хорошо подготовленный специалист с высокой квалификацией по эндоскопии и морфологии, в его задачи входит оценка нормальной или патологически измененной слизистой оболочки пищеварительного тракта для выполнения прицельной биопсии и точного гистологического заключения.
Разработаны специальные классификации для интерпретации конфокальных изображений, которые отображают связь между конфокальными изображениями во время исследования и традиционной гистологической картиной слизистой оболочки пищеварительного тракта. R. Kiesslich и соавт. в 2004 г. разработали классификацию для дифференциальной диагностики различных эпителиальных образований толстой кишки при помощи метода ЭКЛЭМ. Классификация названа критериями Майнца (Mainz criteria) в честь города Майнц (Германия), где в медицинском центре при университете имени Иоганна Гуттенберга проходили исследования [14, 15]. В 2012 г. были детально изучены воспалительные заболевания кишечника, что позволило группе исследователей представить оригинальную шкалу оценки степени нарушения барьерной функции кишки, названную шкалой Watson [16].
Чтобы оценить тяжесть гастрита, ассоциированного с H.pylori , P. Wang в 2010 г. разработал классификацию для ЭКЛЭМ. Она включала описание интактной слизистой оболочки желудка, 3 стадии воспаления, ассоциированного с Н.pylori, кишечную метаплазию слизистой оболочки желудка с атрофией желез [17]. Классификация Miami разработана специально для системы Cellvizio (Mauna Kea Technologies) в 2011 г., в ней описана нормальная и патологическая структура слизистой оболочки пищевода, желудка, тонкой и толстой кишки, билиарного тракта, а также указаны конфокальные критерии для дифференциальной диагностики структуры гиперпластических и аденоматозных полипов [18].
Чтобы стать профессионалом в области ЗКЛЭМ, по мнению некоторых авторов, необходимо выполнить не один десяток исследований, пройти специальную подготовку в объеме не менее 2 ч по интерпретации полученных конфокальных изображений [19].
Флуоресцентные агенты
Для визуализации гистологической структуры пищеварительного тракта и получения высококонтрастных снимков во время проведения КЛЭМ необходимо использовать средства, обладающие свойством флуоресценции. При исследование слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта вводят 5мл 10% флуоресцеин натрия внутривенно.
В исследованиях с применением флуоресцеина у пациентов с гастроэнтерологическими заболеваниями грубых побочных эффектов не выявлено, но в отдельных случаях наблюдали кратковременную гипотензию, тошноту, незначительную боль в эпигастрии, кожные высыпания. Частота возникновения побочных эффектов не зависела от дозы, концентрации введенного препарата и места его производства. Во время эндоскопического обследования с применением КЛЭМ установлена оптимальная доза флуоресцеина и временной промежуток от 0 до 8 мин после инъекции. При этом высококонтрастное изображение сoхраняется до 30 мин после введения препарата [20, 21].
Применение КЛЭМ в клинической практике
ПБ — предраковое состояние, которое трансформируется в аденокарциному пищевода через промежуточную стадию, известную как дисплазия. Некоторые авторы считают, что риск развития аденокарциномы при ПБ возрастает в 20—60 раз [22]. Текущие рекомендации нацелены на то, чтобы пациенты с ПБ проходили периодическое эндоскопическое наблюдение с эндоскопией белого света и случайными 4-квадрантными биопсиями для выявления и лечения дисплазии. Однако эта стратегия наблюдения ограничена случайной ошибкой выборки и низкой чувствительностью. Наблюдение со случайной биопсией может пропустить 43—57% всех случаев ранней неоплазии. КЛЭМ обладает высочайшей точностью среди всех эндоскопических методов и повышает диагностическую ценность, чувствительность выявления дисплазии и неоплазии внутри слизистой оболочки, а также уменьшает необходимость в ненужных биопсиях. R. Kiesslich и соавт. впервые опубликовали данные исследования о применении метода конфокальной эндомикроскопии при ПБ в 2006 г. По результатам этого исследования ПБ и дисплазия слизистой оболочки пищевода могут быть диагностированы с чувствительностью 98,1 и 92,9% и специфичностью 94,1 и 98,4% соответственно [23]. Другие авторы, проводившие диагностику дисплазии при ПБ, показали более низкую чувствительность метода — 80% при специфичности 94% [24].
КЛЭМ способна отображать только небольшое поле слизистой оболочки, поэтому ее следует дополнять другими передовыми методами визуализации, чтобы идентифицировать подозрительные области, которые нуждаются в эндомикроскопической оценке. КЛЭМ можно использовать для эндоскопической оценки (ПБ), точной оценки степени поражения и руководства к эндоскопическому лечению. КЛЭМ не помогает в оценке глубины инвазии ранних опухолевых очагов или в эндоскопическом наблюдении за больным после абляции или резекции слизистой оболочки.
