Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Короткова Н.В.

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова», Рязань, Россия

Сучков И.А.

ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России, Рязань

Фомина М.А.

ФГБОУ ВО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова», Рязань, Россия

Маркеры карбонильного стресса и резервно-адаптационный потенциал тромбированной вены при остром венозном тромбозе в эксперименте

Авторы:

Короткова Н.В., Сучков И.А., Фомина М.А.

Подробнее об авторах

Журнал: Флебология. 2019;13(4): 278‑284

Просмотров: 488

Загрузок: 25

Как цитировать:

Короткова Н.В., Сучков И.А., Фомина М.А. Маркеры карбонильного стресса и резервно-адаптационный потенциал тромбированной вены при остром венозном тромбозе в эксперименте. Флебология. 2019;13(4):278‑284.
Korotkova NV, Suchkov IA, Fomina MA. Markers of Carbonyl Stress and Reserve Adaptive Capacity of Thrombosed Vein in Experimental Acute Venous Thrombosis. Flebologiya. 2019;13(4):278‑284. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/flebo201913041278

?>

Введение

Стимуляция свободнорадикальных процессов является одним из важнейших неспецифических механизмов стрессорного повреждения клеток, тканей и органов, приводящих к окислительному стрессу (ОС). В последние несколько лет в литературе появился и получил распространение новый термин: «карбонильный стресс», который обозначает состояние, сопровождаемое увеличением содержания карбонильных продуктов свободнорадикального окисления. В условиях усиленного образования свободных радикалов происходит их взаимодействие с боковыми функциональными группами аминокислот, что ведет к окислительной модификации белков (ОМБ); образуются продукты первичного окисления и реактивные карбонильные производные, а также вторичные радикалы, которые в отличие от первичных не выполняют физиологически важных функций [1].

К карбонильным продуктам, образующимся в ходе метаболизма, относят кетоны, альдегиды, карбоновые кислоты, углеводы. Они способны подвергаться инактивации, взаимодействуя, в частности, с глутатионом, и могут образовывать вторичные продукты окисления, которые сами выступают в качестве источника активных форм кислорода и приводят к неспецифическим изменениям структуры и свойств мембран клеток [2].

Вследствие своей высокой реакционной способности альдегиды взаимодействуют с различными химическими компонентами клетки: белками, углеводами, нуклеиновыми кислотами. Они образуют производные с белками, вступая в реакции с сульфгидрильными и аминогруппами аминокислот. Присоединение альдегида, т. е. карбонилирование белка, приводит к изменению его нативных свойств и нарушению функций [3].

Один из вариантов ОМБ — образование белковых агрегатов за счет появления межмолекулярных связей, чаще — дисульфидных. Второй вариант — фрагментация протеинов с распадом на вещества с низкой молекулярной массой. В обоих случаях протеины становятся более подверженными протеолитической деструкции и конформационным перестройкам. В ходе этого процесса образуются кетон-динитрофенилгидразоны (КДНФГ), являющиеся маркерами агрегации белковых молекул и более выраженной ступени развития ОС, и альдегид-динитрофенилгидразоны (АДНФГ), которые являются маркерами фрагментации и более легких стадий развития ОС [4].

Данные литературы [5] свидетельствуют о том, что карбонильный стресс представляет собой неспецифическое звено в патогенезе множества заболеваний человека вследствие того, что образующиеся в организме альдегиды обладают выраженным генотоксическим и цитотоксическим действием. Кардиоваскулярная патология не является исключением, с этой точки зрения давно было показано участие ОС в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы — атеросклероза, ишемической болезни сердца. Имеются и экспериментальные работы по моделированию ишемии — реперфузии и оценке карбонилирования белков при указанной патологии.

