Введение

Проведение компьютерного моделирования структур гликозаминогликанов (ГАГ) оказывается целесообразным и необходимым благодаря повторяющемуся характеру их цепных звеньев и молекулярной гибкости в растворе [1]. Гетерогенность ГАГ по длине, составу, последовательности [2] обусловливает к тому же труднодостижимость получения надежных данных с препаратами ГАГ, что осложняет экспериментальное исследование их 3D-конформаций и молекулярной динамики [3]. Методы вычислительной химии порой оказываются единственным приемом получения исчерпывающего понимания ГАГ-взаимодействий [4], для этого используются приемы квантовой механики, молекулярного докинга, молекулярной динамики, рассмотрения и анализа исследуемых структурных изменений на длинных шкалах времени [3]. Расчетным инструментом предсказания и моделирования (компьютерной симуляции) предпочтительной ориентации ГАГ (и/или их фрагментов) и белковых молекул выступают методы молекулярного докинга и динамики [2]. Следует отметить растущее в настоящее время конкурентное влияние на применение методов вычислительного анализа и компьютерного моделирования (как самих белковых молекул, так и их комплексов с лигандами) подходов томографической криогенной электронной микроскопии с атомарным разрешением [5]. Развитие отмеченных выше методов с ростом их распространенности и увеличением доступности для использования может способствовать возможной базовой ориентации приемов in silico для проектирования еще несуществующих лигандов с целью рационального обоснования выбора путей их синтеза.

Теоретическое влияние лигандов хондроитина на стабильность гиалуронидазы

С помощью методов молекулярного докинга и молекулярной динамики мы провели теоретическое изучение взаимодействия ГАГ лигандов с построенной нами ранее 3D-моделью бычьей тестикулярной гиалуронидазы (по прототипу установленной пространственной структуры гиалуронидазы человека методом молекулярного гомологичного моделирования) [6]. Как ГАГ лиганды использованы димеры и тримеры хондроитина, тримеры хондроитинсульфата и тетрамеры гепарина (рис. 1). В отсутствие ГАГ лигандов обнаружена инактивирующая деформация структуры нативной гиалуронидазы (уже при 37 °C/310 К и выше), конформационно осуществляемая развитием притяжения отрицательно заряженной области молекулы биокатализатора около остатка Glu-105 к положительно заряженным участкам вокруг остатков Arg-59, Arg-96 (рис. 2, а, б) [7]. Такие конформационные изменения приводили к сужению и блокированию входа в полость активного центра гиалуронидазы. Структурные изменения фермента оказались необратимыми, и снижение температуры не приводило к восстановлению исходного молекулярного вида биокатализатора, фермент инактивировался. Наблюдаемая термоинактивация гиалуронидазы сопровождалась изменением расстояний между определенными аминокислотными остатками 3D-структуры фермента. Наиболее заметным было перемещение между позициями Glu-105 и Arg-59, демонстрируя важный начальный этап денатурации биокатализатора (рис. 3).

Рис. 1. Схематический состав выбранных и использованных для молекулярного докинга и динамики гликозаминогликановых лигандов.

|1| — димер и тример хондроитина (n=2 или 3 соответственно); |2| — тример хондроитинсульфата; |3| — тетрамер гепарина. Обозначения вида (4-SO₃^–, 6-SO₃^–) показывают возможные позиции сульфатирования в лигандах |1—3|.

Рис. 2. Изменения 3D-структуры бычьей тестикулярной гиалуронидазы (без лигандов) при 320 К в ходе термоинактивации фермента на момент расчетного времени наблюдения.

а — 0,1 пс; б — 15 пс. Сравнение изображений указывает сужение входа в активный центр биокатализатора (б) по сравнению с начальным моментом расчетного термостатирования (а).

Рис. 3. Изменение расстояний между аминокислотными остатками нативной бычьей тестикулярной гиалуронидазы.

