Влияние ингаляции динитрозильных комплексов железа с N-ацетил-L-цистеином на гемодинамику большого и малого кругов кровообращения у здоровых крыс и больных легочной артериальной гипертонией

Работа посвящается светлой памяти профессора Капелько Валерия Игнатьевича, бессменного руководителя лаборатории экспериментальной патологии сердца НИИЭК, стоявшего у истоков создания ДНКЖ и скоропостижно покинувшего нас в июне 2025 года.

ДНКЖ — динитрозильные комплексы железа

ДНКЖ-Гл — динитрозильные комплексы железа с глутатионом

ДНКЖ-Ацц — динитрозильные комплексы железа с N-ацетил-L-цистеином

ДПЖсис — систолическое давление в правом желудочке сердца

ЛАГ — легочная артериальная гипертензия

АДср. — среднее артериальное давление

ЧСС — частота сердечных сокращений

ПЖ — правый желудочек сердца

PAH — pulmonary arterial hypertension

DNICs — Dinitrozyl iron complexes

DNIC-Acc — Dinitrozyl iron complexes with N-acetyl-L-cysteine

MAP — mean arterial pressure

HR — heart rate

RV — right ventricle of the heart

NO — оксид азота

NOS1, NOS2 и NOS3 — внутриклеточные NO-синтазы (нейрональная, индуцибельная и эндотелиальная соответственно)

RS-NO — нитрозотиол

ЭПР — электронный парамагнитный резонанс

Оксид азота уже много лет привлекает внимание ученых благодаря его роли в различных физиологических и патологических процессах. NO является важной сигнальной молекулой, которая за счет работы NO-синтаз (NOS1, NOS2, NOS3) и активации растворимой гуанилатциклазы принимает участие в регуляции сосудистого тонуса, воспалительного и иммунного ответа, сократимости миокарда, свертывающей системы крови, а также оказывает влияние на процессы пролиферации фибробластов и гладкомышечных клеток [1—4]. В 1960-е годы профессором Федерального исследовательского центра химической физики им. Н.Н. Семенова РАН А.Ф. Ваниным в тканях животных были открыты и идентифицированы динитрозильные комплексы железа с тиолсодержащими лигандами [5, 6]. Поскольку ДНКЖ способны депонировать и высвобождать NO [2, 5, 6], эти комплексы стали рассматриваться в качестве потенциального лекарственного препарата [1, 2]. К 2005 г. была создана технология синтеза стабильных форм ДНКЖ с низкомолекулярными лигандами цистеином и глутатионом (патент РФ №2291880 от 01.12.2005). Эти комплексы имеют формулу (RS-)₂—Fe⁺—(NO+)₂ и существуют в организме в равновесии с белковыми ДНКЖ и S-нитрозотиолами [6, 7, 8, 9, 10]. Был синтезирован ряд других ДНКЖ с различными лигандами [11]. Некоторые из них были токсичными, например, биядерные комплексы с тиосульфатом [12—14]. Цистеиновые комплексы были нестабильны и быстро окислялись, в то время как глутатионовые динитрозильные комплексы оказались стабильными и могли длительно храниться при комнатной температуре в лиофилизированном виде без потери активности [15]. На их основе в Институте экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса под руководством академика Е.И. Чазова и профессора А.Ф. Ванина был создан препарат Оксаком® [8]. Этот препарат имел очень высокий профиль безопасности по результатам доклинических испытаний и по данным 1-й фазы клинических испытаний. В то же время он обладал хорошо выраженным гипотензивным эффектом, показанным у больных с неосложненным гипертоническим кризом в рамках 2-й фазы клинического исследования [16, 17]. Позже было показано его гипотензивное действие в малом круге кровообращения при легочной артериальной гипертензии в условиях экспериментальной монокроталиновой модели [18]. Однако препарат не был лишен недостатков. Особенность химического соединения препарата Оксаком — высокая гидрофильность — не позволяла активному веществу проникать в кровь трансдермально и при ингаляции [19]. Это потребовало создания более амфифильного варианта ДНКЖ, который можно было бы вводить ингаляционно или через кожу. Таким препаратом стал ДНКЖ с лигандом на основе N-ацетил-L-цистеина — ДНКЖ-Ацц [19—21].

