Введение
Диффузное поражение коронарных артерий (КА) — это состояние, обусловливающее тяжелое течение ишемической болезни сердца в виде рефрактерной стенокардии и ограничивающее проведение прямой реваскуляризации миокарда. При схожих факторах риска атеросклероза у одних людей формируются отдельные (фокальные) атеросклеротические бляшки, а у других развивается диффузное атеросклеротическое поражение [1]. Патогенетические механизмы, отвечающие за характер морфологических изменений сосудистой стенки, недостаточно изучены.
В последние годы пристальное внимание уделяется вкладу иммунных и воспалительных процессов в развитие атеросклероза. В крупных эпидемиологических исследованиях продемонстрирована роль лейкоцитов, в частности моноцитов/макрофагов и Т-клеток, в прогрессировании атеросклероза и развитии сердечно-сосудистых событий [2]. Моноциты крови неоднородны по фенотипу и функциональным особенностям. По уровню экспрессии дифференцировочных антигенов CD14 и CD16 в настоящее время выделяют 3 популяции моноцитов — «классические», «промежуточные» и «неклассические». Наиболее атерогенной считают промежуточную субпопуляцию, так как она имеет выраженную способность к синтезу воспалительных цитокинов, а также к взаимодействию с тромбоцитами с формированием моноцитарно-тромбоцитарных комплексов (МТК) [3, 4]. Изучению связи фенотипа моноцитов крови с тяжестью коронарного атеросклероза посвящено немало клинических работ, однако в них, как правило, использовалась устаревшая классификация, не предполагающая выделение клеток с «промежуточным» фенотипом; связь между уровнем промежуточных моноцитов в составе циркулирующих МТК и диффузным коронарным атеросклерозом показана только в одном исследовании [3].
Разные популяции Т-лимфоцитов вносят неоднозначный вклад в атерогенез. Различают проатерогенные эффекторные популяции и регуляторные Т-клетки (Трег), оказывающие противоположное антиатерогенное действие. При этом экспрессия молекул CD39, CD278, CD45RO/RA позволяет наиболее точно идентифицировать субпопуляцию Трег и характеризует фенотип наиболее зрелых, готовых к активации, Трег памяти, обладающих наиболее выраженными противовоспалительными свойствами [5, 6]. Дефицит регуляторного звена характерен для пациентов с тяжелым и быстропрогрессирующим атеросклерозом коронарных и сонных артерий [7, 8]. Данные о количестве и функциональной активности Трег в крови при диффузном и фокальном поражении коронарного русла в литературе отсутствуют.
Цель исследования — оценить показатели клеточного иммунитета у больных с диффузным и локальным поражением коронарных артерий и провести сравнительный анализ полученных результатов для изучения взаимосвязи показателей клеточного иммунитета с морфологическими характеристиками коронарного атеросклероза.
Материал и методы
Выполнено пилотное одноцентровое исследование. В группы исследования включены пациенты с клинической картиной стабильной стенокардии II—IV ФК, многососудистым поражением коронарных артерий, госпитализированные для проведения первичного изолированного коронарного шунтирования в отдел сердечно-сосудистой хирургии ФГБУ «НМИЦ кардиологии» Минздрава России в течение календарного года (2019 г.). Критерии исключения — инфаркт миокарда давностью менее 1 мес до операции, хроническая сердечная недостаточность III—IV ФК по Нью-Йоркской классификации (NYHA), проведение оперативных вмешательств в течение предыдущих 6 мес, тяжелая сопутствующая патология в виде злокачественных новообразований, ревматических заболеваний, хронической болезни почек стадии 3 и более (скорость клубочковой фильтрации менее 60 мл/мин/м2 по CKD-EPI), хронической обструктивной болезни легких умеренной стадии и более (II—IV по классификации GOLD), гормональной дисфункции щитовидной железы, текущие инфекционные или воспалительные заболевания, прием противовоспалительных лекарственных средств. Таким образом, включено 29 пациентов, в том числе 23 мужчины, в возрасте 65 (57; 68) лет. Все пациенты разделены на две группы: с диффузным поражением коронарных артерий (1-я группа, n=18) и локальным поражением коронарных артерий (2-я группа, n=11).