Glu105 и Arg59 (1), Asp147 и Asn150 (2), Glu149 и Trp148 (3), Asp147 и Glu149 (4), Glu149 и Lys162 (5) в зависимости от времени (пс) расчетного наблюдения при 320 К. Номера кривых отображены на врезке рисунка.

Выполнение молекулярного докинга бычьей тестикулярной гиалуронидазы с хондроитиновыми лигандами (см. рис. 1, |1|) свидетельствовало об их стабилизирующем действии на 3D-структуру фермента при 310, 320 (рис. 4, а, б по сравнению с рис. 2, а, б для нативной гиалуронидазы без лигандов хондроитина), 330 и 340 К, наблюдаемое и зарегистрированное в течение 35—50 пс. Присоединение лигандов хондроитина на молекулярной поверхности биокатализатора происходило по центрам, обозначенным ch6, ch3 и ch1 (имеющим наибольший исследовательский и практический интерес), и повышало температуру инактивации фермента примерно на 10—15 градусов [7]. В основе взаимодействия 3D-модели бычьей тестикулярной гиалуронидазы с лигандами хондроитина лежат электростатические силы. Двухэтапный процесс с выполнением молекулярного докинга и его последующим уточнением методом молекулярной динамики показал себя продуктивным подходом для создания и изучения теоретических моделей взаимодействий белок—ГАГ [3].

Рис. 4. Вид молекулы бычьей тестикулярной гиалуронидазы при связывании с четырьмя лигандами хондроитина (по центрам ch1, ch2, ch3 и ch6) на поверхности глобулы биокатализатора при 320 К в момент времени расчетного наблюдения:

а — 0,17 пс; б — 11 пс.

Конкурентное воздействие лигандов гепарина и хондроитинсульфата при выполнении молекулярного докинга с гиалуронидазой

Проведение молекулярного докинга гиалуронидазы с сульфатированными ГАГ лигандами (тримером хондроитинсульфата и тетрамером гепарина, см. рис. 1, |2|, |3|) продемонстрировало их конкурентное воздействие на структуру фермента, приводящее к его инактивации при взаимодействии с гепариновым лигандом и защитному эффекту хондроитинсульфатных лигандов, присоединяющихся по восьми поверхностным центрам молекулы биокатализатора (рис. 5, а) [8]. Действительно, необратимая деформация структуры гиалуронидазы наблюдается при вхождении тетрамера гепарина в долину активного центра фермента с присоединенными лигандами хондроитинсульфата по позициям cs1, cs3, cs6 и cs7 (удаление всех лигандов не восстанавливает исходной структуры нативного биокатализатора). Осуществление докинга с поочередным исключением по одному или по два лиганда хондроитинсульфата с поверхности молекулы гиалуронидазы показывает, что наиболее критичными для стабилизации ферментной структуры оказываются такие центры (из восьми выявленных), как cs2, cs4, cs7 и cs8 (см. рис. 5) или cs1, cs2, cs4, cs7 и cs8.

Рис. 5. Расположение восьми центров связывания лигандов хондроитинсульфата (обозначенных по центрам их присоединения cs1, cs2, cs3 и т.д.) на 3D-модели бычьей тестикулярной гиалуронидазы (белковая цепь окрашена в желтый/серый цвет).

а — указаны величины свободных энергий связывания при 0 К. Проекция образована осями инерции додекасахаридного фрагмента субстрата — гиалуронана (НА12, приведен в центре иллюстрации, ось направлена по вертикали) и структурной модели фермента (ось направлена по горизонтали); б — изображение 3D-модели бычьей тестикулярной гиалуронидазы с электростатически связанными тримерами хондроитинсульфата по ее центрам cs2, cs4, cs7 и cs8, теоретически стабилизирующими структуру биокатализатора против ингибирующего действия тетрамера гепарина в активном центре фермента.