Цель работы — изучение ингаляционного применения ДНКЖ-Ацц на крысах in vivo. Проводилось исследование его влияния на кровообращение в большом и малом кругах как у здоровых животных, так и у крыс с легочной гипертензией, вызванной монокроталином.

Работа была выполнена на 11 самцах стока Wistar весом 405+11 г, возрастом 5—6 мес. Животных содержали в Экспериментально-биологической клинике Института экспериментальной кардиологии имени академика В.Н. Смирнова в клетках по 5 голов со свободным доступом к сухим кормам и воде. Световой режим представлял собой 12 ч освещения и 12 ч затемнения при достаточной смене объемов воздуха и температуре 19—23 °C. Исследование проводили в соответствии с Правилами проведения качественных клинических испытаний в Российской Федерации (утверждены МЗ РФ 29.12.98). ОСТ 42-511—99, Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77 «О мерах по дальнейшему совершенствованию форм работы с использованием экспериментальных животных» и основными международными правилами, изложенными в основополагающих документах, регламентирующих проведение экспериментов на лабораторных животных и условиях их содержания (Хельсинкская декларация 2000 г., «Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях» (Страсбург, 18 марта 1986 г.)), положения Руководства по уходу и использованию лабораторных животных (Вашингтон, округ Колумбия, 2011). Протокол исследования был одобрен комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ кардиологии им. акад. Е.И. Чазова» МЗ РФ (протокол заседания № 2 от 18.07.2023 г.).

Под наркозом (препарат, содержащий тилетамин 250 мг и зопазепам 250 мг, в 5 мл, вводили 5 мг/кг) выполняли катетеризацию правого желудочка сердца крыс при помощи стандартного Милларовского катетера, вводимого через правую яремную вену, и усилителя ADV500 (Transonic, Канада). Использовали программное обеспечение LabChart ADInstruments 8.1.2 (Австралия). Второй катетер вводили в левую сонную артерию. Чтобы не было затруднения дыхания при вдувании в нос животному и свободного проникновения препарата в легкие, крысам вставлялась трахеостомическая трубка, через которую крыса получала препарат, распыленный с помощью ультразвукового ингалятора Omron U-22 (Япония). Перед ингаляцией стоковый раствор препарата ДНКЖ-Ацц разводили физиологическим раствором в 7 раз до конечного объема 7 мл с содержанием комплекса 0,25 мкмоль в 7 мл при комнатной температуре для первой дозы и до 0,5 мкмоль для второй дозы в том же объеме. Раствором постепенно заполняли камеру небулайзера шприцем по мере его расходования.

Монокроталиновая модель легочной гипертонии. Для создания легочной артериальной гипертонии крысам однократно подкожно вводили монокроталин в физиологическом растворе в дозе 60 мг/кг. Через 3—4 недели у животных развивалась ЛАГ. При катетеризации ПЖ сердца у таких животных систолическое давление в ПЖ превышало 25 мм рт. ст. В этом случае модель ЛАГ считалась успешной.

Синтез динитрозильных комплексов железа с лигандом N-ацетил-L-цистеином. Синтез ДНКЖ с тиоловыми лигандами (N-ацетил-L-цистеином) проводили способом, описанным в работе [22]. В качестве доноров NO использовался S-нитрозотиол, который образуется при взаимодействии N-ацетил-L-цистеина и нитрита натрия в кислой среде (pH 1—2). Источником ионов железа был FeSO₄, который содержался в реакционной среде. Образование RS-NO при участии N-ацетил-L-цистеина завершалось через 2—3 мин, после чего для повышения pH в реакционную среду добавлялся Na, K-фосфатный буфер и дополнительно NaOH. Конечное значение pH составляло 7,4—7,5. Непрореагировавшие ионы железа образовывали осадок гидроокиси, которую удаляли фильтрацией. Полученный препарат в виде аликвот хранили замороженным при температуре жидкого азота (-196 ^оC). Для стабилизации при комнатной температуре смешивали полученный препарат с глицерином.