Острый венозный тромбоз глубоких вен нижних конечностей является важнейшей проблемой современной флебологической практики и одной из значимых причин инвалидизации и смертности населения. В нашей стране ежегодно регистрируется около 80 000 новых случаев заболевания. В пожилом и старческом возрасте частота тромбоза глубоких вен увеличивается в несколько раз и достигает 200 случаев на 100 000 населения в год [6]. В связи с этим своевременная диагностика острого тромбоза и поиск маркеров, позволяющих определить возможный риск для больного, приобретают серьезное значение. Активно изучаемыми и функционально значимыми в системе кровообращения являются сосудистая стенка и эндотелиальный гликокаликс (ЭГ) — слой разнообразных связанных с эндотелиальной мембраной макромолекул, которыми в условиях физиологической нормы покрыта люминальная поверхность эндотелиоцитов [7].

Механизм тромбогенной трансформации сосудистой стенки под действием свободных радикалов можно представить следующим образом: свободные радикалы активируют скорость апоптоза, окисление липопротеинов низкой плотности, образование ядерного транскрипционного фактора NF-κB. Последний с участием белков: ФНО-альфа, интерлейкинов, молекул адгезии, факторов роста, тканевого фактора — опосредует механизмы, способствующие тромбогенной трансформации сосудистой стенки. Происходит прокоагулянтная перестройка эндотелиоцитов: повышение экспрессии инициатора свертывания крови — тканевого фактора; повышение экспрессии адгезивных белков (Р-селектина, молекул адгезии сосудистого эндотелия 1-го типа); снижение экспрессии тромбомодулина.

Защитная роль ЭГ, направленная против токсического действия оксидантов, заключается в его способности накапливать их, например фермент супероксиддисмутазу. Последняя, кроме своей основной функции — ускорения реакции дисмутации супероксида в пероксид водорода и кислород, способна поддерживать биодоступность оксида азота, сдерживая развитие эндотелиальной дисфункции [8]. Однако многие факторы, такие как гиперхолестеролемия, гипергликемия, воспаление, активные формы кислорода, факторы роста, действие пептидаз и гликозидаз, изменение напряжения сдвига, способны повреждать ЭГ [9].

Карбонильные производные белков, образующиеся в результате их окислительного повреждения, являются стабильными продуктами, в связи с чем используются как маркеры О.С. Можно предположить, что ОМБ, приводящая к агрегации и фрагментации молекул протеинов и вслед за этим к изменению их нативных свойств, патогенетически может быть связана с эндотелиальной дисфункцией вследствие того, что окисляемые белки входят в состав сложных комплексов гликопротеинов и протеогликанов, составляющих ЭГ. В связи с вышеизложенным интересными представляются работы по изучению вклада сосудистой стенки в патогенез различных патологических процессов при ОС [10]. Авторами ранее было проведено исследование по изучению ОМБ при экспериментальном моделировании венозного тромбоза, которую оценивали спектрофотометрически на отдельно взятых длинах волн без прицельного анализа первичных и вторичных маркеров ОС карбонильного стресса и корреляционного анализа данных [11].

Цель настоящей работы — оценка суммарного и процентного содержания первичных и вторичных маркеров ОС и суммарного резервно-адаптационного потенциала (РАП) ОМБ стенки тромбированных вен крыс в динамике экспериментального венозного тромбоза, а также выявление корреляционных связей между показателями ОМБ и РАП.

Материал и методы

В моделирование венозного тромбоза были включены 3—4-месячные половозрелые конвенциональные крысы-самки линии Wistаr в количестве 24 особей, массой от 200 до 400 г. Материал для исследования представлен участком тромбированной вены ниже места лигирования. В качестве контроля использовали идентичные участки вен интактных крыс, сопоставимых с экспериментальными по массе, возрасту и условиям содержания.

Содержание и выведение животных из эксперимента проводили согласно приказу Минздрава России от 19.06.03 № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики» и Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985).

Моделирование острого венозного тромбоза у подопытных крыс осуществляли путем лигирования общей подвздошной вены конечности [12]. Все действия выполняли согласно протоколу подготовки гомогенатов тканей сосуда. Животное выводили из эксперимента, сосуды извлекали, очищали от жира, взвешивали, измельчали. Измельченную ткань сосуда переносили в холодный раствор сахарозы с концентрацией 0,25 М в соотношении 1:100. Производили гомогенизирование в течение 40 с при 900 об/мин в гомогенизаторе Potter S («Sartorius Stedium Biotech, GmbH», Германия) при температуре 4 °C.