Недавнее проспективное исследование, сравнивающее узкоспектральную визуализацию (NBI), хромоскопию (CE) и КЛЭМ для диагностики атрофического гастрита, показало, что NBI эквивалентна хромоскопии в классификации ямочного рельефа желудка, тогда как КЛЭМ обладает более высокой чувствительностью, специфичностью и точностью, чем хромоскопия [25]. Кроме того, КЛЭМ продемонстрировала высокие диагностические результаты и значительное превосходство при выявлении кишечной метаплазии желудка по сравнению с обычной эндоскопией. При КЛЭМ количество необходимых для подтверждения диагноза кишечной метаплазии желудка биопсий составляло примерно треть от того, что требовалось при объемной лазерной эндомикроскопии и стандартной методике биопсий [26, 27].
КЛЭМ также используют в описательных целях. Слепое проспективное исследование по изучению ямочного рисунка желудка выявило явное различие между нормальной слизистой оболочкой, хроническим воспалением, атрофией и неопластической слизистой оболочкой и продемонстрировало чувствительность и специфичность для прогнозирования атрофии желудка в 83,6 и 99,6% соответственно, тогда как соответствующие значения для прогнозирования рака желудка составляли 90,0 и 99,4% [16].
КЛЭМ продемонстрировала высокую чувствительность в попытке различать аденомы и гиперпластические полипы [19], выявлять зоны микрососудистой перестройки, осуществлять наблюдение после радикальной резекции и проводить раннюю диагностику рака на разных этапах лечения и скринига.
Целиакия является глютен-чувствительной энтеропатией, характеризуемой хроническим воспалением слизистой оболочки проксимального отдела тонкой кишки, иммунологически индуцированной белками пшеницы, ржи и ячменя [28]. Целиакию диагностируют по характерным изменениям гистологического строения тонкой кишки. Marsh [29] впервые предложил описание прогрессии повреждений слизистой оболочки, отражающей степень атрофии ворсинок, воспалительные изменения, удлинение крипт и увеличение количества внутриэпителиальных лимфоцитов (IEL). При подозрении на целиакию оценивают количество сохранных и поврежденных ворсинок, их характеристики (длина, форма и наличие/отсутствие поперечных борозд) и количество IEL, которые должны быть четко определены во время КЛЭМ [15]. Разработан показатель КЛЭМ (Confocal Celiac Score — CCS), измеряющий степень тяжести целиакии, который представляет собой соотношение количества изображений с определенными характеристиками и общего количества изображений. КЛЭМ при диагностике целиакии показала высокую точность с чувствительностью 94% и специфичностью 92%. Показатель CCS 0,06 или выше имел чувствительность 94,1% и специфичность 92,3% при постановке истинного диагноза целиакии. Участок с наивысшим выходом изменений по данным КЛЭМ, о чем свидетельствует самый высокий средний балл CCS, находился в двенадцатиперстной кишке.
Использование КЛЭМ дает перспективу диагностики целиакии во время продолжающейся эндоскопии и позволяет проводить биопсию в измененной слизистой оболочке, увеличивая тем самым точность диагностики. Однако хотя КЛЭМ, по-видимому, чувствительна и специфична для выявления увеличения количества интраэпителиальных лимфоцитов и степени атрофии ворсин, доказательств ее эффективности в этой области пока недостаточно. Скорее всего, методология КЛЭМ должна быть улучшена, прежде чем ее можно будет регулярно использовать у пациентов с целиакией.
Описан первый опыт применения КЛЭМ при диагностике карциноматоза брюшной полости. При раке пищеварительного тракта необходимо предварительно диагностировать перитонеальные метастазы до выбора терапии. При диагностической лапароскопии перитонеальный метастаз подтверждается эксцизионной биопсией с последующим гистологическим исследованием. Тем не менее остаются технические трудности в постановке точного диагноза и адекватной биопсии небольших поражений брюшины без повреждения органов.
Компания Mauna Kea Technologies (Париж, Франция) получила разрешение FDA на использование своей платформы КЛЭМ Cellvizio в хирургии. Зонд Celioflex можно доставлять эндоскопически или лапароскопически через троакар и манипулировать им в хирургическом поле с помощью стандартных лапароскопических инструментов. Обеспечивая точную визуализацию ткани в режиме реального времени во время операции, инструмент может помочь хирургам подтвердить отсутствие или наличие метастазов, не определенных до операции. Cellvizio также может помочь хирургам установить границы распространения опухоли, оценить полноту резекции и улучшить планирование хирургического вмешательства. Кроме того, этот прибор может помочь патологам более точно выделять участки злокачественного поражения при отборе проб в замороженном макропрепарате.
Таким образом, КЛЭМ является высокоинформативным, безопасным, методом диагностики заболеваний пищеварительного тракта. КЛЭМ позволяет установить особенности архитектоники и структуры слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и с высокой точностью прижизненно выявляет различные изменения на ранних стадиях трансформации. Поэтому применение этой методики ценно для определения дальнейшей тактики в диагностике и лечении при заболеваниях желудочно-кишечного тракта.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.