Протокол исследования. Контрольную группу составляли 5 крыс, группа с ЛАГ содержала 6 животных. Исходно параметры гемодинамики в большом и малом кругах кровообращения (ЧСС, среднего давления в аорте, систолического давления в ПЖ сердца) регистрировались в течение 20 мин. Затем проводилась ингаляция в течение 12 мин от начала первой (малой дозой) препарата, потом ингаляция отключалась на 15 мин для восстановления параметров гемодинамики, далее ингаляция продолжалась второй дозой (вдвое превышающей первую) также в течение 12 мин с последующим периодом восстановления 20 мин. В конце эксперимента животных забивали передозировкой уретана. Легкие извлекались и помещались в жидкий азот для последующего определения содержания в ткани динитрозильных комплексов железа методом электронного парамагнитного резонанса при температуре жидкого азота. Методика таких исследований ранее была описана в работах [17—19].

Статистический анализ. Для статистической обработки из записей экспериментов отбирались точки с интервалом 5 с. Параметры гемодинамики аппроксимировались средствами пакета mgcv (1.9_3) в среде R с получением смешанной аддитивной модели [23]. В обеих дозах для сравнения были выбраны две временные точки: исходное состояние и время максимума эффекта от начала ингаляции дозой №1 на систолическое давление в правом желудочке. Статистическое сравнение значений гемодинамических показателей между временными точками выполнялось средствами пакета emmeans [24]. Результаты представлены как среднее + ошибка среднего (M+SE).

Исходные показатели АДср. и ЧСС у контрольных крыс и животных с ЛАГ не различались (таблица).

Параметры гемодинамики крыс в исходном состоянии

Примечание. *** — p<0,001 по сравнению с контролем.

Систолическое давление в правом желудочке у крыс с ЛАГ было в 2,5 раза выше, чем у здоровых животных (51 против 20 мм рт. ст.). После 11-минутной ингаляции первой дозы ДНКЖ-Ацц (0,25 мкмоль) у здоровых крыс АДср. в большом круге кровообращения снизилось на 30% (с 129 до 90 мм рт. ст.), а у крыс с ЛАГ — на 26% (с 138 до 102 мм рт. ст.). В малом круге кровообращения, напротив, у крыс с ЛАГ ДПЖсис снизилось на 30% (с 51,2 до 35,8 мм рт.ст.), в то время как у контрольных животных — лишь на 6,4% (с 20,1 до 18,8 мм рт. ст.) (рисунок, а). ЧСС в обеих группах снизилась, но у контрольных крыс — на 11,4%, а у крыс с ЛАГ — только на 7,7% (рисунок, д). После прекращения ингаляции параметры восстанавливались в течение 15—20 мин.

Изменения параметров гемодинамики в малом и большом кругах кровообращения у здоровых крыс и при легочной артериальной гипертонии при ингаляции ДНКЖ-Ацц в течение 12—15 мин в двух дозах.

а, б — систолическое давление в правом желудочке сердца; в, г — среднее давление в сонной артерии; д, е — частота сердечных сокращений. а—е — данные представлены как среднее + ошибка средней (окрашенные интервалы). Контроли окрашены розовым цветом, крысы с ЛАГ — зеленовато-голубым. а, в, д — 0,25 мкмоль, б, г, е — 0,50 мкмоль. Точка 0 — время начала ингаляции ДНКЖ-Ацц. Конец ингаляции — 12—13 мин. Вертикальная прерывистая линия — время наступления максимального эффекта на АД.

