Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Тараканова А.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Шарлай А.С.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Коновалов Д.М.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздрава России;
ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России

Альвеолярная рабдомиосаркома: новые вспомогательные суррогатные маркеры онкогенных транслокаций

Авторы:

Тараканова А.В., Шарлай А.С., Коновалов Д.М.

Подробнее об авторах

Журнал: Архив патологии. 2023;85(1): 10‑15

Просмотров: 2641

Загрузок: 152


Как цитировать:

Тараканова А.В., Шарлай А.С., Коновалов Д.М. Альвеолярная рабдомиосаркома: новые вспомогательные суррогатные маркеры онкогенных транслокаций. Архив патологии. 2023;85(1):10‑15.
Tarakanova AV, Sharlai AS, Konovalov DM. Alveolar rhabdomyosarcoma: novel surrogate markers associated with oncogenic translocation. Russian Journal of Archive of Pathology. 2023;85(1):10‑15. (In Russ.)
https://doi.org/10.17116/patol20238501110

Рекомендуем статьи по данной теме:
Ха­рак­те­рис­ти­ки ци­то­ге­не­ти­чес­ких ва­ри­ан­тов аль­ве­оляр­ной раб­до­ми­осар­ко­мы. Ар­хив па­то­ло­гии. 2024;(6):21-27

Рабдомиосаркома (РМС), первые описания которой датируются началом XIX века, является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью мягких тканей у детей и подростков. Распространенность ее составляет 4,5 случая на 1 000 000 детского населения в возрасте до 20 лет [1, 2]. Классификация ВОЗ 2020 г. выделяет 4 отдельных нозологических формы РМС: эмбриональную, альвеолярную (АРМС), веретеноклеточную/склерозирующую и плеоморфную. Данное деление, основанное прежде всего на гистологических признаках, включает также ряд иных характеристик, непосредственно влияющих на тактику ведения и прогноз. В последние годы также появляется все больше сообщений о рабдомиосаркоме с перестройкой EWSR/FUS-TFCP2 и других молекулярных вариантах, пока еще не включенных в классификацию ВОЗ, но влияющих на прогноз заболевания (например, VGLL2/NCOA2, MyoD1) [3].

АРМС представляет собой быстрорастущую злокачественную опухоль мягких тканей, которая у 25—30% пациентов на момент постановки диагноза сопровождается отдаленными или регионарными метастазами. Она является второй по распространенности после эмбриональной, составляя около 1/4 всех случаев, и чаще встречается в более старшей возрастной группе, с пиком заболеваемости в 10—25 лет, однако диагностируются случаи у детей раннего возраста и даже врожденные. Наиболее частыми локализациями являются глубокие мягкие ткани конечностей, а также область головы и шеи, параспинальная область и промежность [3, 4].

Гистологически клетки АРМС характеризуются единообразной морфологией, округлыми гиперхромными ядрами и скудной эозинофильной цитоплазмой. Опухолевые клетки формируют гнезда, разделяемые фиброваскулярными септами, в центре которых часто утрачиваются межклеточные контакты. В результате гнезда приобретают «альвеолярный» вид за счет бесклеточных пространств различного объема (рис. 1). Иногда наблюдается солидный паттерн строения с образованием трабекулярных структур и сохранением межклеточных контактов, который чаще не ассоциирован с канонической генетической аномалией [5]. Иммуногистохимическая ядерная экспрессия транскрипционных факторов, связанных с миогенезом, таких как MyoD1 (Myf3) и Myogenin (Myf4), в комплексе с общими маркерами скелетной мышечной ткани (Desmin, MSA), является крайне специфичной для всех рабдомиосарком (рис. 2). Часто наблюдаемая в АРМС более интенсивная и распространенная экспрессия Myogenin по сравнению с MyoD1, является ценным дифференцирующим признаком, характерным для АРМС, но наблюдается не всегда (см. рис. 2) [6].

Рис. 1. Гистологическая картина альвеолярной рабдомиосаркомы (АРМС).

а — классический гнездный вариант роста с выраженной фиброзной стромой в виде септ, внутри гнезд утрата межклеточных контактов с появлением бесклеточных пространств, ×40; б — клетки опухоли мономорфны, с гиперхромными округлыми ядрами и интенсивно эозинофильной цитоплазмой малого объема, формируют гнездные и трабекулярные структуры, ×400. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 2. Иммунофенотип АРМС.

а — экспрессия Myogenin; б — экспрессия MyoD1. В данном наблюдении экспрессия MyoD1 более выражена, что не исключает диагноз АРМС (объяснение в тексте). Иммуногистохимическая реакция, ×40.

Приблизительно в 80% случаев АРМС ассоциирована с транслокацией гена FOXO1 и формированием химерного транскрипта (фьюжн-гена) с генами-партнерами PAX3 или PAX7. Наиболее распространенным методом выявления транслокации гена FOXO1 является флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), представляющая на данный момент «золотой стандарт» диагностики фьюжн-позитивных АРМС [6—8].

