Эпителиальные неоплазии внепеченочных желчных протоков (ВЖП) — это гетерогенная группа поражений, развивающаяся из билиарного эпителия, включающая в себя предраковые изменения ВЖП и холангиоцеллюлярный рак (ХЦР) [1]. К предраковым изменениям относят билиарную интраэпителиальную неоплазию низкой/высокой степени (Biliary intraepithelial neoplasia low-grade/high-grade (BilIN LG/HG)) и внутрипротоковую папиллярную неоплазию низкой/высокой степени (Intraductal papillary neoplasm of the bile duct low-grade/high-grade (IPNB LG/HG)) [1, 2]. В свою очередь BilIN и IPNB увеличивают риски развития ХЦР до 160 раз и влияют на отдаленный прогноз течения заболевания [2, 3]. Исследования последних лет направлены на изучение молекулярно-генетических нарушений при ХЦР [4, 5]. Так, например, были выделены 4 молекулярных класса ХЦР (метаболический, иммунный, пролиферативный и мезенхимальный), различающихся между собой по драйверным мутациям, микроокружению и чувствительности к таргетной терапии [6, 7]. Системные данные о молекулярно-генетических изменениях при предраковых состояниях ВЖП ограничены и носят противоречивый характер, что не позволяет сформировать единую концепцию перехода от дисплазии низкой степени к инвазивной карциноме [8—11]. Подобные данные и вовсе не приводят к дифференциальной диагностике эпителиальных неоплазий ВЖП на материале щипцовых биоптатов.

В настоящее время представлены единичные сведения, позволяющие провести дифференциальную гистологическую и иммуногистохимическую (ИГХ) диагностику типов/подтипов эпителиальных неоплазий ВЖП в зависимости от степени дисплазии их эпителия на малом объеме диагностически значимого материала.

При морфологическом и ИГХ-анализе щипцовых биоптатов ВЖП среди врачей-патологоанатомов возникают наибольшие трудности при дифференциальной диагностике воспалительных изменений и BilIN LG, IPNB HG и раннего ХЦР. При этом применение гистологических и ИГХ-критериев дифференциальной диагностики ограничено из-за критически малого объема материала. Так, дополнительная молекулярно-генетическая диагностика щипцовых биоптатов ВЖП может позволить разработать более четкие диагностические алгоритмы и улучшить понимание перехода «дисплазия-рак».

Цель — определить молекулярно-генетические характеристики эпителиальных неоплазий ВЖП в зависимости от степени дисплазии эпителия с целью выявления мутаций, способствующих их дифференциальной диагностике.

Материал и методы

Исследование проводилось на материале щипцовых биоптатов ВЖП от 44 пациентов за период с 2014 по 2024 г. На первом этапе исследования был выполнен пересмотр предшествующих патолого-анатомических заключений. Пересмотр проводился с учетом критериев ВОЗ-2019 и результатов консенсуса по оценке биоптатов ВЖП [1, 12]. По результатам пересмотра материала были сформированы исследуемые группы: BilIN LG (n=14), BilIN HG (n=2), IPNB LG (n=4), IPNB HG (n=3), ХЦР (n=21). На втором этапе исследования проводили молекулярно-генетическое исследование (МГИ) путем массивного параллельного секвенирования. МГИ выполняли на ДНК, выделенной из гистологических срезов толщиной 10 мкм, полученных из парафиновых блоков архивного материала, при этом структуры эпителиальных неоплазий ВЖП должны были занимать 20% и более от площади гистологического среза. Все образцы подверглись секвенированию с использованием панели Human Tumor 84 Gene Mutation Detection (TIANLONG, КНР). Секвенирование полученных библиотек проводили на платформе Genolab M (Genemind, КНР). Оценку результатов секвенирования осуществляли с использованием программных продуктов компаний-производителей. При проведении МГИ учитывали мутации, значимые для холангиоканцерогенеза, с любой аллельной частотой встречаемости для I категории с высокой клинической значимостью, для II категории с потенциальной клинической значимостью 3% и для III категории с неясной клинической значимостью 5%. Для I и II категорий учитывали мутации с любым механизмом возникновения, для III категории — только специфические мутации: амплификацию, нарушение рамки считывания, стоп-кодон, нарушение сплайсинга.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программного обеспечения Statistica 12.6 (IBM SPSS Statistics 23, США) и Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corp., США). При сравнении двух независимых групп по категориальным показателям применяли двусторонний критерий χ² Пирсона. При множественном сравнении признаков между исследуемыми группами использовали поправку Холма. Статистически достоверными различия рассчитывали при уровне p<0,045. Кластеризацию молекулярно-генетических типов неоплазий проводили с помощью метода иерархической агломеративной кластеризации по методу Варда.

