Костная ткань человека обладает высоким репаративным потенциалом [5, 12—15], однако во многих случаях (тяжелые травмы опорно-двигательного аппарата, различные дегенеративные заболевания) этот потенциал не может быть в полной мере реализован. В связи с этим возникает необходимость применения различных остеопластических и остеоиндуктивных материалов. К ним относят ауто-, алло- и ксенотрансплантаты кости [1, 4, 14, 35], а также композиционные биотрансплантаты с различными носителями, включая клетки и их компоненты [21].

Считается, что разработка трансплантатов с помощью методов клеточной и тканевой технологии позволяет добиться сочетания таких факторов, как биосовместимость (отсутствие вредного влияния на клетки и ткани пациента), биодеградируемость (способность материала к постепенному расщеплению и элиминации из организма) и биоактивность (стимуляция репарации и регенерации поврежденной ткани). Если первые два свойства характерны для большинства биоматериалов, используемых при лечении костных дефектов [3, 14, 35], то придание биотрансплантатам остеоиндуктивных свойств до сих пор остается актуальной проблемой не только медицины, но и биоинженерии.

Ключевой задачей здесь является подбор адекватного репаративного агента, его внедрение в трансплантат с возможностью дальнейшего высвобождения в области поражения кости. Таким агентом может выступать богатая тромбоцитами плазма (БоТП), полученная из собственной крови пациентов или крови доноров. К настоящему времени собрано большое количество свидетельств успешного применении БоТП в лечении дефектов костной [4, 33], хрящевой [59], мышечной ткани [39], трофических язв [23, 30], для стимуляции роста дериватов кожи [40]. В то же время до сих пор у исследователей нет единого подхода к использованию БоТП при производстве костных биотрансплантатов. Это связано с тем, что биологическая активность БоТП может быть реализована различными путями.

В настоящее время известно свыше 300 типов биологически активных веществ, содержащихся в тромбоцитах человека. Структурно полноценные тромбоциты содержат факторы активации гемостаза и фибринолитики, белки адгезии, ростостимулирующие факторы, цитокины и хемокины, протеазы и их ингибиторы, антимикробные белки [37].

Среди этих компонентов нужно особо выделить факторы, участвующие в процессах репарации и регенерации костной ткани. К ним относятся тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста фибробластов (FGF), трансформирующий фактор роста (TGF-β1), инсулиноподобный фактор роста (IGF-1), факторы роста сосудов и эндотелия (VEGF, VGF), цитокины (IL-1, IL-6, TNF-α), белки, облегчающие адгезию к коллагену (фибронектин и витронектин). Показано, что PDGF, FGF, TGF-β1, IGF-l стимулируют пролиферацию, миграцию и дифференцировку по остеогенному пути мезенхимальных стволовых клеток, стимулируют рост остеобластов и синтез ими межклеточного матрикса [5, 45, 64]; кроме того, TGF-β1 подавляет активность остеокластов, предотвращая резорбцию регенерирующей кости [5, 63].

Синергическое действие по отношению к ростовым факторам тромбоцитов оказывают белки морфогенеза кости (bone morphogenesis proteins — ВМР); так, в опытах на мышах с удалением фрагмента свода черепа (8 мм²) использование БоТП, обогащенной рекомбинантным ВМР-2 (концентрация 200 нг/мл), в 1,5—2 раза увеличивало минерализацию и плотность синтезируемого костного матрикса [46, 68]. Весьма любопытно, что в процесс репарации костной ткани на ранней стадии оказываются вовлечены провоспалительные факторы тромбоцитов — IL-1, IL-6, TNF-α, которые вызывают ингибирование остеогенеза. Под действием IL-1, IL-6, TNF-α снижается миграционная активность остеобластов и хондробластов [26, 50], а высокие дозы этих факторов вызывают апоптоз клеток и расщепление матрикса костной ткани, что можно наблюдать как в культуре клеток in vitro [27], так и при различных заболеваниях (остеоартрит, остеохондроз, альвеолит после экстракции зуба) [41]. Можно предположить, что роль IL-1, IL-6, TNF-α в процессе репарации кости является регуляторной и направлена в норме на подавление чрезмерной пролиферации клеток и предотвращение их патологической трансформации.

Все перечисленные факторы содержатся в гранулах тромбоцитов и выходят наружу при активации этих клеток в процессе адгезии или агрегации либо при их разрушении. В ходе активации тромбоцитов большая часть содержащихся в гранулах биологически активных веществ выделяется через канальцевую систему с последующим слиянием мембран гранул с плазматической мембраной тромбоцита [37]. В результате высвобожденные ростовые и другие факторы находятся непосредственно в области активации клеток. Часть гранул выходит, не сливаясь с плазматической мембраной, в результате чего снаружи тромбоцита образуются цельные одномембранные везикулы, содержащие биологически активные вещества. В литературе такие везикулы называют «экзосомы тромбоцитов» (другое название — «тромбоцитарные микрочастицы»); показано, что экзосомы тромбоцитов насыщены FGF, PDGF и TGF-β1 [29, 62], переносятся циркулирующей кровью и могут реализовывать биологическую активность содержащихся в них компонентов далеко от первоначального места дегрануляции тромбоцита [29].

