Маркеры карбонильного стресса и резервно-адаптационный потенциал тромбированной вены при остром венозном тромбозе в эксперименте

Стимуляция свободнорадикальных процессов является одним из важнейших неспецифических механизмов стрессорного повреждения клеток, тканей и органов, приводящих к окислительному стрессу (ОС). В последние несколько лет в литературе появился и получил распространение новый термин: «карбонильный стресс», который обозначает состояние, сопровождаемое увеличением содержания карбонильных продуктов свободнорадикального окисления. В условиях усиленного образования свободных радикалов происходит их взаимодействие с боковыми функциональными группами аминокислот, что ведет к окислительной модификации белков (ОМБ); образуются продукты первичного окисления и реактивные карбонильные производные, а также вторичные радикалы, которые в отличие от первичных не выполняют физиологически важных функций [1].

К карбонильным продуктам, образующимся в ходе метаболизма, относят кетоны, альдегиды, карбоновые кислоты, углеводы. Они способны подвергаться инактивации, взаимодействуя, в частности, с глутатионом, и могут образовывать вторичные продукты окисления, которые сами выступают в качестве источника активных форм кислорода и приводят к неспецифическим изменениям структуры и свойств мембран клеток [2].

Вследствие своей высокой реакционной способности альдегиды взаимодействуют с различными химическими компонентами клетки: белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами. Они образуют производные с белками, вступая в реакции с сульфгидрильными и аминогруппами аминокислот. Присоединение альдегида, т. е. карбонилирование белка, приводит к изменению его нативных свойств и нарушению функций [3].

Один из вариантов ОМБ — образование белковых агрегатов за счет появления межмолекулярных связей, чаще — дисульфидных. Второй вариант — фрагментация протеинов с распадом на вещества с низкой молекулярной массой. В обоих случаях протеины становятся более подверженными протеолитической деструкции и конформационным перестройкам. В ходе этого процесса образуются кетон-динитрофенилгидразоны (КДНФГ), являющиеся маркерами агрегации белковых молекул и более выраженной ступени развития ОС, и альдегид-динитрофенилгидразоны (АДНФГ), которые являются маркерами фрагментации и более легких стадий развития ОС [4].

Данные литературы [5] свидетельствуют о том, что карбонильный стресс представляет собой неспецифическое звено в патогенезе множества заболеваний человека вследствие того, что образующиеся в организме альдегиды обладают выраженным генотоксическим и цитотоксическим действием. Кардиоваскулярная патология не является исключением, с этой точки зрения давно было показано участие ОС в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы — атеросклероза, ишемической болезни сердца. Имеются и экспериментальные работы по моделированию ишемии — реперфузии и оценке карбонилирования белков при указанной патологии.

Острый венозный тромбоз глубоких вен нижних конечностей является важнейшей проблемой современной флебологической практики и одной из значимых причин инвалидизации и смертности населения. В нашей стране ежегодно регистрируется около 80 000 новых случаев заболевания. В пожилом и старческом возрасте частота тромбоза глубоких вен увеличивается в несколько раз и достигает 200 случаев на 100 000 населения в год [6]. В связи с этим своевременная диагностика острого тромбоза и поиск маркеров, позволяющих определить возможный риск для больного, приобретают серьезное значение. Активно изучаемыми и функционально значимыми в системе кровообращения являются сосудистая стенка и эндотелиальный гликокаликс (ЭГ) — слой разнообразных связанных с эндотелиальной мембраной макромолекул, которыми в условиях физиологической нормы покрыта люминальная поверхность эндотелиоцитов [7].

Механизм тромбогенной трансформации сосудистой стенки под действием свободных радикалов можно представить следующим образом: свободные радикалы активируют скорость апоптоза, окисление липопротеинов низкой плотности, образование ядерного транскрипционного фактора NF-κB. Последний с участием белков: ФНО-альфа, интерлейкинов, молекул адгезии, факторов роста, тканевого фактора — опосредует механизмы, способствующие тромбогенной трансформации сосудистой стенки. Происходит прокоагулянтная перестройка эндотелиоцитов: повышение экспрессии инициатора свертывания крови — тканевого фактора; повышение экспрессии адгезивных белков (Р-селектина, молекул адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа); снижение экспрессии тромбомодулина.

Защитная роль ЭГ, направленная против токсического действия оксидантов, заключается в его способности накапливать их, например фермент супероксиддисмутазу. Последняя, кроме своей основной функции — ускорения реакции дисмутации супероксида в пероксид водорода и кислород, способна поддерживать биодоступность оксида азота, сдерживая развитие эндотелиальной дисфункции [8]. Однако многие факторы, такие как гиперхолестеролемия, гипергликемия, воспаление, активные формы кислорода, факторы роста, действие пептидаз и гликозидаз, изменение напряжения сдвига, способны повреждать ЭГ [9].

