Дерматогелиоз (син. фотостарение) — процесс преждевременного старения кожи, реализующийся в результате кумулятивного эффекта ультрафиолетового облучения (УФО) и сопровождающийся высоким риском развития эпителиальных опухолей кожи — актинического кератоза (АК), базально-клеточного рака (БКР), метатипического и плоскоклеточного рака кожи (ПКР) [1, 2].

Уже через несколько минут после экспозиции УФО повышается экспрессия ядерного фактора транскрипции (активатор протеин-1), который остается на повышенном уровне в течение 24 ч и индуцирует синтез ключевых участников процесса деградации межклеточного матрикса — матриксных металлопротеиназ (ММП) [2—5]. ММП относятся к семейству Zn-содержащих протеиназ, являющихся медиаторами деградации коллагенов всех типов и других компонентов экстрацеллюлярного матрикса (эластин, протеогликаны, ламинин), синтез и накопление которых играют ключевую роль в гидролизе базальной мембраны и вовлечены в широкий спектр протеолитических процессов при различных физиологических и патологических изменениях, включая воспаление, заживление ран, ангиогенез и канцерогенез [2, 6]. Из семейства ММП, включающего порядка 25 видов, под воздействием УФО вырабатываются ММП-1, ММП-9. Данные ММП вносят вклад в опухолевый рост, способствуют деградиции экстрацеллюлярного матрикса и базальной мембраны, а также посредством реализации факторов роста и генерирования биоактивных фрагментов играют важную роль в опухолевой прогрессии, инвазии, ускользании от иммунного надзора и других событиях онкогенеза [7, 8].

ММП-1 (интерстициальная коллагеназа, или коллагеназа 1) является главной протеазой, ответственной за инициацию деградации коллагеновых фибрилл 1-го и 3-го типа и агрегацию фрагментированного коллагена [9].

ММП-9 в процессе канцерогенеза оказывает негативное влияние на процессы, опосредованные иммунной системой, инициируя протеолитическое расщепление рецептора IL-2α и снижая пролиферативную способность Т-лимфоцитов [10].

Способность ММП модифицировать многообразные сложные протеины значительно облегчает процессы как физиологического, так и опухолевого ангиогенеза [11]. Так, ММП способствуют высвобождению и активации находящихся в межклеточном матриксе в неактивном состоянии факторов роста и цитокинов, оказывающих проангиогенное действие (трансформирующий фактор роста, фибробластический фактор роста 1 и 2, инсулиноподобный фактор роста 1, сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и др.), что в настоящее время рассматривается как один из главных механизмов опухолевого ангиогенеза, где ММП-9 вносит наибольший вклад в опухолевый VEGF-опосредованный ангиогенез [11—14].

Помимо участия в поздних этапах канцерогенеза, недавнее исследование, проведенное группой ученых Франции и Германии, раскрывает роль ММП в инициировании самых ранних стадий немеланомного канцерогенеза в коже посредством активации протеазоактивируемого рецептора (PAR-1), приводящей к инициации неопластической трансформации кератиноцитов [15].

G. Fisher и соавт., T. Quan и соавт., изучая экспрессию ММП после острого воздействия УФО, отметили наибольшее увеличение уровней ММП 1, 3, 9, в то время как M. Brennan и соавт., D Fagot и соавт. — ММП-1 [2, 16—18]. C. Jean и соавт. продемонстрировали эффективность фотопротектора широкого спектра в отношении воздействия УФО посредством оценки уровня ММП 1, 3, 9 in vitro [19]. R. Tsukifuji и соавт., изучив 16 образцов актинического кератоза, обнаружили экспрессию ММП-1 в 25% случаев, экспрессия ММП 2, 3 зарегистрирована не была, причем повышенный уровень ММП-1 исследователи ассоциируют с трансформацией в ПКР [20]. F. Poswar и соавт. в исследовании экспрессии ММП-9 в строме АК, БКР и ПКР выявили наивысший уровень в образцах ПКР, в то время как O. Fabiano и соавт. не выявили значительной разницы в экспрессии ММП-9 при данных новообразованиях. По данным R. Verdolini и соавт. и M. Hernandez-Perez и соавт., экспрессия ММП-9 при АК в сравнении с ПКР описывалась соответственно сниженной и равнозначной [21—23].

Таким образом, на основе анализа имеющихся в мировой литературе данных становится понятно, что наиболее полно изучен механизм повреждения коллагена, следующий за воздействием острого УФО, данные российских ученых носят единичный и разрозненный характер, а вопросы изучения экспрессии ММП-1, ММП-9 в коже с различными стадиями дерматогелиоза, очагах эпителиальных опухолей кожи остаются недостаточно изученными.

Цель исследования — выявление особенностей экспрессии ММП-1, ММП-9 в коже с дерматогелиозом различных стадий, очагах актинического кератоза и базально-клеточного рака кожи с помощью иммуногистохимического метода исследования.

Иммуногистохимическое исследование проводили на биопсийном материале, полученном от 28 больных и здоровых добровольцев. Для исследования использовали 12 образцов здоровой кожи, удаленных в ходе хирургического вмешательства (блефаропластика), среди которых 6 — кожа век с фотостарением II стадии по Глогау [24], 6 — кожа век с фотостарением III—IV стадии по Глогау, а также биопсийный материал из 8 очагов АК и 8 очагов БКР. После верификации диагноза АК и БКР путем проведения гистологического исследования пациентам было проведено наружное лечение с использованием деструктивных методик (криодеструкция, фотодинамическая терапия, аппликации препарата «Мардил-Селен»).

Получение биопсийного материала очагов АК и БКР кожи: под местной анестезией 2% раствором лидокаина проводили биопсию кожи размером 0,5×0,5 см. Биоптаты фиксировали в 10% растворе формалина, забуференным по Лилли при рН 7,4. Образцы здоровой кожи были получены в ходе хирургического вмешательства (блефаропластика).

Для выявления экспрессии ММП-1, ММП-9 использовали парафиновые срезы толщиной 5 мкм, нанесенные на предметные сиалинизированные стекла («Dako») и инкубированные с моноклональными антителами («Novocastra») к ММР-1 1:10, ММР-9 1:40. Для визуализации применяли систему детекции Envision («Dako»). В качестве хромогена использовали диаминобензидин. Для восстановления антигенной активности срезы обрабатывали в специализированном миниавтоклаве Retrivale-2100 при температуре 12 °C в течение 20 мин с последующим охлаждением в течение 2 ч. Время инкубации с антителами составляло 60 мин при комнатной температуре. После проведения реакции срезы докрашивали гематоксилином.

Положительная реакция на ММП проявлялась в виде коричневого окрашивания цитоплазмы кератиноцитов/опухолевых клеток различной интенсивности. Оценка интенсивности экспрессии ММП оценивалась как слабая, умеренная или сильная:

— слабая (+) — менее 10% слабо окрашенных клеток;

— умеренная (++) — 10—30% умеренно окрашенных клеток;

— сильная (+++) — более 30% интенсивно окрашенных клеток.

Статистический анализ данных проводили с использованием статистического непараметрического критерия — точного метода Фишера.

В результате изучения особенностей экспрессии ММП иммуногистохимическим методом исследования выявлено, что в коже с дерматогелиозом II стадии в 6 (100%) случаях экспрессия ММП-1 в эпидермисе не зарегистрирована. Полученные данные статистически значимо отличаются от экспрессии ММП-1 в очагах БКР (р=0,0003), где экспрессия ММП-1 зарегистрирована в 8 (100%) случаях, также выявленная в 5 (62,5%) очагах АК (р=0,03) и 5 (83,3%) участках кожи век с дерматогелиозом III—IV стадии (р=0,02) (рис. 1—3). Кроме того, в очагах АК и кожи с дерматогелиозом III—IV стадии во всех случаях отмечена слабая (+) экспрессия данной протеиназы, что статистически значимо (p=0,0008) отличается от очагов БКР, где слабая экспрессия ММП-1 не выявлена ни в одном из изученных образцов. Однако в паренхиме очагов БКР в 7 (87,5%) случаях выявлена сильная (+++) и в 1 (12,5%) — умеренная (++) экспрессия ММП-1, что статистически значимо (р=0,005) отличается от очагов АК и кожи с дерматогелиозом III—IV стадии. В дерме кожи с дерматогелиозом II стадии ММП-1 также не обнаружена, что статистически значимо отличалось от очагов кожи с дерматогелиозом III—IV стадии (р=0,02), очагов АК (р=0,03) и стромы БКР (р=0,0003), где в 100% случаев выявлена слабая (+) экспрессия ММП-1.

ММП-9 в эпидермисе кожи с дерматогелиозом II стадии не обнаружена в 6 (100%) случаях. Полученные результаты статистически значимо отличались от 5 (83,3%; p=0,02) участков кожи с дерматогелиозом III—IV стадии, 7 (87,5%; p=0,005) очагов АК и 8 (100%; p=0,0003) случаев БКР, где экспрессия ММП-9 была зарегистрирована (рис. 4—6). В 7 (87,5%) очагах БКР в паренхиме опухоли зарегистрирована сильная (+++) экспрессия ММП-9, что статистически значимо различалось от участков АК (р=0,001) и кожи с дерматогелиозом III—IV стадий (р=0,005), в которых во всех случаях отмечена слабая экспрессия ММП-9. Кроме того, в 1 (12,5%) очаге БКР в паренхиме выявлена умеренная (++) экспрессия данной протеиназы. Во всех случаях в дерме кожи с дерматогелиозом III—IV стадии, очагов АК и строме опухолевых комплексов БКР интенсивность экспрессии ММП-9 в виде коричневого диффузного окрашивания цитоплазмы клеток была охарактеризована как слабая (+).

Итак, выявлено, что ММП-1 и ММП-9 вырабатываются не только после острого воздействия УФО, но и экспрессируются постоянно в коже с дерматогелиозом III—IV стадии по Глогау. Известно, что ММП ассоциированы именно с клетками тканей «хозяина» гораздо в большей степени, чем с клетками опухоли, что усиливает значение опухолевого микроокружения в процессе канцерогенеза [25]. Полученные данные позволяют предположить, что выявление постоянной экспрессии ММП в коже ассоциируется с нарастанием степени дерматогелиоза, что создает условия, способствующие канцерогенезу — от неопластической трансформации кератиноцитов до опухолевого ангиогенеза и инвазии в окружающие ткани [11, 14, 15].

Кроме того, анализ различных уровней экспрессии ММП-1 и ММП-9 в коже с дерматогелиозом, в очагах АК и БКР кожи методом иммуногистохимического исследования дает основания заключить, что интенсивная экспрессия данных ММП ассоциирована с большим злокачественным потенциалом эпителиальных опухолей кожи и коррелирует со способностью опухолей к инвазии [26]. Так, экспрессия ММП-1 и ММП-9 в очагах АК наравне с кожей, поврежденной в результате кумулятивного эффекта УФО, свидетельствует о возможной роли ММП в начальных стадиях канцерогенеза в процессе дерматогелиоза, слабый (+) уровень экспрессии объясняется низким инвазивным и злокачественным потенциалом данного предракового дерматоза [27]. Выявленная интенсивная (+++) экспрессия ММП-1 и ММП-9 в опухолевых комплексах БКР, по-видимому, обусловлена злокачественным характером данного новообразования кожи, слабая (+) экспрессия ММП в строме опухоли отражает характер течения базалиом кожи, имеющих местнодеструирующий рост и крайне редко метастазирующих [28] (рис. 7).

Таким образом, полученные в ходе исследования результаты, свидетельствующие о постоянной экспрессии ММП-1 и ММП-9 не только в очагах эпителиальных новообразований кожи, таких как АК и БКР, но и в коже с дерматогелиозом III—IV стадии, являются доказательством их роли в УФО-индуцированном канцерогенезе в процессе дерматогелиоза путем создания способствующего ему микроокружения. Экспрессия ММП-1 и ММП-9 различной интенсивности в неоплазиях кожи с разным инвазивным потенциалом (АК и БКР) является дополнительным подтверждением роли изученных ММП в способности эпителиальных опухолей к инвазии в окружающие ткани. Более того, ММП могут стать перспективными потенциальными субстратами для таргетной противоопухолевой терапии.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.С.С., С.Б.Т.

Сбор и обработка материала: Е.В.К., Л.Э.З.

Статистическая обработка: Е.В.К.

Написание текста: Е.В.К., Л.Э.З.

Редактирование: Е.С.С., С.Б.Т.

Конфликт интересов отсутствует.