Встречаются и менее распространенные альтернативные транслокации, такие как FGFR1::FOXO1, PAX3::FOXO4 (ранее PAX3::AFX), PAX3::NCOA1 и PAX3::NCOA2, а также варианты амплификаций геномных областей 2p24 (содержащая онкоген MYCN) и 12q13-q14 (включающая CDK4), характерные для АРМС с перестройкой PAX3::FOXO1, и амплификации 1p36 (включает локус PAX7) и 13q31 (включает MIR17FIG), связанные с транслокацией PAX7::FOXO1 [8—10]. Эти редкие транслокации создают сложности для анализа истинной распространенности АРМС в связи с тем, что они, не выявляемые стандартными методами FISH-диагностики, приводят к классификации таких случаев, как фьюжн-негативные [11].

Обнаружение онкогенной транслокации связано с менее благоприятным прогнозом по сравнению с фьюжн-негативным вариантом и/или эмбриональной РМС. Этот факт отразился на подходе к лечению фьюжн-позитивной когорты, эскалация терапии которой привела к улучшению показателей безрецидивной выживаемости по данным клинических исследований [12—14].

Исходя из этого, особую важность приобретает вопрос уточнения генетического статуса опухоли. Большой диагностический потенциал имеет изучение суррогатных маркеров, ассоциированных с транслокацией PAX3/7::FOXO1, определяемых с помощью более доступного и распространенного метода иммуногистохимии.

Поиск таких маркеров может быть основан на анализе открытых баз данных молекулярно-генетических исследований. На основании накопленных данных из открытой базы расширенных геномных исследований Gene Expression Omnibus (GEO) две независимые группы исследователей M. Kaleta и соавт. и S. Raghavan и соавт. [15, 16] провели сравнительный анализ профилей экспрессии фьюжн-позитивных и фьюжн-негативных АРМС со сходным результатом. Были выделены гены, экспрессия транскриптов которых оказалась повышенной во фьюжн-позитивных образцах. При дальнейшем анализе из 689 аннотированных ранее генов 139 лежали в области сайта связывания PAX3::FOXO1, что может говорить о взаимосвязи данных генетических явлений, однако механизм требует дальнейшего изучения. Необходимо отметить, что около 1/2 всех генов с гиперэкспрессией была описана ранее как ассоциированная с дифференцировкой нервной ткани. Среди отобранных ранее по локализации 139 генов 35 также оказались ответственными за нейродифференцировку, 8 из них — транскрипционные факторы, доступные для иммуногистохимического исследования с известным паттерном экспрессии, в том числе OLIG2.

Также в 2021 г. группой E. Forgo и соавт. [17] опубликовано исследование экспрессии мембранно-ассоциированного гликопротеина MUC4 в рабдомиосаркомах, показавшее исключительную специфичность и высокую чувствительность в отношении фьюжн-позитивных АРМС (98,6 и 81% соответственно). В последующем анализе открытых баз данных геномных исследований также была обнаружена взаимосвязь гиперэкспрессии гена MUC4 с транслокацией PAX3/7::FOXO1.

Материал и методы

Критерии включения

Ретроспективно из архива патолого-анатомического отделения НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева за 2013—2019 гг. было отобрано 139 случаев РМС. В исследовании применялась технология тканевой матрицы (TMA — tissue microarray). В рамках данной работы на срезах, полученных с TMA-блоков, была реализована методика FISH с использованием локусспецифичного зонда MetaSystems XL FOXO1 Break Apart («Metasystems», Германия). Согласно инструкции производителя, пробоподготовку проводили с использованием наборов для FISH-анализа в гистологии («Dako», Дания). Для визуализации результатов FISH-реакции использовали флюоресцентный микроскоп Olympus BX63 с тройным фильтром DAPI/ORANGE/GREEN. В каждом образце анализировали не менее 100 интерфазных ядер с четкими сигналами. Граница нормы для используемого локусспецифичного FOXO1 (13q14) составила 0% (рис. 3).

Рис. 3. Результат FISH-анализа с ДНК-зондом к гену FOXO1.

ДНК-зонд — MetaSystems XL FOXO1 BA. Проксимальный (3’-) конец FOXO1 помечен зеленым, дистальный (5’) конец FOXO1 — красным. В данном случае выявлена транслокация с вовлечением локуса гена FOXO1 в сочетании с амплификацией проксимального конца. ×600.

Данные были сведены в общей таблице с корректировкой на погрешность при приготовлении и окраске срезов TMA (утрата части образцов в связи с дорезкой). Итоговый анализ экспрессии и статистическую обработку прошли 111 случаев (76 — фьюжн-негативных и 35 — фьюжн-позитивных).

Метод оценки иммуногистохимической экспрессии и статистического анализа

После окрашивания срезов парафиновых блоков TMA по стандартному протоколу антителом OLIG2 (Cell Marque Antibodies), клон 211F1.1 в разведении 1:50 оценку экспрессии проводили методом световой микроскопии. Учитывалась только ядерная локализация окрашивания, выявляемая в 5% клеток и более в зависимости от общей клеточности образца. Дополнительно оценивали интенсивность окрашивания в баллах от 1 до 3 (1 — светло-коричневый, 2 — коричневый, 3 — ярко-коричневый), а также распределение окрашивания в образце.