Затем гомогенат ткани сосуда центрифугировали в течение 10 мин при 1000 g для осаждения неразрушенных клеток и ядер. В супернатант добавляли раствор Тритона Х-100 до конечной концентрации 0,1% для разрушения мембран органелл. Полученный раствор использовали в качестве материала для исследования.

Концентрацию белка в гомогенате определяли по методике Лоури с использованием стандартизированных коммерческих наборов [13].

Количество спонтанно окисленных белков в тканях измеряли по методу R. Levine [14] в вариации Е.Е. Дубининой и соавт. [15]. Карбонильные производные белки, образующиеся по металл-зависимому механизму, определяли по реакции Фентона [16]:

Fe2+ + Н2О2 = Fe3+ + ОН+ ОН˙.

Подсчет общей площади под кривой спектра поглощения продуктов ОМБ (S ОМБ) проводили суммарно по авторской методике [17]. Значения, полученные при измерении карбонильных производных, образовавшихся при спонтанном и металл-зависимом (индуцированном) окислении, использовали для вычисления показателя РАП [18].

Статистическую обработку полученных данных проводили методами непараметрической статистики с использованием пакетов прикладных программ Statistica 6.0. Для определения статистической значимости различий непрерывных величин в зависимости от параметров их распределения использовали U-критерий Манна—Уитни. Для изучения зависимостей между переменными использовали коэффициент ранговой корреляции Спирмена. Непрерывные переменные представлены в виде M±s (среднее ± стандартное отклонение). Значимыми считали отличия при р<0,05.

Результаты

На 1-е, 3-и и 5-е сутки моделирования венозного тромбоза в стенке тромбированных вен отмечали значительное повышение суммы как первичных маркеров ОС — АДНФГ (нейтрального и основного характера: АДНФГн. и АДНФГо.), так и вторичных — КДНФГ (нейтрального и основного характера: КДНФГн. и КДНФГо.) (см. таблицу).

Изменение суммарного содержания продуктов спонтанной окислительной модификации белков в динамике острого венозного тромбоза, ед.опт.пл./г белка Примечание. * — статистически значимые отличия от контрольной группы (р<0,05).

В динамике настоящего эксперимента было отмечено, что максимальное увеличение содержания карбонилированных белков было зафиксировано на 1-е сутки; на 3-и сутки отмечали уменьшение суммарного содержания ОМБ по сравнению с 1-ми сутками, но уровень не достигал исходных контрольных значений. На 5-е сутки отмечали новый подъем, уровень которого не достигал значений 1-х суток на всех длинах волн.

Исследование соотношения АДНФГ и КДНФГ дает возможность сопоставить первичные и вторичные маркеры ОМБ, определить стадию и потенциальный путь конформации нативных белковых молекул при развитии ОС, спрогнозировать его течение в аспекте обратимости [4]. При моделировании острого венозного тромбоза в динамике эксперимента мы отметили, что 1-е и 5-е сутки характеризуются повышением в большей степени первичных маркеров, 3-и сутки — повышением вторичных маркеров, что свидетельствует о более выраженном повреждении белков (рис. 1).

Рис. 1. Динамика изменения процентного соотношения первичных и вторичных маркеров окислительной модификации белков сосудистой стенки при экспериментальном венозном тромбозе.

При изучении РАП было отмечено, что минимальное его значение приходится на 1-е сутки, а максимальное — на 3-и сутки эксперимента по сравнению с контрольными значениями (рис. 2).

Рис. 2. Изменение резервно-адаптационного потенциала венозной стенки в динамике острого венозного тромбоза в эксперименте.

Корреляционный анализ содержания первичных и вторичных маркеров ОС и значения РАП продемонстрировал статистически значимую прямую линейную корреляцию среднего уровня содержания АДНФГ и РАП, коэффициент корреляции составил 0,61 (р=0,02).