Таким образом, материал тромбоцитов может быть распределен на разном расстоянии от места контакта БоТП с поврежденной тканью. В связи с этим встает вопрос об адекватной дозе БоТП, используемой для стимуляции репаративных процессов. Многие исследователи считают, что для эффективной репарации кости человека концентрация тромбоцитов используемой БоТП должна составлять не менее 10⁶/мл, а общий объем — не менее 3—5 мл, особенно при лечении обширных дефектов [31]. При этом часто не учитывается реальное содержание в БоТП биологически активных веществ, хотя известно, что клетки человека, в том числе остеобласты, теряют свою жизнеспособность в условиях избытка PDGF и других ростовых факторов. Так, на культуре остеобластов показано, что 5 мкг/мл экзосом тромбоцитов в расчете на 200 тыс. клеток in vitro повышают активность синтеза клетками костного матрикса, а 50 мкг/мл — полностью подавляют синтез [62]. В данном случае остеобласты испытывали комплексное воздействие PDGF и TGF-β1. Считается, что TGF-β1 (фактор дифференцировки) является наиболее многочисленным из всех ростовых факторов, содержащихся в тромбоцитах [37]. В норме TGF-β1 способствует трансформации мезенхимальных стволовых клеток в остеобласты и остеогенезу в области повреждения костной ткани, однако высокие дозы этого фактора приводят к прямо противоположному эффекту [53].

Аналогично действует TNF-α (фактор, препятствующий патологической трансформации клеток): при низких концентрациях (до 50 нг/мл) TNF-α стимулирует созревание кости, при высоких (свыше 100 нг/мл) вызывает массовый апоптоз остеобластов и хондробластов [53, 62].

Нужно помнить, что содержание ростовых и прочих факторов в тромбоцитах циркулирующей крови разных доноров может различаться в 5 раз и более [1, 2], вследствие чего есть вероятность, что полученный стандартный объем БоТП будет оказывать недостаточное или, наоборот, избыточное биологическое действие на рост и формирование кости. Для стимуляции остеогенеза БоТП, полученная из крови доноров, считается предпочтительной по сравнению с аутологичной БоТП [31]; в то же время популяция доноров крови обладает высокой гетерогенностью по биологической полноценности тромбоцитов [4].

Все это делает необходимой предварительную оценку биологического потенциала БоТП с учетом типа и степени патологических изменений кости. Обычно для характеристики биологической активности БоТП применяют методы иммуноферментного анализа с целью оценки концентрации тех или иных компонентов тромбоцитов [16, 29, 31, 41], однако при этом не учитывается качество исходных тромбоцитов БоТП, отсутствует анализ их структурной целостности.

Для решения этой задачи в нашей работе использовался оригинальный метод оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека, основанный на окрашивании клеток витальным флюоресцентным красителем [3]. Это позволило установить, что биологически полноценными (в структурном и функциональном отношении) являются лишь те тромбоциты, в которых при микроскопическом анализе удается выявить интенсивное свечение гранул, при этом количество тромбоцитов с гранулами коррелирует с количеством PDGF, выделяющимся в ходе их активации [2]. На примере культуры фибробластов линии М-22 и фибробластов кожи нами установлено, что наибольшую пролиферативную активность фибробласты проявляют при концентрации PDGF, равной 150 пг/мл на 100 тыс. клеток, для получения которой требуется в среднем 100 млн тромбоцитов с гранулами. Остеобласты и фибробласты кожи взрослого человека в условиях in vitro имеют сходную пролиферативную активность, поэтому можно предположить адекватность указанной дозы PDGF из гранул тромбоцитов для стимуляции роста остеобластов человека при сохранении их жизнеспособности. Однако эта находка требует дополнительной апробации в экспериментальных и клинических исследованиях.

В зависимости от стратегии и тактики лечения костных дефектов методы подготовки БоТП для клинического использования могут сильно варьировать. Так, весьма обсуждаемым является вопрос о необходимости предварительной активации тромбоцитов БоТП перед применением. В ряде работ показано, что внутрисуставное введение неактивированной БоТП при остеоартрите останавливает дальнейшее развитие патологических изменений, снижает болевой порог и стимулирует хондрогенез [17, 22, 25, 47]. Однако эффективность такого лечения сильно варьирует у разных пациентов: у лиц старше 60 лет регенерация суставного хряща под действием БоТП происходит гораздо медленнее, чем у лиц более молодого возраста, или вообще не происходит [25, 47].