Для антитела MUC4 (Cell Marque Antibodies), клон 8G7 использовали разведение 1:50. Оценку экспрессии на светооптическом уровне проводили исходя из распространенности и интенсивности окрашивания. Позитивной расценивалась реакция 50% клеток и более в образце с принадлежностью к мембранно-цитоплазматическому компартменту опухолевых клеток и высокой интенсивностью окрашивания.

Для статистического анализа полученных данных использовали таблицу сопряженности признаков 2×2 и точный тест Фишера.

Результаты и обсуждение

Всего экспрессия OLIG2 более чем в 5% клеток была выявлена в 27 из 35 случаев фьюжн-позитивных РМС (77,14%, 95% ДИ: 59,86—89,58%) и в 11 из 76 — фьюжн-негативных РМС, что соответствует специфичности 85,53% (75,58—92,55%). Среди экспрессирующих маркер фьюжн-негативных образцов все ранее были морфологически классифицированы как эмбриональные (p=0,00646851 (<0,01)). Средняя интенсивность окрашивания составила 2 балла, корреляции между типом перестройки и интенсивностью или распределением окрашивания не выявлено (рис. 4).

Рис. 4. Экспрессия OLIG2 в АРМС.

а — экспрессия более чем в 5% всех опухолевых клеток образца, ×200; б — интенсивная ядерная экспрессия, ×400. Иммуногистохимическая реакция.

Экспрессия MUC4 была установлена в 22 из 35 фьюжн-позитивных образцов (62,86%, 95% ДИ: 44,92—78,53%) и 15 (19,74%) из 76 фьюжн-негативных, что соответствует специфичности 80,26% (69,54—88,51%); p=0,00038669 (<0,01) (рис. 5). Необходимо отметить, что оценка экспрессии MUC4 была сопряжена с определенными трудностями при локализации опухоли в субэпителиальных слоях слизистых оболочек и обозначалась в более ранних классификациях как «ботриоидный» вариант РМС.

Рис. 5. Экспрессия MUC4 в АРМС.

а — экспрессия MUC4 более чем в 50% опухолевых клеток, ×100; б — мембранно-цитоплазматическая локализация маркера, ×400. Иммуногистохимическая реакция.

Интересным представляется клиническое наблюдение при работе с биопсийным образцом и последующим операционным материалом опухоли. Результаты FISH-исследования на биопсийном материале были расценены как негативные, в материале удаленной опухоли была достоверно обнаружена транслокация FOXO1. Это может быть связано с малой клеточностью и сниженным диагностическим качеством биопсийного образца при механических воздействиях, что является частым ограничением для проведения генетических исследований. Однако экспрессия OLIG2 и MUC4 была выявлена в обоих образцах с аналогичной интенсивностью (2 балла) и большей распространенностью в случае операционного материала (40% клеток против 15% в биопсийном материале) (см. таблицу).

Экспрессия OLIG2 и MUC4 в рабдомиосаркомах

Показатель

Всего (n=111)

OLIG2, (абс/%)

MUC4, (абс/%)

АРМС с перестройкой гена FOXO1

35

27/77,14

22/62,86

РМС без перестройки,

в том числе:

76

11/14,47

15/19,74

эмбриональная

63

11

14

веретеноклеточная/склерозирующая

13

0

1

Оценивая уровень ложноположительных реакций, необходимо помнить о существовании вариантов транслокаций без участия FOXO1. При настоящем дизайне исследования такие образцы включены в группу фьюжн-негативных РМС в связи с отрицательным результатом FISH-исследования с конкретным зондом. При соответствии всех прочих критериев АРМС выявление экспрессии OLIG2 и MUC4 также должно ориентировать исследователя на расширение стратегии поиска генетических аномалий, например применение другого метода молекулярно-генетического исследования.

Заключение

Настоящее исследование подтверждает установленное ранее высокое предиктивное значение экспрессии суррогатных маркеров OLIG2 и MUC4 в определении генетического статуса АРМС, позволяющего с высокой специфичностью предсказать выявление перестройки гена FOXO1.

Новые сведения, открывшиеся после внедрения в практику методов молекулярной генетики, постепенно меняют взгляд на биологию новообразований и их истинную распространенность. История изучения группы рабдомиосарком демонстрирует, как интерпретация данных о генетических аномалиях отражается на клинической практике.

Участие авторов:

Концепция и дизайн статьи — Д.М. Коновалов, А.В. Тараканова

Сбор и обработка материала — А.С. Шарлай, А.В. Тараканова

Написание текста — А.В. Тараканова

Редактирование — Д.М. Коновалов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо со ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail

Мы используем файлы cооkies для улучшения работы сайта. Оставаясь на нашем сайте, вы соглашаетесь с условиями использования файлов cооkies. Чтобы ознакомиться с нашими Положениями о конфиденциальности и об использовании файлов cookie, нажмите здесь.