Определение «диффузного поражения» коронарных артерий основывалось на данных анализа предоперационной коронароангиографии двумя независимыми экспертами и интраоперационного подтверждения этой оценки. Критериями диффузного поражения коронарного русла считали совокупность признаков по классификации ACC/AHA (длина атеросклеротического поражения 2 см и более) и Syntax (диаметр сосуда менее 2 мм на протяжении 75% сегмента артерии дистальнее стеноза независимо от наличия или отсутствия атеросклеротического поражения артерии этого участка). В соответствии с указанными критериями у 18 пациентов выявлено диффузное поражение, у 11 пациентов — недиффузное (сегментарное) поражение коронарного русла. Образцы периферической крови в цитратном антикоагулянте получали за сутки до проведения операции. Иммунофенотипирование лейкоцитов проводили в течение 1—2 ч после забора крови с помощью флюоресцентно меченных антител к антигенам человека (CD4, CD25, CD39, CD278, CD45RA, CD14, CD16, CD42a (Beckman Coulter, BD Biosciences, eBioscience, США), связывание антител оценивали методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACS Calibur (BD Immunocytometry Systems, США). Определяли количество CD4+ Т-клеток, CD4+CD25++ Трег, включая CD39+, CD278+ и CD45RA— популяции, CD4+CD25+ активированных Т-хелперных клеток. Субпопуляции моноцитов крови типировали как классические (CD14++CD16—), промежуточные (CD14++CD16+) и неклассические (CD14+CD16+), МТК определяли по окрашиванию антителами к антигену тромбоцитов CD42a.
Статистический анализ. Нормальный характер распределения данных оценивали с использованием критерия Шапиро—Уилка. В случае соответствия распределения признака нормальному закону данные выражали как среднее и стандартное отклонение, в случае несоответствия данные представлены в виде медиана (25-й—75-й перцентили). В работе использованы следующие методы и критерии статистического анализа: t-критерий Стьюдента, U-критерий Манна—Уитни, хи-квадрат (χ2) Пирсона, двусторонний критерий Фишера. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. В работе использован пакет статистических программ Statistica 7.0.
Результаты
Основные клинико-демографические параметры отражены в табл. 1. В группе с диффузным поражением коронарного русла было статистически значимо больше пациентов с ранее перенесенным инфарктом миокарда, и отмечена тенденция к более частому выявлению сахарного диабета и периферического атеросклероза (сонных артерий и/или артерий нижних конечностей), а также к более высокому уровню в крови холестерина липопротеидов низкой плотности и более низкому уровню холестерина липопротеидов высокой плотности.
Таблица 1. Клинико-лабораторные показатели обследованных пациентов
| Параметр | Группа 1-я, n=18 | Группа 2-я, n=11 | p |
| Возраст, лет | 63,9±9,0 | 62,7±8,4 | 0,709 |
| Мужчины, n (%) | 13 (72,2) | 10 (90,9) | 0,228 |
| Индекс массы тела, кг/м2 | 29,4±3,9 | 28,3±3,3 | 0,531 |
| Курение в анамнезе, n (%) | 8 (44,4) | 4 (36,4) | 0,668 |
| Артериальная гипертензия, n (%) | 17 (94,4) | 11 (100) | 0,426 |
| Сахарный диабет, n (%) | 5 (27,8) | 1 (9,1) | 0,228 |
| Мультифокальный атеросклероз, n (%) | 4 (22,2) | 1 (9,1) | 0,364 |
| Инфаркт миокарда в анамнезе, n (%) | 16 (88,9) | 3 (27,3) | 0,001 |
| Общий холестерин, ммоль/л | 4,2±0,9 | 3,9±0,6 | 0,877 |
| ЛНП-холестерин, ммоль/л | 2,6±0,8 | 2,2±0,7 | 0,159 |
| ЛВП-холестерин, ммоль/л | 0,9±0,2 | 1,2±0,4 | 0,102 |
| Триглицериды, ммоль/л | 1,4±0,5 | 1,3±0,5 | 0,465 |
Примечание. ЛНП — липопротеины низкой плотности, ЛВП — липопротеины высокой плотности
Большинство больных обеих групп (88,9 и 90,9% соответственно) получало гиполипидемическую терапию, в основном — аторвастатин (75,0 и 80% соответственно).