Нековалентное электростатическое связывание с ними лигандов хондроитинсульфата оказывается достаточным для предупреждения необратимой инактивации молекулы фермента при введении лиганда гепарина в зону активного центра. Однако определенная при этом последовательность предпочтительного связывания ГАГ лигандов на молекулярной поверхности гиалуронидазы указывает порядок присоединения тримеров хондроитинсульфата по позициям cs8>cs3>cs1>cs4>cs2>cs7>>cs5 в отсутствие субстрата в активном центре биокатализатора. Отмеченная последовательность свидетельствует об экспериментальной недостижимости указанного теоретического расположения тримеров хондроитинсульфата по центрам cs2, cs4, cs7 и cs8 (см. рис. 5, б), поскольку определенный порядок предпочтительного связывания предполагает занятость при этом также центров cs3 и cs1. Вместе с тем выявление на молекулярной поверхности гиалуронидазы «точек стабилизации» биокатализатора поддерживает важность их дальнейшего поиска и определения, когда доминирующим фактором устойчивости структуры фермента оказывается эффективное расположение на его глобуле ГАГ лигандов, а не их количество [8].

Специфичность и перспективы ковалентной модификации гиалуронидазы лигандами

Из восьми центров связывания ГАГ лигандов на гиалуронидазе (в том числе тримеров хондроитинсульфата) шесть — cs1, cs2, cs4, cs5, cs7 и cs8 — оказываются содержащими остатки лизина и пригодны для ковалентного присоединения по ним лигандов хондроитинсульфата (после их бензохиноновой активации) [8]. Установленная последовательность предпочтительного ковалентного связывания по лизиновым остаткам гиалуронидазы тримеров хондроитинсульфата cs7>cs1>cs5>>cs2,cs8,cs4 имеет иной порядок, отличный от такового для электростатического присоединения ГАГ лигандов, приведенный выше (и ранее) для фермента без субстрата. Разное количество и степень протонированности остатков лизина в непосредственной близости от центров связывания лигандов обусловливает отмеченные различия. Четыре остатка лизина (Lys187, Lys190, Lys198 и Lys206) [6] вблизи центра cs7 гиалуронидазы превращают его в наиболее пригодный для ковалентной модификации по аминогруппам фермента [8]. Действительно, ковалентная иммобилизация тримеров хондроитинсульфата по центрам cs7 или cs7, cs1, cs5 (в соответствии с установленной последовательностью предпочтительного ковалентного связывания) полностью защищает гиалуронидазу от ингибирования гепарином. Модельная ковалентная модификация по центрам cs1 и cs2 тримерами хондроитинсульфата не ведет к защите биокатализатора от ингибирования, подчеркивая важность ковалентного присоединения к гиалуронидазе тримеров хондроитинсульфата именно по центрам cs7 или cs7, cs1, cs5 [8].

Ковалентная модификация ферментов позволила превратить некоторые из них в современные лекарственные средства. Пэгилированная форма рекомбинантной гиалуронидазы человека (под наименованием pegvorhyaluronidase alfa) оказалась успешной в клинических испытаниях по лечению рака поджелудочной железы [9]. Перспективна оценка терапии с применением этой гиалуронидазы для случаев других плотных раковых опухолей, характеризующихся накоплением гиалуронана (рак желчного тракта, рак молочной железы и др.). Ведутся исследования и разработки ферментных конъюгатов для противодействия развитию сердечно-сосудистых нарушений (защита сосудистого эндотелия, гликокаликса, блокирование окислительного стресса и прочее) [10]. Для расширения арсенала лекарственных средств на основе полимер-белковых конъюгатов [11] интенсивно исследуются и предлагаются полисахариды [12]. Предполагается, что для достижения весьма низкой и контролируемой гетерогенности получаемого продукта, регулярно воспроизводимого по своим параметрам и достоверно охарактеризованного, возможно, следует вести его построение/получение с использованием единственного центра присоединения модификатора на белковой молекуле. Откроет ли поддержание такого жесткого ограничения перспективный путь получения лекарственных биоконъюгатов, пока неясно, и на многие вопросы ответ придет со временем.