При введении неактивированной БоТП в зоны повреждения кости (кортикальной или губчатой) стимуляция репарации полностью отсутствует [71]. Это может быть обусловлено разной адгезивной активностью тромбоцитов на кости и хряще; наши исследования показывают, что тромбоциты человека активно адгезируют на гиалуроновых покрытиях (аналог хряща) и практически не адгезируют на костных трансплантатах, поэтому не дегранулируют при контакте с костью. Следовательно, при костных дефектах для повышения эффективности лечения с использованием тромбоцитов следует обрабатывать кость в области раны веществами, способствующими адгезии тромбоцитов (например, коллагеном или гиалуроновой кислотой), или смешивать используемую БоТП с индуктором коагуляции с целью стимуляции выброса биологически активных веществ из тромбоцитов.

Чаще всего для этой цели используют тромбин или хлорид кальция, при этом считается, что активация кальцием в большей степени способствует сохранению факторов тромбоцитов в составе образующегося тромбофибринового сгустка, чем активация тромбином [67, 71]. Полученный в результате активации БоТП сгусток имеет гелеобразную консистенцию, поэтому в литературе активированную БоТП часто называют «тромбоцитарный гель» [24, 26, 34, 36]. Показано, что БоТП в виде геля эффективно стимулирует остеогенез в зубных альвеолах после экстракции зуба [7], а также при переломах костей челюсти [7, 8, 41], ускоряет рост кости при переломах у больных диабетом [34], может быть использована при диабетической остеоартропатии и других дефектах губчатой кости [36, 56]. При этом считается, что тромбоцитарный гель сохраняет свой регенераторный потенциал не более 7 сут, по истечении которых ростовые и другие факторы тромбоцитов полностью элиминируются (разрушаются или вымываются) [24, 62].

В связи с этим ряд исследователей предлагают наполнять тромбоцитарный гель микрофрагментами ауто-, или ксенокости, а также изделиями на основе фосфата кальция для повышения адсорбции факторов, выделенных тромбоцитами [60, 66]. В литературе нет достоверных данных о положительном действии указанных компонентов на сохранение ростостимулирующих факторов тромбоцитов; вместе с тем наполнение тромбоцитарного геля структурами, имитирующими кость, а также стромальными клетками костного мозга повышает скорость регенерации кости при остеонекрозе челюсти и суставов, при переломах берцовых костей [11, 20, 44].

Показано, что подложка на основе БоТП и 3-кальций фосфата способствует адгезии мезенхимальных стволовых клеток, стимулирует их миграцию и остеобластную дифференцировку как in vitro, так и in vivo [48—52]. Идея насыщения тромбоцитарного геля цитокинами и факторами дифференцировки (BMR-2, ВМР-7, TGF-β1 и др.) часто обсуждается [17, 31, 60, 69], однако у исследователей нет единого мнения об оптимальном количестве этих факторов, необходимом для введения в БоТП. Установлено, что избыток TGF-β1 может привести к обширным воспалительным реакциям, резко подавляет активность остеокальцина (фактор связывания кальция) [26], т. е. действие TGF-β1 в данном случае сходно с действием TNF-α, хотя в норме эти факторы являются антагонистами.

Также примечательно, что наличие в исходной БоТП лейкоцитов (чья активность резко усиливается в присутствии TNF-α) способно в значительной степени нивелировать репаративный потенциал ростовых факторов тромбоцитов; более того, в опытах с тромбоцитарным гелем, полученным из обогащенной лейкоцитами БоТП, показано угнетение роста кости по сравнению с контролем [27]. Данные о значимости лейкоцитов в составе БоТП весьма противоречивы: наряду с положительным антибактериальным действием лейкоцитов часто при лечении отмечается подавление репаративных процессов в области тканевых дефектов [53], поэтому большинство исследователей рекомендуют использовать БоТП без лейкоцитов.

В целом основным недостатком тромбоцитарного геля является неспособность выдерживать механические нагрузки, трудность придания ему четкой трехмерной формы, поэтому при обширных повреждениях кости все чаще используют комбинированные трансплантаты, содержащие биологически активные вещества БоТП.

На сегодняшний день многие остеопластические и остеоиндуктивные конструкции применяются в комбинации с БоТП или факторами, выделенными из тромбоцитов. В работах с неактивированной БоТП в качестве матрикса трансплантатов используют материалы, привлекательные для адгезии тромбоцитов. Так, биологически полноценные тромбоциты активно адгезируют на коллагеновых губках, матриксах на основе гиалуроновой кислоты и хитозана, изделиях из тетрафторэтилена и гидроксиапатита, содержащих коллаген 1-го типа [15, 43].