а, б — right ventricular systolic pressure; в, г — mean carotid artery pressure; д, е — heart rate. а—е — data presented as mean + standard error (colored intervals). Controls are colored pink, rats with pulmonary hypertension — greenish-blue а, в, д — 0.25 μmol; б, г, е — 0.50 μmol. Point 0 — DNIC-ACC inhalation start. End of inhalation — 12—13 minutes. Vertical dashed line — time of maximum effect on blood pressure.

У крыс с ЛАГ давление в малом круге оставалось сниженным (43,3 против 51,2 мм рт. ст. исходно), АДср. составило 122 мм рт. ст. против 138 мм рт. ст. исходно, а ЧСС снижалась до 278 от исходных 304 уд/мин. (В норме у крыс ЧСС = 280—500 уд/мин. Ниже 200 — брадикардия, выше 500 — тахикардия). У контрольных крыс также не наблюдалось полного восстановления показателей гемодинамики: ДПЖсис. в малом круге было 16,2 мм рт. ст. от исходного 20,1 мм рт. ст., среднее АД — 104 мм рт. ст., а исходно оно было 138 мм рт. ст. ЧСС снижалась до 232 уд/мин от исходных 300 уд/мин (см. рисунок а, в, д).

На втором этапе ингаляции вводили вдвое более высокую дозу ДНКЖ-Ацц (0,5 мкмоль). В результате было получено более выраженное влияние на показатели гемодинамики большого круга кровообращения, чем малого круга кровообращения (см. рисунок б, г, е). В контроле ДПЖсис. в ПЖ не снизилось, а возросло с 16,3 до 21,5 мм рт. ст., у крыс с ЛАГ оно незначительно снизилось (с 43,3 до 41,8 мм рт.ст.). АДср снизилось в обеих группах: в контроле — со 104 до 78 мм рт.ст., у крыс с ЛАГ — со 121,7 до 95 мм рт. ст. ЧСС снижалась меньше: у контрольных крыс — с 232 до 203 уд/мин, у крыс с ЛАГ — с 277 до 269 уд/мин.

По результатам исследования образцов замороженной ткани легких методом электронного парамагнитного резонанса было показано, что моноядерных ДНКЖ, связанных с тиол-содержащими белками легких, обнаружено не было, что свидетельствовало о быстром распаде комплексов или их выходе в кровь из легких. Как было показано в статье [21], авторы которой проводили аналогичные исследования при ингаляции интактных крыс существенно большими дозами ДНКЖ-Ацц, сигнал ЭПР динитрозильных комплексов в ткани легких был существенно выше по сравнению с их сигналом в цельной крови. Этот факт свидетельствует, что при использовании более низких доз ДНКЖ-Ацц, применяемых в данной работе, их сигнала в крови быть не должно.

При ингаляции ДНКЖ-Ацц у крыс было зарегистрировано снижение артериального давления как в малом, так и в большом круге кровообращения. Исходя из этого можно сделать вывод о том, что комплексы ДНКЖ-Ацц проникают из легких в кровь, расширяя сосуды большого круга. Подтверждение этому дают данные ЭПР-спектроскопии [20, 21]. В работе [21] было показано, что сигнал комплекса в крови существенно ниже, чем его интенсивность в ткани легких, но они все-таки определяются в крови при существенно большей (в 10 раз) дозе при ингаляции, чем в этой работе. ДНКЖ-Ацц проходит через сурфактант легких, в отличие от ДНКЖ-Гл [26]. Животные с ЛАГ были более чувствительны к ДНКЖ-Ацц: даже малая доза препарата снижала давление в малом круге в пять раз сильнее, чем у контрольных крыс. Ранее, в работах с внутривенным введением препарата Оксаком® животным с ЛАГ нами показано, что больные крысы были более чувствительны к ДНКЖ-Гл, чем контрольные [18]. Полученный результат свидетельствует о ведущей роли ДНКЖ в формировании гипотензивного эффекта вне зависимости от типа тиольного лиганда (см. рисунок, а). Лиганды определяют эффективность переноса ДНКЖ через природные барьеры (кожный покров, слизистые, сурфактант легких). Тиольные лиганды определяют и длительность гипотензивного эффекта ДНКЖ (у нитритов он слабый, у S-нитрозотиолов — кратковременный, у ДНКЖ — длительный) и ряд других свойств, например, оксид азота может высвобождаться из ДНКЖ как в виде свободного NO, так и в форме катиона нитрозония (NO⁺)).