Регуляторное влияние лигандов, выявленное методами молекулярного докинга и молекулярной динамики гиалуронидазы

Обобщая данные молекулярного докинга и динамики гиалуронидазы с ГАГ лигандами, следует отметить теоретически подтвержденное стабилизирующее 3D-структуру биокатализатора действие тримеров хондроитина. Оно проявляется в термостабилизации фермента благодаря электростатическому присоединению к его структуре лигандов хондроитина (см. рис. 2, а, б; рис. 4, а, б), повышающему температуру денатурации биокатализатора [7]. Ужестчающее структуру ГАГ сульфатирование демонстрировало конкурентное влияние на активность гиалуронидазы тетрамеров гепарина и тримеров хондроитинсульфата, когда действие первого вело к ингибированию фермента, а присоединение второго (по центрам cs2, cs4, cs7 и cs8 или cs1, cs2, cs4, cs7 и cs8) предупреждало его. Подтверждению медицинской значимости и перспективности расчетных методов (раскрывающих механизм связывания белка с лигандом) служат данные многоцентрового изучения метопролола [13]. На модели миокардиального поражения (посредством ишемии/реперфузии (45 минут/24 часа) у мышей обнаружено, что метопролол статистически значимо снижал размер поражения миокарда, тогда как другие β-блокаторы (атенолол, пропранолол) не проявляли кардиопротективного эффекта. Метопролол предстал единственным изученным β-блокатором, ослабляющим миграцию и инфильтрацию нейтрофилов в ходе воспалительного обострения. Воздействие метопролола на динамику нейтрофилов (известных медиаторов реперфузионного поражения) способствовало формированию и развитию защитного эффекта. Изучение in silico продемонстрировало, что связывание метопролола с β-1 адренергическим рецептором (β1AR) вызывает значимые конформационные изменения его внутриклеточного домена, чего не наблюдается с атенололом и пропранололом [13]. Анализ данных in silico предполагает, что связывание белка с лигандом через G_sα белковую субъединицу в комплекс метопролол-β1AR вызывает специфические конформационные изменения β1AR, которые влияют на его внутриклеточные взаимодействия, экспонирование Ser461-462 центров фосфорилирования и возможные изменения его связывания с множественными внутриклеточными эффекторами, как связанные с G-белком рецепторные киназы (GRKs). Кардиопротективный эффект метопролола опосредовался через β1AR без вовлечения во взаимодействие β2AR. Результаты исследования in vivo и in silico способствуют обоснованию проведения клинических испытаний с адекватными дозами и своевременным внутривенным введением метопролола (а не других β-блокаторов) для оценки клинической эффективности этой стратегии у гемодинамически стабильных пациентов с подъемом сегмента ST на ЭКГ при инфаркте миокарда (STEMI) [13]. Выявленная в исследовании последовательность предпочтительного связывания на молекулярной поверхности гиалуронидазы ГАГ лигандов [8] способствует формированию обоснованных рекомендаций для экспериментальной регуляции эндогликозидазной активности биокатализатора. Для этой цели вполне применима ковалентная модификация гиалуронидазы тримерами хондроитинсульфата по центрам cs7 или cs7, cs1, и cs5. Определенная нами теоретически последовательность предпочтительного связывания ГАГ лигандов с ферментом объясняет достижение наибольшего уменьшения его ингибирования гепарином при наибольшей (почти предельной) степени модификации аминогрупп гиалуронидазы декстраном (96—98%) [14] из-за затрудненного доступа модифицирующего агента/лиганда к аминокислотным остаткам, лимитирующим влияние на 3D структуру биокатализатора. Более того, взаимодействие по центрам («точкам чувствительности») на молекулярной поверхности гиалуронидазы может достигаться при достаточно высоких степенях модификации фермента, вызывая существенное снижение его остаточной эндогликозидазной активности, как при воздействии смеси дисахаридов, и, наоборот, способствуя сохранению активности биокатализатора на вполне высоком уровне, как у конъюгата гиалуронидаза—хондроитинсульфат. Возможность и реализация такой регуляции активности фермента подчеркивают актуальность определения отмеченных «точек чувствительности» на его молекулярной поверхности. Как инструктивный вывод следует отметить, что перспективные улучшения инструментария молекулярного докинга ассоциируются с устранением современных ограничений, таких как рассмотрение белковой молекулы в большинстве случаев в качестве жесткой структуры и частичное или полное игнорирование влияния десольватации (весьма значимой в докинге высокосольватированных лигандов, сходных с олигосахаридами) [15]. Заметным и весомым вызовом развитию молекулярного докинга становится представление гибкости структуры ферментов методом молекулярной динамики с моделированием всех степеней свободы в комплексе биокатализатор—лиганд. Исследования такого рода [13, 15] направлены на выяснение механизма действия изучаемых агентов в биологических системах и обоснование продуктивных способов получения высокоэффективных лекарственных средств ферментной природы.