Результаты исследования

При проведении МГИ были получены подробные молекулярно-генетические характеристики для всех типов эпителиальных неоплазий ВЖП (см. таблицу; рис. 1). Наиболее частыми мутациями среди неоплазий являлись мутации следующих генов: MYC 27/155 (17%) мутаций, KRAS 14/155 (9%) мутаций, PIK3CA 9/155 (9%) мутаций, CDKN2A 7/155 (5%) мутаций, ERBB2 7/155 (5%) мутаций, KIT 6/155 (4%) мутаций, TP53 6/155 (4%) мутаций, FBXW7 6/155 (4%) мутаций, POLE 6/155 (4%) мутаций, TERT 5/155 (3%) мутаций и др.

Молекулярно-генетическая характеристика эпителиальных неоплазий внепеченочных желчных протоков

Рис. 1. Распределение мутаций среди эпителиальных неоплазий внепеченочных желчных протоков.

а — мутации, выявленные при геномном секвенировании эпителиальных неоплазий внепеченочных желчных протоков; б — распределение мутаций среди исследуемых групп: 1 — BilIN LG, 2 — BilIN HG, 3 — IPNB LG, 4 — IPNB HG, 5 — ХЦР; в — динамика изменений распределения мутаций среди эпителиальных неоплазий внепеченочных желчных протоков; г — динамика изменений статистически значимых мутаций среди эпителиальных неоплазий внепеченочных желчных протоков.

При этом на долю BilIN LG приходилось 68/155 (44%) мутаций от их общего количества, при ХЦР были выявлены 53/155 (34%) мутаций, 16/155 (10%) мутаций было обнаружено среди наблюдений IPNB LG, 10/155 (7%) мутаций — при IPNB HG и 7/155 (5%) мутаций — при BilIN HG (см. рис. 1).

При BilIN LG чаще других определялись мутации MYC 11/14 (79%) случаев, KRAS 5/14 (35%) случаев, TERT 5/14 (35%) случаев, POLE 5/14 (35%) случаев, PIK3CA 5/14 (35%) случаев, FBXW7 4/14 (29%) случаев, а мутации SMAD4 выявлены не были.

В 2/2 (100%) случаев BilIN HG были выявлены мутации MYC, мутации SMAD4 и KRAS определялись в половине случаев.

IPNB LG характеризовалась наличием мутаций MYC в 2/4 (50%) случаев, мутации KRAS, TP53, BRAF, PIK3CA, SMAD4 и POLE определялись в 25% наблюдений.

Мутационный профиль IPNB HG отличался от других групп равномерностью изменений. Мутации MYC, KRAS, CTNNB1, SMAD4, FBXW7, PIK3CA были обнаружены в 1/3 случаев.

ХЦР характеризовалась высокой гетерогенностью мутационного профиля, как и BilIN LG. Так, для ХЦР чаще других определялись мутации MYC 11/21 (52%) случая, CDKN2A 6/21 (29%) случая, KRAS 5/21 (24%) случая, ERBB2 3/21 (14%) случая.

Статистически значимо среди исследуемых групп отличались мутации KRAS (p<0,045) — BilIN LG и BilIN HG, IPNB HG и ХЦР; POLE (p<0,045) — BilIN LG и ХЦР; TERT (p<0,045) — BilIN LG и ХЦР.

Показатели специфичности и чувствительности для KRAS составили 28 и 50%; для POLE — 35 и 100%; для TERT — 100 и 100%.

Обсуждение

Ранее в исследовании по изучению гистологических и ИГХ- характеристик эпителиальных неоплазий ВЖП мы приводили подробные данные для всех типов неоплазий. На основании этих данных была сформирована шкала по оценке степени дисплазии эпителия и сформированы алгоритмы дифференциальной диагностики с применением ИГХ-маркеров. Было принято решение продолжить исследование с целью выявления мутаций, способствующих пониманию многоступенчатого холангиоканцерогенеза и улучшению дифференциальной диагностики эпителиальных неоплазий ВЖП.

При анализе клинической значимости выявленных мутаций отмечено, что мутации I категории с высокой клинической значимостью были выявлены только при ХЦР 1/53 (2%) мутаций (см. рис. 1, в). Динамика изменений мутаций II категории вариабельна среди эпителиальных неоплазий ВЖП. Так, отмечается не только уменьшение числа мутаций при переходе дисплазии низкой степени в дисплазию высокой степени, но и резкое нарастание числа мутаций II категории при ХЦР — 22/53 (42%) мутаций (см. рис. 1, в). Наибольше количество мутаций III категории выявлено среди наблюдений BilIN LG (см. рис. 1, в).

Высокая частота встречаемости мутаций среди эпителиальных неоплазий ВЖП с дисплазий эпителия низкой степени, особенно при BilIN LG, может быть связана с тем, что в условиях хронического воспаления возникает множество клонов с различными мутациями. Однако для дальнейшего прогрессирования требуется весьма специфический набор мутаций. Например, при ХЦР увеличивается количество мутаций KRAS, CDKN2A, BRAF.

Среди статистически значимых изменений были отмечены мутации KRAS, POLE и TERT.

Мутации KRAS значимо изменялись между BilIN LG и BilIN HG (p<0,045); IPNB HG и ХЦР (p<0,045). Среди IPNB LG доля мутаций KRAS составила 1/9 (11%) мутаций. Среди всех групп частота мутаций KRAS остается достаточно стабильной и сохраняется при прогрессировании BilIN LG в BilIN HG и IPNB HG в ХЦР. Данное наблюдение показывает, что мутации KRAS являются достаточно ранним событием при эпителиальных неоплазиях ВЖП (см. рис. 1) [8, 9, 13, 14]. В данном случае наличие мутации KRAS можно использовать в качестве диагностического признака при дифференциальной диагностике щипцовых биоптатов, содержащих структуры IPNB HG при подозрении на ХЦР.

Значимые изменения мутации POLE наблюдались только между BilIN LG и ХЦР (p<0,045). В настоящее время описаны мутации POLE для колоректального рака, эндометриоидных аденокарцином тела матки и менингиом [15—18]. Данные о мутациях POLE при поражениях ВЖП в мировой литературе не описаны. В этом случае мы можем лишь предположить, что мутация POLE возникает на самых ранних этапах развития BilIN LG, не является драйверной, но может оказывать влияние на холангикоанцерогенез. Так, 5/5 (100%) мутаций POLE при BilIN LG являлись онкогенными (oncogenic/likely oncogenic).

Таким образом, полученные данные о наличии/отсутствии мутации POLE могут улучшить дифференциальную диагностику воспалительных изменений ВЖП, BilIN LG и ХЦР. Например, при дифференциальной диагностике реактивно измененного эпителия ВЖП и BilIN HG наличие псведопапиллярных/микропапиллярных структур в биоптате и мутации POLE будет свидетельствовать о BilIN LG. В свою очередь при содержании в биоптате структур, требующих дифференциальной диагностики между реактивными изменениями (особенно в перибилиарных железах , в том числе при многократных эндоскопических вмешательствах) и фокусами, подозрительными в отношении инвазивного роста, отсутствие мутации POLE будет выступать в пользу более поздних генетических нарушений, характерных для ХЦР.

Мутации гена TERT, так же как и мутации POLE, были характерны только для BilIN LG и значимы для BilIN LG и ХЦР (p<0,045). Это наблюдение объясняется тем, что для перихилярных и дистальных форм ХЦР нехарактерна мутация TERT в отличие от внутрипеченочных ХЦР [19].

При анализе результатов МГИ были выявлены мутации, позволяющие отличить BilIN от IPNB. При BilIN LG/HG наблюдалось преобладание мутаций MYC и появление мутаций POLE, TERT, PIK3CA. Частота установленных мутаций KRAS составила 30% при BilIN LG и 50%при BilIN HG. При IPNB LG/HG отмечалось снижение частоты встречаемости мутаций MYC и появление мутаций CTNNB1, что должно приводить к активации сигнального пути Wnt-b-catenin [20]. Выявленные отличия могут иметь практическое значение при исследовании биоптатов малых размеров и точно определять тип неоплазии ВЖП, что влияет на тактику ведения пациентов. Так, при BilIN LG допустимо динамическое наблюдение за пациентом, а при IPNB LG/HG требуется резекция ВЖП с целью купирования явлений подпеченочной желтухи и снижения рисков прогрессирования IPNB в ХЦР [2].

Дополнительно был проведен гипотетический групповой (син. кластерный) анализ мутированных генов среди BilIN LG и ХЦР, так как в этих группах было наибольшее число наблюдений.

Так, среди случаев ХЦР можно было выделить 2 группы наблюдений, сформированных на основании общих мутаций. Первая группа ХЦР характеризовалась преобладанием мутаций MYC, CDKN2A и ERBB2. Это дает возможность отнести случаи из 1-й группы к пролиферативному классу ХЦР и предположить благоприятный прогноз течения заболевания и высокую чувствительность к таргетным препаратам [6]. Во 2-й группе ХЦР преобладали мутации KRAS, TP53 и EGFR. Преобладание данных мутаций подразумевает более агрессивное течение ХЦР и развитие лекарственной устойчивости к 5-фторурацилу и гемцитабину [6, 20] (рис. 2).

Рис. 2. Кластеризация мутаций, выявленных среди эпителиальных неоплазий внепеченочных желчных протоков.

а — кластеры внепеченочной холангиокарциномы; б — тепловая карта мутаций, выявленных при внепеченочной холангиокарциноме; в — кластеры BilIN LG; г — тепловая карта мутаций, выявленных при BilIN LG.

При анализе тепловой карты ХЦР было выявлено, что для ХЦР характерно мозаичное распределение мутаций. Наиболее «горячими зонами» по мутациям являлись гены MYC, CDKN2A, PIK3CA, KIT, ALK, ATM. Такое распределение мутаций предполагает агрессивное течение ХЦР с высокой пролиферативной активностью и чувствительностью к таргетной терапии [6, 7] (см. рис. 2).

При кластерном BilIN LG было выделено 2 группы. Для 1-й группы наблюдений были характерными мутации MYC, PIK3CA, ERBB2, ALK, POLE, TERT и др. Данные мутации предполагают нарушение сигнального пути PIK3CA/ERBB2, снижение частоты мутаций KRAS, TP53 и «переход» в пролиферативный класс ХЦР при дальнейшем прогрессировании с относительно благоприятным отдаленным прогнозом. Во 2-й группе BilIN LG выявлены мутации MYC, FBXW7, KIT, KRAS, POLE, TERT, RB1 и др. Эти изменения могут быть характерны для ранней геномной нестабильности, активации RAS-зависимых сигнальных путей и связаны с высокими шансами прогрессирования в ХЦР с нестабильным течением (см. рис. 2) [20].

Анализ тепловой карты при BilIN LG показал, что уже на ранних стадиях неопластического процесса происходит мозаичное распределение мутаций. В данной группе «горячими точками» являлись мутации CDKN2A, ERBB2, POLE, NRAS, PTPN11, POLE, MAP1K2. Таким образом, при BilIN LG происходит активация ERBB2/RAS или PIK3CA-ассоциированных сигнальных путей, что напрямую будет влиять на отдаленный прогноз течения ХЦР [7, 21].

Таким образом, на основании полученных данных с целью дифференциальной диагностики эпителиальных неоплазий ВЖП рекомендуется учитывать молекулярно-генетические нарушения: KRAS — для дифференциальной диагностики BilIN LG/BilIN HG и IPNB HG/ХЦР; POLE — BilIN LG/ХЦР; TERT — BilIN LG/ХЦР; CTNNB1 — BilIN/IPNB как нозологических единиц в целом; CDKN2A — для диагностики ХЦР с остальными типами эпителиальных неоплазий ВЖП.

Заключение

На основании полученных молекулярно-генетических данных можно сделать вывод, что эпителиальные неоплазии ВЖП формируют несколько устойчивых групп с различным биологическим потенциалом. Постепенное нарастание мутационной нагрузки соответствует увеличению степени дисплазии с переходом к инвазивному росту и отражает ухудшение отдаленного прогноза течения заболевания. Внедрение полученных данных о мутационном профиле эпителиальных неоплазий ВЖП может позволить перейти от «исключительно» морфологической верификации поражений ВЖП к биологически ориентированной стратификации поражений ВЖП с персонифицированным ведением пациентов с POLE/TERT-ассоциированными и KRAS/TP53/SMAD4/CTNNB1/CDKN2A-ассоциированными поражениями ВЖП.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Сураев Д.Э., Паклина О.В.

Сбор и обработка материала — Сураев Д.Э., Баринов А.А., Демидова И.А., Калинин Д.В., Маринова Л.А.

Статистическая обработка — Сураев Д.Э.

Написание текста — Сураев Д.Э.

Редактирование — Демидова И.А., Паклина О.В., Каннер Д.Ю.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.