Через четыре недели после введения монокроталина в дозе 60 мг/кг крысы демонстрировали повышенное давление в правом желудочке (см. таблицу), но параметры гемодинамики большого круга оставались нормальными. Гипотензивный эффект второй дозы ДНКЖ-Ацц был слабее, чем от первой. Следует отметить, что подобный эффект мы наблюдали при повторных внутривенных инъекциях ДНКЖ-Гл (из наших неопубликованных наблюдений). При повторных в/в введениях ДНКЖ-Гл эффект от каждой последующей дозы был меньше, чем от предыдущей точно такой же концентрации препарата. Известно, что на цистеиновые остатки белков переносятся Fe(NO)₂ группы от низкомолекулярных ДНКЖ с формированием новых белковых комплексов, например, ДНКЖ-связанных с альбумином и гемоглобином [10, 25]. Кроме того, при распаде ДНКЖ возникает не только NO, но и NO⁺, который реагирует с ионизированными тиольными группами (-S^-) с образованием S-нитрозотиолов [2, 6, 7]. Таким образом, из нитрозония образуются S-нитрозотиолы, повышающие емкость депо NO в организме.

Можно предположить, что SH-группы белков крови и сосудов после первой дозы участвуют в образовании ДНКЖ и RS-NO, которые являются депо и своего рода «буферной емкостью» оксида азота. В связи с этим гипотензивное действие второй дозы ДНКЖ может уменьшаться.

Однако причина снижения частоты сердечных сокращений при ингаляции ДНКЖ-Ацц остается невыясненной. Так, в контрольной группе ЧСС падала даже сильнее, чем у крыс с ЛАГ (на 11—12,5% против 3—8% соответственно). Хотя барорефлекс должен был бы увеличивать ЧСС в ответ на снижение давления. Отсюда следует, что механизм этого явления требует дальнейшего изучения.

1. Ингаляция ДНКЖ-Ацц быстро снижала давление как в большом, так и в малом круге кровообращения.

2. Крысы с ЛАГ были более восприимчивы к препарату, чем контрольные. Комплексы с лигандом N-ацетил-L-цистеином проникают через сурфактант легких в кровоток, что делает эти комплексы перспективными для дальнейшего изучения как дозовых режимов, так и профиля безопасности ДНКЖ с новым лигандом.

Вклад авторов:

Дизайн исследования, написание рукописи — Лакомкин В.Л., Тимошин А.А.

Физиологические эксперименты, сбор и обработка материалов, рисунки — Абрамов А.А.

Синтез динитрозильных комплексов железа — Шумаев К.Б.

Редактирование текста, статистика — Алиев М.К.

Анализ замороженной ткани легких методом ЭПР — Тимошин А.А.

Authors’ contribution:

Research design, manuscript writing — Lakomkin V.L., Timoshin A.A.

Physiological experiments, collection and processing of materials, drawings — Abramov A.A.

Synthesis of iron dinitrosyl complexes — Shumaev K.B.

Text editing, statistics — Aliev M.K.

Analysis of frozen lung tissue by EPR — Timoshin A.A.

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Минздрава России, гос. задание №JCDY-2024-0054.

Funding. The work was carried out with the financial support of the Russian Ministry of Health, state assignment No. JCDY-2024-0054.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare that they have no competing interests.