Заключение

Увеличивающийся исследовательский интерес и рост научных публикаций об изучении взаимодействия гликозаминогликанов с белками способствовали накоплению экспериментальных данных и обоснованию вопросов, обусловленных полученными результатами. Одной из задач указанного направления предстало исследование взаимодействия гиалуронидазы с гликозаминогликанами или их фрагментами. Оно актуально с позиций определения механизма регуляции активности этого фермента в биосистемах, как и его влияния на состояние сосудистой стенки. Последнее выступает весьма важным в отношении многих медицинских аспектов, в том числе дизайна лекарственных производных нового поколения. Экспериментальные результаты в течение долгого периода демонстрировали, что различие во взаимодействии гиалуронидазы с полимерными и сополимерными гликозаминогликанами связано с воздействием на ферментную глобулу: С-5 эпимеров, остатков L-IdoA (IdoA — идуроновая кислота) и D-GlcA (GlcA — глюкуроновая кислота); гликозидных связей α(1-4) и α(1-3) по сравнению с β(1-4) и β(1-3) в составе гликозаминогликанов (гепарин, дерматансульфат по отношению к хондроитинсульфату, гиалуронану) и дисахаридов (мальтозы — Mal по сравнению с целлобиозой — Cel); С-4 эпимеров, глюкозы (Glc) по сравнению с галактозой (Gal); особо следует выделить значение достижения многообразного микроокружения молекулы биокатализатора (как при его взаимодействии со смесью дисахаридов). Собранные данные подчеркивали необходимость рассмотрения структурных изменений при взаимодействии гиалуронидазы с гликозаминогликанами или их фрагментами с применением новых исследовательских методов, позволяющих вполне детально и полно следить за конформационными переходами реагирующих друг с другом агентов.

В этой ситуации продуктивным оказалось использование методов вычислительной биохимии. На первом этапе изучения вполне целесообразным было применение методов молекулярного докинга и молекулярной динамики гиалуронидазы с гликозаминогликанами и их лигандами. Результаты этой стадии работы демонстрировали эффект стабилизации структуры нативной гиалуронидазы под воздействием лигандов димеров и тримеров хондроитина (от одного по центру взаимодействия ch6 до трех по центрам ch6, ch3, ch1 и более) при термоинактивации фермента. Заметно и конкурентное взаимодействие лигандов тримеров хондроитинсульфата и тетрамеров гепарина с гиалуронидазой, проявляющееся в регуляции ингибирования биокатализатора. Выявленная нами последовательность предпочтительного связывания гликозаминогликановых лигандов с гиалуронидазой конкретизирует обоснованность рекомендаций для экспериментальной верификации модификации исследуемого фермента. Такой подход демонстрирует значимость ковалентной модификации биокатализатора по его центрам cs7 или cs7, cs1, cs5 тримерами хондроитинсульфата для получения стабилизированных форм фермента. Будет ли этот метод лучшим — пока неясно, поскольку требуется составление более полной картины молекулярного докинга и динамики гиалуронидазы с гликозаминогликановыми лигандами, включая возможное проведение докинга фермента с тримером гиалуронана, его воздействием на биокатализатор одновременно с тетрамером гепарина, эффектами одновременного присутствия тримеров хондроитина и гепаринового тетрамера. Исследование призвано определить, будет ли конъюгирование гиалуронидазы по ее определенному, возможно, даже единственному, центру присоединения модификатора оптимального вида наиболее эффективным или тому имеется альтернатива, последовательно установленная методами компьютерного моделирования 3D-структуры бычьей тестикулярной гиалуронидазы.