У пациентов с диффузным поражением коронарного русла обнаружено снижение относительного количества Трег при неизмененном содержании активированных хелперных клеток. Изменения в экспрессии Трег дифференцировочных антигенов (CD45RA, CD39, CD278) не выявлены (табл. 2).
Таблица 2. Иммунологические параметры у обследованных пациентов
| Параметр | Группа 1-я, n=18 | Группа 2-я, n=11 | p |
| Лейкоциты, млн/мл | 6,4 (5,8; 7,6) | 5,8 (5,2; 7,0) | 0,192 |
| Лимфоциты, млн/мл | 2,2 (1,2; 2,5) | 1,9 (1,2; 2,1) | 0,368 |
| CD4+ Т-клетки (% от лимфоцитов) | 46,3 (37,5; 49,5) | 47,5 (43,5; 55,5) | 0,348 |
| Трег (CD4+CD25++, % от лимфоцитов) | 1,6 (1,1; 2,1) | 2,1 (1,7; 3,1) | 0,045 |
| CD39+CD278+ Трег (% от Трег) | 57,7 (30,5; 71,5) | 59,0 (54,0; 70,0) | 0,902 |
| CD45RA— Трег (% от Трег) | 80,5 (75,0; 87,0) | 75,0 (66,0; 85,0) | 0,103 |
| Тх-акт (CD4+CD25+, % от лимфоцитов) | 28,0 (18,7; 33,4) | 29,7 (22,4; 33,2) | 0,401 |
| Моноциты, тыс/мл | 373,0 (312,0; 429,0) | 275,0 (186,0; 385,0) | 0,072 |
| CD14++CD16—моноциты (тыс/мл) | 252,4 (1,99,8; 302,8) | 197,3 (123,1; 255,2) | 0,138 |
| CD14++CD16+ моноциты (тыс/мл) | 34,9 (26,8; 61,8) | 19,9 (12,3; 33,5) | 0,007 |
| CD14+CD16+ моноциты (тыс/мл) | 70,8 (59,4; 95,0) | 55,9 (37,3; 79,5) | 0,163 |
| CD14++CD16—CD42a+ комплексы (тыс/мл) | 96,9 (69,5; 170,0) | 95,6 (55,8; 150,0) | 0,892 |
| CD14++CD16+CD42a+ комплексы (тыс/мл) | 18,7 (11,6; 49,3) | 13,4 (70,3; 23,1) | 0,144 |
| CD14+CD16+CD42a+ комплексы (тыс/мл) | 14,1 (10,9; 19,9) | 18,8 (19,3; 28,9) | 0,787 |
Примечание. Трег — регуляторные Т-лимфоциты, Тх-акт — активированные Т-хелперные клетки.
По сравнению с пациентами с недиффузным поражением у пациентов с диффузным поражением КА нами отмечена тенденция к увеличению абсолютного количества циркулирующих моноцитов за счет расширения всех субпопуляций, при этом различия в абсолютном количестве промежуточных моноцитов (CD14++CD16+) были статистически значимыми (см. табл. 2). Количество промежуточных моноцитов, образующих комплексы с тромбоцитами (CD14++CD16+CD42a+), также было выше у пациентов этой группы, однако статистическая значимость не достигнута.
Обсуждение
Концепция, согласно которой иммуновоспалительные механизмы вносят фундаментальный вклад в развитие атеросклероза, известна уже более 20 лет. Липопротеины крови инициируют активацию врожденного иммунитета, в котором ведущую роль играют клетки моноцитарно-макрофагального ряда, а затем систему адаптивного иммунитета, регулируемую Т-лимфоцитами [2]. Наличие системного воспаления, детектируемого по повышенному уровню C-реактивного белка (больше 2 мг/л), может способствовать прогрессированию атеросклероза и развитию сердечно-сосудистых событий, что косвенно подтверждается положительным влиянием специфической противовоспалительной терапии на вторичную профилактику инфаркта миокарда, нарушения мозгового кровообращения и сердечно-сосудистой смертности [9]. При этом связь параметров иммунного воспаления с развитием тяжелого коронарного атеросклероза не изучалась.
В настоящем исследовании нами выполнена оценка показателей клеточного иммунитета у больных с двумя типами тяжелого коронарного атеросклероза — диффузным и сегментарным. Результаты исследования демонстрируют повышение количества циркулирующих промежуточных моноцитов в крови, в том числе образующих МТК, при диффузном поражении артерий. Полученные нами данные могут отражать интенсивность воспалительного процесса в стенке артерии и в целом согласуются с данными литературы об «атерогенности» моноцитов. Следует отметить, что в более ранних исследованиях (до 2010 г.) клетки с промежуточным фенотипом не выделяли в отдельную группу. По нашим данным, основную роль в развитии тяжелого коронарного атеросклероза могут играть именно промежуточные моноциты. В одном из недавних исследований выявлена корреляция между количеством циркулирующих промежуточных моноцитов в составе МТК и тяжестью коронарного атеросклероза [3]. Недостатком этой работы может быть осуществление забора образцов крови в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) в качестве антикоагулянта, что могло влиять на стабильность МТК. В нашем исследовании мы использовали цитратный антикоагулянт, доказав, что количество МТК не меняется при хранении образцов от 0 до 3 ч при комнатной температуре (данные не представлены). Полученные нами результаты свидетельствуют об увеличении количества циркулирующих комплексов «промежуточный моноцит—тромбоцит» при диффузном поражении КА, отсутствие статистической значимости, по-видимому, связано с небольшой численностью групп пациентов.
Известно, что прогрессирование атеросклероза может быть ассоциировано с дисбалансом субпопуляций эффекторных и регуляторных Т-клеток. Это показано, в частности, на примере брахиоцефальных и коронарных артерий [7, 10, 11]. Сниженное содержание циркулирующих Трег обнаружено у пациентов с острым коронарным синдромом по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией и интактными КА [12]. В широкомасштабном проспективном исследовании M. Wigren и соавт. продемонстрировано, что низкий уровень Трег является независимым фактором риска развития инфаркта миокарда в долгосрочной (до 15 лет) перспективе [13]. В настоящей работе мы впервые продемонстрировали относительный дефицит антиатерогенного регуляторного звена Т-клеточного иммунитета при диффузном поражении КА. По нашему мнению, подобные изменения клеточного иммунитета могут являться одним из факторов, обусловливающим развитие этого типа атеросклероза.
Ограничения
Среди ограничений данного исследования можно выделить малое количество пациентов, что обусловлено пилотным типом исследования. Из других ограничений определяется разнородность клинико-демографических параметров в анализируемых группах, при этом статистически значимых различий по этим параметрам не обнаружено.
Заключение
Диффузный тип поражения коронарных артерий ассоциирован с дисбалансом Т-клеточного иммунитета и снижением уровня антиатерогенных Трег. Повышение уровня промежуточных моноцитов, вероятно, ассоциируется с тяжестью воспалительного процесса в сосудистой стенке. Необходимо проведение дальнейших исследований для подтверждения полученных результатов на большей группе пациентов с дополнительной оценкой изучаемых параметров у здоровых лиц контрольной группы (без ишемической болезни сердца) для определения референсных параметров клеточного иммунитета.
Финансирование. Работа выполнена в рамках темы НИР АААА-А18-118022290040-7 «Изучение эффективности микрохирургических операций шунтирования, эндартерэктомии и реконструкции коронарных артерий у больных с диффузными коронарными поражениями, лимитирующими применение стандартных методов реваскуляризации миокарда».
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.