Клиническое применение таких трансплантатов стимулирует регенерацию кортикальной кости, однако часто сопряжено с развитием воспалительных реакций [54]. Кроме того, далеко не все адгезивно активные тромбоциты в суспензии БоТП оказываются прикрепленными на субстрате. В связи с этим предлагается заключать неактивированную БоТП внутрь гелеобразных матриксов, которые после затвердевания оказываются насыщенными биологически активными веществами тромбоцитов.

В качестве исходного материала геля могут быть использованы соединения альгината или желатина [6, 55]. Показано, что альгинатные и желатиновые гидрогели являются эффективными переносчиками факторов тромбоцитов, стимулируют размножение остеобластов в культуре in vitro и in vivo [42, 57, 64]. Высвобождение факторов тромбоцитов происходит по мере постепенного разрушения гидрогеля, что значительно продлевает срок их сохранности.

Следует отметить, что процесс врастания сосудов и костных балок собственно в область гидрогеля с дальнейшим его замещением полноценной костью может быть весьма растянут. Естественно предположить, что формирование костной ткани пойдет быстрее, если трансплантат изначально будет иметь внутреннюю архитектуру, топологически близкую матриксу нормальной кости. На основании этого аутологичная кость считается «золотым стандартом» костного трансплантата благодаря минимальной вероятности иммунного ответа и сохранности исходной трехмерной архитектуры костной ткани [37]. Вместе с тем во многих случаях использование фрагментов кости человека в комбинации с БоТП не дало желаемого эффекта независимо от размера дефекта [12, 32, 33]. Нужно сказать, что в этих работах чаще всего использовали неактивированную БоТП, которая, как уже говорилось, крайне плохо активируется при контакте с костью. Гораздо эффективнее действует активированная БоТП — тромбоцитарный гель — в комбинации с костным деминерализованным матриксом [12, 18, 49, 52]; считается, что материал губчатой деминерализованной кости осуществляет синергический эффект по отношению к факторам тромбоцитов [38, 46, 49]; тем не менее скорость заживления и остеогенеза при одних и тех же патологических изменениях кости сильно варьирует у разных пациентов [52].

К причинам, ингибирующим остеогенез, относят низкое содержание ростовых факторов в тромбоцитах исходной БоТП, низкий уровень приживления трансплантата, развитие воспалительной реакции под действием цитокинов, выделенных тромбоцитами [16, 27, 60—66]. Тромбоцитарный гель также используется в трансплантатах, изготовленных на основе композитных материалов, имитирующих трехмерную кость. К ним относят 3-кальций фосфат [70], гидроксиапатит [61, 65], биоактивное стекло [19], а также искусственные матриксы из полимерных нанофибрилл, полученные путем электрического прядения [9, 51, 58]. Из этих материалов изготавливают пенообразные пористые структуры, иногда ассоциированные с ростовыми и другими факторами; пористость матриксов облегчает формирование в них геля БоТП после активации.

На сегодняшний день эффективность таких трансплантатов показана главным образом на экспериментальных моделях [10, 13, 28], хотя есть сведения и об их использовании в клинической практике, например, при лечении периодонтита [13, 57]. При этом сами авторы признают, что нередко костные трансплантаты, изготовленные на основе перечисленных материалов, содержащие большое количество факторов БоТП, имеют такой же биологический и клинический эффект, как и аналогичные трансплантаты без БоТП [28, 66, 70], т. е. присутствие БоТП не вносило дополнительного вклада в репарацию костных дефектов.

Это может быть связано в том числе с потерей факторов тромбоцитов в процессе растворения или высыхания тромбоцитарного геля. Решения этой проблемы можно достичь путем закрепления факторов тромбоцитов или самих тромбоцитов на твердом субстрате еще на стадии производства трансплантата или благодаря реализации адгезивной активности тромбоцитов на трансплантате с их дальнейшей стабилизацией до начала дегрануляции.

Таким образом, богатая тромбоцитами плазма (БоТП) является источником большого количества биологически активных веществ и обладает мощным репаративным потенциалом. Однако реализация этого потенциала сильно варьирует в зависимости от способа использования БоТП. Количество и соотношение факторов тромбоцитов играют критическую роль в реализации репаративного потенциала БоТП, в том числе при остеогенезе; основные трудности на данный момент заключаются в невозможности избирательного выделения из БоТП наиболее предпочтительных компонентов тромбоцитов, а также их распознавании в составе гранул. Наряду с разработкой новых типов биотрансплантатов и тканеинженерных конструкций важной задачей остается совершенствование методов анализа и оценки биологических свойств тромбоцитов человека.