Карбонильные производные белков, образующиеся в результате их окислительного повреждения, являются стабильными продуктами, в связи с чем используются как маркеры О.С. Можно предположить, что ОМБ, приводящая к агрегации и фрагментации молекул протеинов и вслед за этим к изменению их нативных свойств, патогенетически может быть связана с эндотелиальной дисфункцией вследствие того, что окисляемые белки входят в состав сложных комплексов гликопротеинов и протеогликанов, составляющих ЭГ. В связи с вышеизложенным интересными представляются работы по изучению вклада сосудистой стенки в патогенез различных патологических процессов при ОС [10]. Авторами ранее было проведено исследование по изучению ОМБ при экспериментальном моделировании венозного тромбоза, которую оценивали спектрофотометрически на отдельно взятых длинах волн без прицельного анализа первичных и вторичных маркеров ОС карбонильного стресса и корреляционного анализа данных [11].

Цель настоящей работы — оценка суммарного и процентного содержания первичных и вторичных маркеров ОС и суммарного резервно-адаптационного потенциала (РАП) ОМБ стенки тромбированных вен крыс в динамике экспериментального венозного тромбоза, а также выявление корреляционных связей между показателями ОМБ и РАП.

В моделирование венозного тромбоза были включены 3—4-месячные половозрелые конвенциональные крысы-самки линии Wistаr в количестве 24 особей, массой от 200 до 400 г. Материал для исследования представлен участком тромбированной вены ниже места лигирования. В качестве контроля использовали идентичные участки вен интактных крыс, сопоставимых с экспериментальными по массе, возрасту и условиям содержания.

Содержание и выведение животных из эксперимента проводили согласно приказу Минздрава России от 19.06.03 № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики» и Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985).

Моделирование острого венозного тромбоза у подопытных крыс осуществляли путем лигирования общей подвздошной вены конечности [12]. Все действия выполняли согласно протоколу подготовки гомогенатов тканей сосуда. Животное выводили из эксперимента, сосуды извлекали, очищали от жира, взвешивали, измельчали. Измельченную ткань сосуда переносили в холодный раствор сахарозы с концентрацией 0,25 М в соотношении 1:100. Производили гомогенизирование в течение 40 с при 900 об/мин в гомогенизаторе Potter S («Sartorius Stedium Biotech, GmbH», Германия) при температуре 4 °C.

Затем гомогенат ткани сосуда центрифугировали в течение 10 мин при 1000 g для осаждения неразрушенных клеток и ядер. В супернатант добавляли раствор Тритона Х-100 до конечной концентрации 0,1% для разрушения мембран органелл. Полученный раствор использовали в качестве материала для исследования.

Концентрацию белка в гомогенате определяли по методике Лоури с использованием стандартизированных коммерческих наборов [13].

Количество спонтанно окисленных белков в тканях измеряли по методу R. Levine [14] в вариации Е.Е. Дубининой и соавт. [15]. Карбонильные производные белки, образующиеся по металл-зависимому механизму, определяли по реакции Фентона [16]:

Fe²⁺ + Н₂О₂ = Fe³⁺ + ОН⁻ + ОН˙.

Подсчет общей площади под кривой спектра поглощения продуктов ОМБ (S ОМБ) проводили суммарно по авторской методике [17]. Значения, полученные при измерении карбонильных производных, образовавшихся при спонтанном и металл-зависимом (индуцированном) окислении, использовали для вычисления показателя РАП [18].

Статистическую обработку полученных данных проводили методами непараметрической статистики с использованием пакетов прикладных программ Statistica 6.0. Для определения статистической значимости различий непрерывных величин в зависимости от параметров их распределения использовали U-критерий Манна—Уитни. Для изучения зависимостей между переменными использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Непрерывные переменные представлены в виде M±s (среднее ± стандартное отклонение). Значимыми считали отличия при р<0,05.

На 1-е, 3-и и 5-е сутки моделирования венозного тромбоза в стенке тромбированных вен отмечали значительное повышение суммы как первичных маркеров ОС — АДНФГ (нейтрального и основного характера: АДНФГн. и АДНФГо.), так и вторичных — КДНФГ (нейтрального и основного характера: КДНФГн. и КДНФГо.) (см. таблицу).

В динамике настоящего эксперимента было отмечено, что максимальное увеличение содержания карбонилированных белков было зафиксировано на 1-е сутки; на 3-и сутки отмечали уменьшение суммарного содержания ОМБ по сравнению с 1-ми сутками, но уровень не достигал исходных контрольных значений. На 5-е сутки отмечали новый подъем, уровень которого не достигал значений 1-х суток на всех длинах волн.

Исследование соотношения АДНФГ и КДНФГ дает возможность сопоставить первичные и вторичные маркеры ОМБ, определить стадию и потенциальный путь конформации нативных белковых молекул при развитии ОС, спрогнозировать его течение в аспекте обратимости [4]. При моделировании острого венозного тромбоза в динамике эксперимента мы отметили, что 1-е и 5-е сутки характеризуются повышением в большей степени первичных маркеров, 3-и сутки — повышением вторичных маркеров, что свидетельствует о более выраженном повреждении белков (рис. 1).