В целом последовательное проведение вычислительного изучения ориентирует исследовательский поиск на выяснение лимитирующих активность гиалуронидазы взаимодействий этого биокатализатора с гликозаминогликановыми лигандами и обоснованное формирование рекомендации/рекомендаций по экспериментальному модифицированию фермента для практических задач сосудистой биологии и медицины. Следует отметить возможное изменение очередности применения экспериментальных и теоретических/расчетных подходов. Если традиционно последние использовались для уточнения первоначально полученных экспериментальных результатов, то наши данные предполагают реализацию обратной последовательности, когда теоретически обоснованные рекомендации по регуляции активности биокатализаторов верифицируются затем в экспериментальных изучениях, способствуя их дальнейшему развитию и практическому воплощению.

Вычислительные подходы исследования

В качестве исследуемой белковой структуры для выполнения вычислительного докинга с ГАГ лигандами использована построенная нами ранее 3D-модель бычьей тестикулярной гиалуронидазы [6].

Расчеты молекулярного докинга проводили с применением программ UCSF Chimera и DOCK [7, 8]. Выполнению докинга низкомолекулярной молекулы со статичной макромолекулой фермента служила программа DOCK. Для построения рисунков использовали программу UCSF Chimera или Swiss-Pdb Viewer. Проведение молекулярного докинга осуществляли, размещая низкомолекулярный ГАГ лиганд в различных положениях на ферментной макромолекуле на расстоянии половины ее поперечного размера. Докинг выполняли со свободной молекулой белка (ненагруженной ГАГ лигандами) и с присоединенными к молекулярным центрам гиалуронидазы (с наибольшей энергией связывания) ГАГ лигандами [7, 8]. Молекулярную динамику молекулы фермента со связанными ГАГ лигандами проводили с сохранением всех ковалентных связей в биокатализаторе, в том числе и дисульфидных, используя программу NAMD. После изменения структуры гиалуронидазы под действием ГАГ лигандов осуществляли их полное удаление и наблюдали, происходит ли возвращение к исходной конформации белка за определенный интервал времени (50—100 пс). Если конформация восстанавливалась — изменения обратимы, если нет — необратимы. Следует указать, что отсутствие изменений структуры фермента при выполнении его молекулярного докинга с ГАГ лигандами в течение 50—100 пс означало, что биокатализатор стабилен (т.е. не изменяется с точностью до колебаний конформаций, вызванных тепловым движением).

Выбор ГАГ лигандов выполняли с базы данных Pubchem.ncbi.nlm.nih.gov [7, 8]. Для докинга выбрали димер и тример хондроитина [7], тример хондроитинсульфата и тетрамер гепарина [8]. Длина выбранных ГАГ молекулярных лигандов в вытянутом состоянии соответствует поперечному размеру молекулы бычьей тестикулярной гиалуронидазы. При термоинактивации фермента (300, 310, 320, 330 и 340 К) обратную динамику его 3D-структуры вычисляли/рассчитывали после снижения температуры (от указанных выше величин) до 295 К [7].

Финансовая поддержка

Настоящее исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации и Российского фонда фундаментальных исследований (грант 18-015-00056).

Соблюдение этических норм. Настоящая статья не содержит описания выполненных авторами исследований с участием людей или использованием животных в качестве объектов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.