Легкие — один из самых сложных органов человеческого организма, состоящий более чем из 40 типов клеток, которые образуют уникальную архитектуру, обеспечивающую функцию эффективного газообмена [1]. Сложность и тонкая структура легкого являются основными причинами, затрудняющими понимание молекулярных механизмов функционирования легких в норме и при патологии. В данной статье проведены анализ и систематизация новейших методов исследования легочной ткани, выявления сигнальных молекул, моделирования заболеваний для оптимизации персонифицированной ранней диагностики бронхолегочной патологии.

Орган (легкое)-на-чипе

С развитием клеточных технологий появилась возможность трехмерного культивирования клеток (3D). Растущие в 2D-условиях клетки обычно более плоские и вытянутые по сравнению с клетками организма и трехмерных культур. Установлено, что в 2D- и 3D-культурах профили экспрессии генов (особенно вовлеченных в регуляцию пролиферации, дифференцировки и апоптоза) отличаются [2]. Применение 3D-модельных систем позволяет исследовать ряд процессов, изучение которых было возможно лишь на живых организмах, в первую очередь на экспериментальных животных [3].

Орган-на-чипе (ОНЧ) представляет собой многоканальный трехмерный микрофлюидный чип, позволяющий с определенным масштабированием моделировать органы, тем самым заменяя живой организм техническим устройством или моделью и уменьшая длительность и стоимость исследований. Это делает ОНЧ востребованным инструментом для изучения онтогенеза, механизмов функционирования и развития патологических состояний органов [4].

Популярность и востребованность в разработках ОНЧ и исследованиях с использованием этих систем подтверждаются наличием множества публикаций по данной теме, так, за последние 10 лет опубликовано более 70 статей по теме «легкие-на-чипе» («lungs on a chip»).

«Легкое-на-чипе» воспроизводит ключевые структурные, функциональные и механические свойства структурной единицы легкого [5]. В Институте биологической инженерии Wyss в Гарварде изготовили систему (рис. 1), содержащую близкорасположенные микроканалы, разделенные тонкой (10 мкм) пористой гибкой мембраной, изготовленной из силиконовой жидкости полидиметилсилоксана (ПДМС). Устройство состоит из трех полых микрофлюидных каналов, из которых средний канал состоит из тончайшей резиновой мембраны с множеством микроскопических отверстий. Культуры клеток выращивали с обеих сторон такой мембраны: человеческие альвеолярные эпителиальные клетки, с одной стороны, и человеческие легочные микрососудистые эндотелиальные клетки — с другой. Боковые каналы были соединены с вакуумом и поэтому могли имитировать растяжение мембраны. Сокращение диафрагмы вызывает снижение внутриплеврального давления, что приводит к расширению альвеол. Таким образом воздух поступает в клетки, по капиллярам течет насыщенная питательная среда, имитирующая кровь, а циклические растяжения имитируют дыхание [6].

Рис. 1. Схема «легкого-на-чипе» по прототипу Гарвардского университета [33].

Чтобы подтвердить биологическую точность устройства должна быть рассмотрена реакция всего органа. Воспаление легких моделируется путем введения среды, содержащей мощный медиатор воспаления. Только через несколько часов после травмы клетки в легком-на-чипе, подвергшиеся циклической деформации, реагировали, как при воспалительном процессе [7].

Живые бактерии E. coli были использованы для демонстрации того, как система может имитировать врожденный клеточный ответ на бактериальную легочную инфекцию. Бактерии были введены на апикальную поверхность альвеолярного эпителия. В течение нескольких часов нейтрофилы были обнаружены в альвеолярном отделении, что означает, что они переселились из сосудистого микроканала, где пористая мембрана захватывала бактерии [8].

Кроме того, исследователи полагают, что потенциальная ценность такой системы, как «легкое-на-чипе», проявится в токсикологических исследованиях. Добавление в верхнюю камеру системы наноразмерных частиц, подобных находящимся в воздухе и в некоторых промышленных продуктах, привело к проникновению этих частиц в клетки легких. Результатом стали повышенное образование свободных радикалов и воспалительный процесс. Исследователи выяснили, что циклическое растяжение тканей в процессе дыхания значительно увеличивает количество проникающих в кровь частиц [9]. Результаты были подтверждены исследованием на мышах. Поскольку микрофлюидное «легкое-на-чипе» может более точно воспроизводить механические свойства легкого живого человека, его физиологические реакции будут более быстрыми и точными, чем при использовании культуральных сред.