При изучении РАП было отмечено, что минимальное его значение приходится на 1-е сутки, а максимальное — на 3-и сутки эксперимента по сравнению с контрольными значениями (рис. 2).

Корреляционный анализ содержания первичных и вторичных маркеров ОС и значения РАП продемонстрировал статистически значимую прямую линейную корреляцию среднего уровня содержания АДНФГ и РАП, коэффициент корреляции составил 0,61 (р=0,02).

Повышение степени интенсивности ОМБ может рассматриваться как первичная компенсаторная реакция организма, направленная на повышение общего резерва системы антиоксидантной защиты. В то же время ОМБ может стать одной из причин ингибирования активности ферментативного звена антиоксидантной защиты и инактивации ферментов митохондрий, что еще в большей степени может повысить утечку электронов из дыхательной цепи, продукцию свободных радикалов и усугубить течение ОС.

Ранее в морфологических работах по моделированию экспериментального тромбоза было отмечено, что в 1-е сутки можно наблюдать повреждение клеточных мембран эндотелиоцитов и набухание самих клеток [10]. Подвергшиеся карбонилированию протеины, во-первых, усиливают процессы деградации белков, что способствует активации процессов деструкции в месте образования тромба. Во-вторых, окисленные белки способны сами выступать в качестве источника свободных радикалов и исчерпывают запасы внутриклеточных антиоксидантов. Наблюдается развитие гипоксии и гипоэнергетического состояния, приводящего к недостаточности натрий-калиевого насоса и ухудшению работы ионных каналов. Одновременно отмечается массивная лейкоцитарная инфильтрация венозной стенки. Активированные лейкоциты выделяют пептидазы, а их трансэндотелиальная миграция способствует массивному отторжению эндотелиальных клеток. Все вышеперечисленное приводит к развитию дисфункции эндотелия.

По снижению суммы АДНФГ и КДНФГ в тромбированной вене на 3-и сутки можно судить о возможной активации агентов антиоксидантной защиты. Такими агентами могут явиться классические ферментные антиоксиданты: супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза [19]. Многие авторы рассматривают карбонилирование как один из способов регуляции контроля качества и процессов правильной укладки белков в пространстве, в связи с тем что карбонилированные белки могут распознаваться пептидазами и системой убиквитинирования. Поэтому снижение их уровня можно считать негативным моментом с точки зрения узнавания белков, подлежащих утилизации.

В данном исследовании суммарное содержание ОМБ в образовавшихся в результате спонтанной ОМБ тромбированных венах на 1-е, 3-и и 5-е сутки экспериментального венозного тромбоза превышало уровень контрольных значений. Суммарное содержание первичных и вторичных маркеров ОС — АДНФГ и КДНФГ в тромбированной вене в динамике экспериментального венозного тромбоза не было стабильным — отмечено увеличение АДНФГ на 1-е и 5-е сутки моделирования тромбоза с тенденцией к увеличению также и на 3-и сутки. КДНФГ демонстрировали обратную динамику: снижались на 1-е и 5-е сутки, имели тенденцию к снижению на 3-и сутки. РАП тромбированной вены снижался на 1-е и 5-е сутки, повышался на 3-и сутки по сравнению с 1-ми и 5-ми сутками, оставаясь статистически значимо ниже уровня контрольных значений. Мы выявили корреляцию средней степени между суммарным содержанием первичных маркеров повреждения белка АДНФГ и РАП тромбированной вены.

В работе показано, что острый венозный тромбоз в эксперименте сопровождается динамическим изменением общего суммарного содержания продуктов ОМБ, снижением первичных и повышением вторичных маркеров ОС на 3-и сутки по сравнению с 1-ми и 5-ми сутками; в те же сроки повышается резервно-адаптационный потенциал, что может свидетельствовать о вовлеченности карбонилированных белков в патогенез указанной патологии.

Участиеавторов:

Концепция и дизайн исследования — М.Ф., И.С.

Сбор и обработка материала — Н.К., М.Ф.

Статистическая обработка — Н.К.

Написание текста — Н.К., М.Ф.

Редактирование — И.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Короткова Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-7974-2450

Сучков И.А.— https://orcid.org/ 0000-0002-1292-5452; e-mail: Suchkov_med@mail.ru

Фомина М.А. — https://orcid.org/ 0000 0001 5550 0625

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Короткова Н.В., Сучков И.А., Фомина М.А. Маркеры карбонильного стресса и резервно-адаптационный потенциал тромбированной вены при остром венозном тромбозе в эксперименте. Флебология. 2019;13(4):-283. https://doi.org/10.17116/flebo201913041

Автор, ответственный за переписку: Сучков И.А. —
e-mail: Suchkov_med@mail.ru