Обсуждение

Повышение степени интенсивности ОМБ может рассматриваться как первичная компенсаторная реакция организма, направленная на повышение общего резерва системы антиоксидантной защиты. В то же время ОМБ может стать одной из причин ингибирования активности ферментативного звена антиоксидантной защиты и инактивации ферментов митохондрий, что еще в большей степени может повысить утечку электронов из дыхательной цепи, продукцию свободных радикалов и усугубить течение ОС.

Ранее в морфологических работах по моделированию экспериментального тромбоза было отмечено, что в 1-е сутки можно наблюдать повреждение клеточных мембран эндотелиоцитов и набухание самих клеток [10]. Подвергшиеся карбонилированию протеины, во-первых, усиливают процессы деградации белков, что способствует активации процессов деструкции в месте образования тромба. Во-вторых, окисленные белки способны сами выступать в качестве источника свободных радикалов и исчерпывают запасы внутриклеточных антиоксидантов. Наблюдается развитие гипоксии и гипоэнергетического состояния, приводящего к недостаточности натрий-калиевого насоса и ухудшению работы ионных каналов. Одновременно отмечается массивная лейкоцитарная инфильтрация венозной стенки. Активированные лейкоциты выделяют пептидазы, а их трансэндотелиальная миграция способствует массивному отторжению эндотелиальных клеток. Все вышеперечисленное приводит к развитию дисфункции эндотелия.

По снижению суммы АДНФГ и КДНФГ в тромбированной вене на 3-и сутки можно судить о возможной активации агентов антиоксидантной защиты. Такими агентами могут явиться классические ферментные антиоксиданты: супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза [19]. Многие авторы рассматривают карбонилирование как один из способов регуляции контроля качества и процессов правильной укладки белков в пространстве, в связи с тем что карбонилированные белки могут распознаваться пептидазами и системой убиквитинирования. Поэтому снижение их уровня можно считать негативным моментом с точки зрения узнавания белков, подлежащих утилизации.

В данном исследовании суммарное содержание ОМБ в образовавшихся в результате спонтанной ОМБ тромбированных венах на 1-е, 3-и и 5-е сутки экспериментального венозного тромбоза превышало уровень контрольных значений. Суммарное содержание первичных и вторичных маркеров ОС — АДНФГ и КДНФГ в тромбированной вене в динамике экспериментального венозного тромбоза не было стабильным — отмечено увеличение АДНФГ на 1-е и 5-е сутки моделирования тромбоза с тенденцией к увеличению также и на 3-и сутки. КДНФГ демонстрировали обратную динамику: снижались на 1-е и 5-е сутки, имели тенденцию к снижению на 3-и сутки. РАП тромбированной вены снижался на 1-е и 5-е сутки, повышался на 3-и сутки по сравнению с 1-ми и 5-ми сутками, оставаясь статистически значимо ниже уровня контрольных значений. Мы выявили корреляцию средней степени между суммарным содержанием первичных маркеров повреждения белка АДНФГ и РАП тромбированной вены.

Заключение

В работе показано, что острый венозный тромбоз в эксперименте сопровождается динамическим изменением общего суммарного содержания продуктов ОМБ, снижением первичных и повышением вторичных маркеров ОС на 3-и сутки по сравнению с 1-ми и 5-ми сутками; в те же сроки повышается резервно-адаптационный потенциал, что может свидетельствовать о вовлеченности карбонилированных белков в патогенез указанной патологии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — М.Ф., И.С.

Сбор и обработка материала — Н.К., М.Ф.

Статистическая обработка — Н.К.

Написание текста — Н.К., М.Ф.

Редактирование — И.С.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Короткова Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-7974-2450

Сучков И.А.— https://orcid.org/ 0000-0002-1292-5452; e-mail: Suchkov_med@mail.ru

Фомина М.А. — https://orcid.org/ 0000 0001 5550 0625

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Короткова Н.В., Сучков И.А., Фомина М.А. Маркеры карбонильного стресса и резервно-адаптационный потенциал тромбированной вены при остром венозном тромбозе в эксперименте. Флебология. 2019;13(4):-283. https://doi.org/10.17116/flebo201913041

Автор, ответственный за переписку: Сучков И.А. —
e-mail: Suchkov_med@mail.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail