Рабдомиосаркома (РМС), первые описания которой датируются началом XIX века, является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью мягких тканей у детей и подростков. Распространенность ее составляет 4,5 случая на 1 000 000 детского населения в возрасте до 20 лет [1, 2]. Классификация ВОЗ 2020 г. выделяет 4 отдельных нозологических формы РМС: эмбриональную, альвеолярную (АРМС), веретеноклеточную/склерозирующую и плеоморфную. Данное деление, основанное прежде всего на гистологических признаках, включает также ряд иных характеристик, непосредственно влияющих на тактику ведения и прогноз. В последние годы также появляется все больше сообщений о рабдомиосаркоме с перестройкой EWSR/FUS-TFCP2 и других молекулярных вариантах, пока еще не включенных в классификацию ВОЗ, но влияющих на прогноз заболевания (например, VGLL2/NCOA2, MyoD1) [3].

АРМС представляет собой быстрорастущую злокачественную опухоль мягких тканей, которая у 25—30% пациентов на момент постановки диагноза сопровождается отдаленными или регионарными метастазами. Она является второй по распространенности после эмбриональной, составляя около ¹/₄ всех случаев, и чаще встречается в более старшей возрастной группе, с пиком заболеваемости в 10—25 лет, однако диагностируются случаи у детей раннего возраста и даже врожденные. Наиболее частыми локализациями являются глубокие мягкие ткани конечностей, а также область головы и шеи, параспинальная область и промежность [3, 4].

Гистологически клетки АРМС характеризуются единообразной морфологией, округлыми гиперхромными ядрами и скудной эозинофильной цитоплазмой. Опухолевые клетки формируют гнезда, разделяемые фиброваскулярными септами, в центре которых часто утрачиваются межклеточные контакты. В результате гнезда приобретают «альвеолярный» вид за счет бесклеточных пространств различного объема (рис. 1). Иногда наблюдается солидный паттерн строения с образованием трабекулярных структур и сохранением межклеточных контактов, который чаще не ассоциирован с канонической генетической аномалией [5]. Иммуногистохимическая ядерная экспрессия транскрипционных факторов, связанных с миогенезом, таких как MyoD1 (Myf3) и Myogenin (Myf4), в комплексе с общими маркерами скелетной мышечной ткани (Desmin, MSA), является крайне специфичной для всех рабдомиосарком (рис. 2). Часто наблюдаемая в АРМС более интенсивная и распространенная экспрессия Myogenin по сравнению с MyoD1, является ценным дифференцирующим признаком, характерным для АРМС, но наблюдается не всегда (см. рис. 2) [6].

Рис. 1. Гистологическая картина альвеолярной рабдомиосаркомы (АРМС).

а — классический гнездный вариант роста с выраженной фиброзной стромой в виде септ, внутри гнезд утрата межклеточных контактов с появлением бесклеточных пространств, ×40; б — клетки опухоли мономорфны, с гиперхромными округлыми ядрами и интенсивно эозинофильной цитоплазмой малого объема, формируют гнездные и трабекулярные структуры, ×400. Окраска гематоксилином и эозином.

Рис. 2. Иммунофенотип АРМС.

а — экспрессия Myogenin; б — экспрессия MyoD1. В данном наблюдении экспрессия MyoD1 более выражена, что не исключает диагноз АРМС (объяснение в тексте). Иммуногистохимическая реакция, ×40.

Приблизительно в 80% случаев АРМС ассоциирована с транслокацией гена FOXO1 и формированием химерного транскрипта (фьюжн-гена) с генами-партнерами PAX3 или PAX7. Наиболее распространенным методом выявления транслокации гена FOXO1 является флюоресцентная гибридизация in situ (FISH), представляющая на данный момент «золотой стандарт» диагностики фьюжн-позитивных АРМС [6—8].

Встречаются и менее распространенные альтернативные транслокации, такие как FGFR1::FOXO1, PAX3::FOXO4 (ранее PAX3::AFX), PAX3::NCOA1 и PAX3::NCOA2, а также варианты амплификаций геномных областей 2p24 (содержащая онкоген MYCN) и 12q13-q14 (включающая CDK4), характерные для АРМС с перестройкой PAX3::FOXO1, и амплификации 1p36 (включает локус PAX7) и 13q31 (включает MIR17FIG), связанные с транслокацией PAX7::FOXO1 [8—10]. Эти редкие транслокации создают сложности для анализа истинной распространенности АРМС в связи с тем, что они, не выявляемые стандартными методами FISH-диагностики, приводят к классификации таких случаев, как фьюжн-негативные [11].

Обнаружение онкогенной транслокации связано с менее благоприятным прогнозом по сравнению с фьюжн-негативным вариантом и/или эмбриональной РМС. Этот факт отразился на подходе к лечению фьюжн-позитивной когорты, эскалация терапии которой привела к улучшению показателей безрецидивной выживаемости по данным клинических исследований [12—14].

Исходя из этого, особую важность приобретает вопрос уточнения генетического статуса опухоли. Большой диагностический потенциал имеет изучение суррогатных маркеров, ассоциированных с транслокацией PAX3/7::FOXO1, определяемых с помощью более доступного и распространенного метода иммуногистохимии.

Поиск таких маркеров может быть основан на анализе открытых баз данных молекулярно-генетических исследований. На основании накопленных данных из открытой базы расширенных геномных исследований Gene Expression Omnibus (GEO) две независимые группы исследователей M. Kaleta и соавт. и S. Raghavan и соавт. [15, 16] провели сравнительный анализ профилей экспрессии фьюжн-позитивных и фьюжн-негативных АРМС со сходным результатом. Были выделены гены, экспрессия транскриптов которых оказалась повышенной во фьюжн-позитивных образцах. При дальнейшем анализе из 689 аннотированных ранее генов 139 лежали в области сайта связывания PAX3::FOXO1, что может говорить о взаимосвязи данных генетических явлений, однако механизм требует дальнейшего изучения. Необходимо отметить, что около ¹/₂ всех генов с гиперэкспрессией была описана ранее как ассоциированная с дифференцировкой нервной ткани. Среди отобранных ранее по локализации 139 генов 35 также оказались ответственными за нейродифференцировку, 8 из них — транскрипционные факторы, доступные для иммуногистохимического исследования с известным паттерном экспрессии, в том числе OLIG2.

Также в 2021 г. группой E. Forgo и соавт. [17] опубликовано исследование экспрессии мембранно-ассоциированного гликопротеина MUC4 в рабдомиосаркомах, показавшее исключительную специфичность и высокую чувствительность в отношении фьюжн-позитивных АРМС (98,6 и 81% соответственно). В последующем анализе открытых баз данных геномных исследований также была обнаружена взаимосвязь гиперэкспрессии гена MUC4 с транслокацией PAX3/7::FOXO1.

Материал и методы

Критерии включения

Ретроспективно из архива патолого-анатомического отделения НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева за 2013—2019 гг. было отобрано 139 случаев РМС. В исследовании применялась технология тканевой матрицы (TMA — tissue microarray). В рамках данной работы на срезах, полученных с TMA-блоков, была реализована методика FISH с использованием локусспецифичного зонда MetaSystems XL FOXO1 Break Apart («Metasystems», Германия). Согласно инструкции производителя, пробоподготовку проводили с использованием наборов для FISH-анализа в гистологии («Dako», Дания). Для визуализации результатов FISH-реакции использовали флюоресцентный микроскоп Olympus BX63 с тройным фильтром DAPI/ORANGE/GREEN. В каждом образце анализировали не менее 100 интерфазных ядер с четкими сигналами. Граница нормы для используемого локусспецифичного FOXO1 (13q14) составила 0% (рис. 3).

Рис. 3. Результат FISH-анализа с ДНК-зондом к гену FOXO1.

ДНК-зонд — MetaSystems XL FOXO1 BA. Проксимальный (3’-) конец FOXO1 помечен зеленым, дистальный (5’) конец FOXO1 — красным. В данном случае выявлена транслокация с вовлечением локуса гена FOXO1 в сочетании с амплификацией проксимального конца. ×600.

Данные были сведены в общей таблице с корректировкой на погрешность при приготовлении и окраске срезов TMA (утрата части образцов в связи с дорезкой). Итоговый анализ экспрессии и статистическую обработку прошли 111 случаев (76 — фьюжн-негативных и 35 — фьюжн-позитивных).

Метод оценки иммуногистохимической экспрессии и статистического анализа

После окрашивания срезов парафиновых блоков TMA по стандартному протоколу антителом OLIG2 (Cell Marque Antibodies), клон 211F1.1 в разведении 1:50 оценку экспрессии проводили методом световой микроскопии. Учитывалась только ядерная локализация окрашивания, выявляемая в 5% клеток и более в зависимости от общей клеточности образца. Дополнительно оценивали интенсивность окрашивания в баллах от 1 до 3 (1 — светло-коричневый, 2 — коричневый, 3 — ярко-коричневый), а также распределение окрашивания в образце.

Для антитела MUC4 (Cell Marque Antibodies), клон 8G7 использовали разведение 1:50. Оценку экспрессии на светооптическом уровне проводили исходя из распространенности и интенсивности окрашивания. Позитивной расценивалась реакция 50% клеток и более в образце с принадлежностью к мембранно-цитоплазматическому компартменту опухолевых клеток и высокой интенсивностью окрашивания.

Для статистического анализа полученных данных использовали таблицу сопряженности признаков 2×2 и точный тест Фишера.

Результаты и обсуждение

Всего экспрессия OLIG2 более чем в 5% клеток была выявлена в 27 из 35 случаев фьюжн-позитивных РМС (77,14%, 95% ДИ: 59,86—89,58%) и в 11 из 76 — фьюжн-негативных РМС, что соответствует специфичности 85,53% (75,58—92,55%). Среди экспрессирующих маркер фьюжн-негативных образцов все ранее были морфологически классифицированы как эмбриональные (p=0,00646851 (<0,01)). Средняя интенсивность окрашивания составила 2 балла, корреляции между типом перестройки и интенсивностью или распределением окрашивания не выявлено (рис. 4).

Рис. 4. Экспрессия OLIG2 в АРМС.

а — экспрессия более чем в 5% всех опухолевых клеток образца, ×200; б — интенсивная ядерная экспрессия, ×400. Иммуногистохимическая реакция.

Экспрессия MUC4 была установлена в 22 из 35 фьюжн-позитивных образцов (62,86%, 95% ДИ: 44,92—78,53%) и 15 (19,74%) из 76 фьюжн-негативных, что соответствует специфичности 80,26% (69,54—88,51%); p=0,00038669 (<0,01) (рис. 5). Необходимо отметить, что оценка экспрессии MUC4 была сопряжена с определенными трудностями при локализации опухоли в субэпителиальных слоях слизистых оболочек и обозначалась в более ранних классификациях как «ботриоидный» вариант РМС.

Рис. 5. Экспрессия MUC4 в АРМС.

а — экспрессия MUC4 более чем в 50% опухолевых клеток, ×100; б — мембранно-цитоплазматическая локализация маркера, ×400. Иммуногистохимическая реакция.

Интересным представляется клиническое наблюдение при работе с биопсийным образцом и последующим операционным материалом опухоли. Результаты FISH-исследования на биопсийном материале были расценены как негативные, в материале удаленной опухоли была достоверно обнаружена транслокация FOXO1. Это может быть связано с малой клеточностью и сниженным диагностическим качеством биопсийного образца при механических воздействиях, что является частым ограничением для проведения генетических исследований. Однако экспрессия OLIG2 и MUC4 была выявлена в обоих образцах с аналогичной интенсивностью (2 балла) и большей распространенностью в случае операционного материала (40% клеток против 15% в биопсийном материале) (см. таблицу).

Экспрессия OLIG2 и MUC4 в рабдомиосаркомах

Оценивая уровень ложноположительных реакций, необходимо помнить о существовании вариантов транслокаций без участия FOXO1. При настоящем дизайне исследования такие образцы включены в группу фьюжн-негативных РМС в связи с отрицательным результатом FISH-исследования с конкретным зондом. При соответствии всех прочих критериев АРМС выявление экспрессии OLIG2 и MUC4 также должно ориентировать исследователя на расширение стратегии поиска генетических аномалий, например применение другого метода молекулярно-генетического исследования.

Заключение

Настоящее исследование подтверждает установленное ранее высокое предиктивное значение экспрессии суррогатных маркеров OLIG2 и MUC4 в определении генетического статуса АРМС, позволяющего с высокой специфичностью предсказать выявление перестройки гена FOXO1.

Новые сведения, открывшиеся после внедрения в практику методов молекулярной генетики, постепенно меняют взгляд на биологию новообразований и их истинную распространенность. История изучения группы рабдомиосарком демонстрирует, как интерпретация данных о генетических аномалиях отражается на клинической практике.

Участие авторов:

Концепция и дизайн статьи — Д.М. Коновалов, А.В. Тараканова

Сбор и обработка материала — А.С. Шарлай, А.В. Тараканова

Написание текста — А.В. Тараканова

Редактирование — Д.М. Коновалов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.