Возможность использования «легкого-на-чипе» для прогнозирования поглощения взвешенных в воздухе частиц и имитировать воспалительные реакции, вызванные патогенными микроорганизмами, является доказательством работоспособности концепции, согласно которой ОНЧ в будущем смогут заменить многие клинические исследования на животных. Тем не менее опубликованные исследования признают, что реакции «легкого-на-чипе» еще не полностью воспроизводят реакции естественных альвеолярных эпителиальных клеток [10].

Саливадиагностика

Одним из объектов для неинвазивного исследования молекулярных маркеров функционального состояния организма является слюна. В слюне обнаружено около 1000 различных белков и 19 000 уникальных пептидных последовательностей [11]. По сравнению с традиционным методом исследования крови определение уровня сигнальных молекул в слюне имеет ряд преимуществ: неинвазивность, атравматичность для пациента, отсутствие стресса, характерного для взятия крови, более простые условия хранения и транспортировки. По мере усовершенствования лабораторных методов стало доступно изучение различных компонентов слюны. Охарактеризованы ее физико-химические и биохимические параметры, определены их референтные величины для разных возрастных групп, условия пробоподготовки для исследования [12].

В последние годы в качестве надежной биожидкости для обнаружения системных патологических состояний, таких как рак, стали рассматривать смешанную слюну (ротовую жидкость), молекулярные компоненты которой могут отражать системный статус организма. Стоит отметить, что слюна имеет преимущества перед кровью в качестве биологической жидкости для клинической лабораторной диагностики, поскольку ее сбор осуществляется неинвазивно, что снижает дискомфорт для пациента, когда требуется повторный сбор образцов, и она содержит все биомаркеры, присутствующие в крови, хотя и в меньших количествах [13]. Слюна как диагностический инструмент может внести существенное дополнение к арсеналу средств ранней диагностики и мониторинга рака легкого.

В работе Л. Бельской и соавт. [14] были изучены метаболические характеристики слюны при раке легкого для использования в ранней диагностике и определении прогноза заболевания. Группа пациентов включала 425 больных раком легких, 168 пациентов с нераковыми заболеваниями легких и 550 здоровых добровольцев. У всех участников эксперимента перед началом лечения были взяты образцы слюны и определены 34 ее биохимических параметра. Участники находились под наблюдением в течение 6 лет, чтобы оценить показатели выживаемости. Активность ферментов была определена спектрофотометрическим методом. Установлено, что на фоне рака легких наблюдаются метаболические изменения, характеризующиеся уменьшением коэффициента де Ритиса, а также увеличением активности аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы и α-амилазы. Выявлены особенности изменения ферментативной активности в зависимости от гистологического типа опухоли. Характер изменения ферментативной активности близок для обоих гистологических типов немелкоклеточного рака легкого. Статистически достоверные различия между аденокарциномой и плоскоклеточным раком выявлены только для активности α-амилазы. Наблюдается повышение активности α-амилазы в слюне при аденокарциноме (p=0,009). Установлено, что независимо от гистологического типа рака легкого происходит уменьшение активности исследуемых ферментов на фоне отдаленного и регионарного метастазирования [15].

Заболеваемость раком легких высока. Мутации, идентифицированные в рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR), являются опухолеспецифичными биомаркерами немелкоклеточного рака легкого. Новая базовая технология под названием «высвобождение и измерение, вызванное электрическим полем» основана на нескольких электрохимических датчиках, которые могут обнаруживать мутации EGFR в жидкостях организма. Доказано, что этот метод обладает эффективностью, точностью, быстротой и рентабельностью при выявлении мутаций EGFR в слюне [16].

Кроме того, H. Xiao и соавт. [17] обнаружили 16 белков-кандидатов в слюне, которые могут отличать больных раком легких от здоровых людей с высокой чувствительностью и специфичностью. Это указывает на то, что саливадиагностика может применяться для раннего выявления и прогнозирования развития рака легких. Больные раком легких могут быть отделены от контрольной группы с чувствительностью 93,75% и специфичностью 82,81% с помощью пяти биомаркеров мРНК (циклин I, рецептор эпидермального фактора роста, фактор роста фибробластов 19, субстрат рецептора фактора роста фибробластов 2 и комбинация эстрогенов для регуляции роста при раке молочной железы 1). Аналогичным образом сообщается, что 3 протеомных биомаркера (гаптоглобин, цинк-α-2-гликопротеин и кальпротектин) в слюне показали точность, чувствительность и специфичность на уровне 90, 88,5 и 92,3% соответственно [18].

Таким образом, саливадиагностка представляет собой многообещающий неинвазивный метод для раннего выявления рака легких, однако необходимы доработки тест-систем, улучшающие чувствительность и специфичность [19].

ДНК- и РНК-аптамеры

ДНК- или РНК-аптамеры являются относительно дешевым и простым в получении аналогом моноклональных антител и представляют короткие (от 20 до 60 нуклеотидов), одноцепочечные молекулы РНК или ДНК, имеющие способность с высокой аффинностью и специфичностью связываться с молекулой-мишенью. В настоящее время существует большое количество аптамеров к различным мишеням [20].

Для получения аптамеров используют технологию SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) и ее модификации. Данный метод дает возможность отбора из библиотеки олигонуклеотидов только тех аптамеров, которые могут специфически связываться с молекулами-мишенями. Для этого создается библиотека олигонуклеотидов с фиксированной длиной цепи, но при этом случайными последовательностями. Каждая из последовательностей в библиотеке имеет множество копий для избегания утери какой-либо из них. Библиотеку инкубируют с молекулой-мишенью, во время чего наиболее близкие для нее аптамеры связываются с ней. Остальные аптамеры удаляются из смеси, а затем комплементарный молекуле-мишени аптамер элюируется, восстанавливается и при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицируется. Выделенные при помощи SELEX-технологии молекулы аптамеров секвенируют и синтезируют химически на основе уже известных последовательностей в неограниченном количестве [21]. Таким образом, SELEX дает возможность синтеза аптамера, способного специфически связываться только с целевым объектом, в данном случае с онкомаркером рака легкого.

Все существующие белки-онкомаркеры на рак легкого подразделяются на онкомаркеры широкого спектра (позволяющие диагностировать и другие типы рака) и узконаправленные, с помощью которых возможно определение только рака легкого или какого-либо его подтипа. В работе G.S. Zamay и соавт. [22] были выявлены 7 различных белков-онкомаркеров рака легкого: катепсин Д, аннексин А5, аннексин А2, виментин, гистон H2B, дефензин нейтрофилов и кластерин. Указанные белки-маркеры были обнаружены либо в плазме крови больных раком легкого, либо в материале опухоли после операционного вмешательства в большем количестве, чем у здорового человека.

Также получены аптамеры к ткани рака легкого человека, которые позволяют идентифицировать клетки и продукты распада опухоли человека в клинических образцах [23]. Аптамер LC-18 может связываться с клетками аденокарциномы легких, тканями и плазмой крови с высокой специфичностью. LC-18 состоит из последовательности 80 нуклеотидов, включая два константных двадцатинуклеотидных праймера с каждой стороны. Для того чтобы улучшить связывающие свойства и удешевить синтез, был разработан более короткий аналог LC-18t, демонстрирующий связывающие свойства, аналогичные его предшественнику LC-18.

При скрининге полученных аптамеров наилучшие результаты показал аптамер LC-18t, мишенями для которого являются гистон H2B и дефензин нейтрофилов. Специфичность связывания с опухолевыми клетками легкого была подтверждена иммуноцитохимическим исследованием с применением конфокальной микроскопии (рис. 2), а также проточной цитометрии. Для анализа оценивали связывание FAM-меченного LC-18t с клетками аденокарциномы легкого (фиолетовая кривая), клетками легкого с воспалением (красная кривая) и относительно здоровыми клетками легкого (синяя кривая). Черная кривая соответствует эталонным интактным клеткам. Связывание клеток опухоли легкого с контрольным олигонуклеотидом (AG)40 показано коричневым цветом [24].

Рис. 2. Распознавание клеток рака легкого с применением аптамера LC-18t [24].

А1 — окрашивание ткани легкого гематоксилином и эозином (световая микроскопия); А2 — окрашивание ткани легкого антителами к CEA, меченными Alexa Fluor 405; А3 — окрашивание аптамером LC-18t, меченным Cy-5; А4 — наложение изображений А2 и А3; А5 — интенсивность флуоресцентного сигнала от CEA и LC-18t; А6 — 3D-реконструкция среза ткани опухоли легкого; В — результаты проточной цитометрии.

В другом исследовании изучался аптамер для выявления гистонацетилтрансферазы 1 (HAT1). Повышение экспрессии HAT1 связано с вирусными инфекциями, воспалительными заболеваниями и раком, где оно ассоциирована с плохим прогнозом и низкой выживаемостью [25]. После шести раундов скрининга были получены два специфических аптамера, которые впоследствии были охарактеризованы и оптимизированы. Оба аптамера и одно производное (на основе модифицированных последовательностей) распознавали HAT1 с высокой аффинностью и специфичностью, а также были способны ингибировать ацетилтрансферазную активность HAT1 in vitro. Кроме того, применение аптамера apHAT610 приводило к снижению жизнеспособности клеток, индуцированному апоптозу и остановке клеточного цикла, а также к ингибированию образования колоний в клеточных линиях рака легкого.

Показано, что аптамер apHAT610 ингибировал активность HAT1 в культурах клеток рака легкого, тем самым способствуя снижению ацетилирования гистона H4 и уровней белка HAT1 [26]. Эти результаты указывают на то, что аптамер apHAT610 может являться основой для создания таргетного фармпрепарата и применения его для лечения рака легких.

Поскольку аптамеры можно конъюгировать с лекарственными средствами для целенаправленной доставки лекарств, это открывает возможность прицельно доставлять токсичные и радиоактивные вещества непосредственно к патологическому очагу и, тем самым, повышать эффективность терапии и снижать развитие побочных эффектов.

Гликодиагностика

Важнейшим направлением современных исследований живых систем сегодня являются так называемые гликонауки. Приставка «глико» означает принадлежность органических молекул, прежде всего природных молекул, к соединениям с гликозидной связью, то есть сложным углеводам. Отсюда, в современной научной литературе все чаще употребляются термины — гликотехнологии, гликомедицина, гликолекарства, гликодиагностика, гликовакцины.

Предметом исследования гликобиологии являются углевод-зависимые процессы, происходящие в клетке. Углеводы в живых организмах представлены в виде гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов, которые обладают огромным потенциалом кодирования биологической информации [27]. Следует подчеркнуть, что около 50% белков организма человека гликозилировано, т.е. к уже синтезированным в эндоплазматической сети белкам происходит присоединение углеводных компонентов, что дает возможность белкам выполнять множество функций.

В отличие от многих других посттрансляционных модификаций (например, фосфорилирования, сульфирования), работающих в большинстве своем для супрессии функции белка, гликозилирование обычно усиливает стабильность конформации белка. Присутствие сиаловых кислот, обычно N-ацетилнейраминовой, и/или сульфатных остатков придает отрицательный заряд молекуле гликопротеина [28].

Таким образом, гликозилирование имеет огромное значение для биологической функции белков. Особое внимание уделяется состоянию гликозилирования протеинов и липидов, а также трансмембранной передаче сигнала, основанной на углевод-белковом взаимодействии. Нарушение экспрессии и функции углевод-связывающих рецепторов и ферментов углеводного обмена в клетке приводит к различным патологиям.

Обнаружено, что изменения профиля N-гликозилирования могут наблюдаться в случаях малигнизации опухоли [29]. По-видимому, эти молекулы играют важную роль в инвазии опухолей, ангиогенезе, метастазировании и выходе опухолевых клеток из-под иммунного контроля. Таким образом, определение профиля N-гликанов может быть использовано в качестве важного биомаркера при предраковых состояниях, диагностике рака и определении прогноза заболеваний [30].

Установлена прямая связь между возрастом, стажем курения, уровнем глюкозы и характеристиками N-гликанов в плазме крови. Также важно, что наличие и стадия рака легкого напрямую влияют на этот показатель. В случае хирургического лечения рака легкого определялось снижение уровня N-гликанов независимо от курения и возраста. Кроме того, отмечено, что коморбидность рака легкого с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) увеличивает количество N-гликанов [31].

Уровень N-гликанов в плазме крови потенциально может быть использован в качестве биомаркера ХОБЛ, рака легкого или их сочетания. С диагностическими целями возможно использование капиллярного гель-электрофореза с высокочувствительной лазерно-индуцированной флуоресцентной детекцией различных типов гликанов [32].

Пока гликодиагностика еще не нашла широкого применения в клинической медицине и остается одним из инновационных методов трансляционной биомедицины, используемых, в основном, в научно-исследовательской работе. Для повсеместного внедрения требуется проведение специальных референсных исследований на большой когорте пациентов, страдающих различными социально значимыми заболеваниями.

Заключение

Модель «легкое-на-чипе» на клеточном уровне воспроизводит функции органа дыхания человека, с ее применением можно проводить токсикологические исследования, выявлять физиологические реакции эпителия при развитии вирусной и бактериальной инфекции, тестировать новые лекарства.

Саливадиагностика может стать многообещающим неинвазивным методом для раннего выявления рака легких и прогнозирования развития заболевания. ДНК- или РНК-аптамеры являются аналогами моноклональных антител, несколькими научными группами созданы аптамеры к ткани рака легкого человека, позволяющие идентифицировать клетки и продукты распада опухоли человека в клинических образцах.

Гликобиология является новой областью науки, посвященной изучению химического, биохимического состава углеводов и углеводных соединений, особенно гликопротеинов. В последние годы ведется активный поиск раковых гликобиомаркеров. Так, определение профиля N-гликанов может быть использовано в качестве важного биомаркера при предраковых состояниях, диагностике рака и определении прогноза развития заболевания.

Детальная разработка современной молекулярно-клеточной методологии позволит открыть новые пути и возможности для таргетной диагностики, профилактики и лечения многих социально значимых заболеваний.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.