Локальное воспаление мозга — проблема чрезвычайно актуальная и социально значимая [1—5]. Главный интерес для медицины в этой области представляют закономерности развития очага воспаления. Для эффективного терапевтического вмешательства в развитие локальных воспалений необходимо знать природу механизмов заживления, в частности роль присутствующих в очаге клеток. Непременным компонентом очага являются тромбоциты — клетки, разносторонне влияющие на воспаление. Описано ускорение регенерации после повышения концентрации тромбоцитов в исследуемом органе [6—8], однако в литературе сведений о роли тромбоцитов в регенерации мозга мы не нашли. Есть сообщения о нейропротективном [9, 10] и нейрогенном [11] действии VEGF. В то же время тромбин оказался нейротоксичным [12]. Очевидно, даже зная об изолированном действии нескольких тромбоцитарных факторов, невозможно спрогнозировать их суммарный эффект, который не будет равен эффекту нативных тромбоцитов. Поэтому в настоящей работе исследовали влияние суспензии тромбоцитов на заживление очага локального воспаления в коре головного мозга.

Воспалительные очаги в головном мозге существенно отличаются от таковых в других органах, что выражается в значительно большем участии макрофагов в воспалении мозга [13]. Отмечена связь макрофагов с ангиогенезом: описано увеличение удельной площади микрососудов соответственно увеличению числа макрофагов при инсульте [14].

Нас интересовала связь процессов регенерации в очаге локального воспаления мозга с его кровоснабжением.

С этой целью мы использовали известный эффект микрогравитации — перераспределение жидкостей организма в краниальном направлении и переполнение кровеносных сосудов головы, которое модулируется антиортостатическим положением тела.

Эксперименты на крысах-самцах Вистар массой 280—310 г выполнены в соответствии со стандартами GLP (Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 53434-2009). Животным под эфирным наркозом рассекали кожу по средней линии головы, в операционном поле удаляли надкостницу. Для того чтобы исследовать в развитии повреждения-восстановления не только морфологию, но и двигательную функцию, повреждающий объект (трансплантат) вводили в моторную зону коры левого полушария мозга — в участок, ответственный за движение правой передней лапы (поле S1FL). Точные координаты места повреждения определяли по стереотаксическому атласу [15]: от брегмы в ростральном направлении 2 мм, от средней линии черепа латерально 4 мм, глубина введения 2,5 мм. Череп сверлили буром, трансплантат вводили катетерной иглой с ограничителем глубины погружения. Диаметр иглы (1,7 мм) совпадал с диаметром бура. После введения иглу удерживали в отверстии 3—4 мин для предотвращения вытекания трансплантата. Операцию всегда проводили на левом полушарии, об успешности судили по парезу правой передней лапы крысы.

Трансплантат состоял из измельченной гемостатической коллагеновой губки (ОАО «Лужский завод “Белкозин”») и богатой тромбоцитами плазмы (БТП) крови кролика (опыт) или не содержащей клеток плазмы крови кролика (контроль). Объем трансплантата — 300 мкл, количество тромбоцитов — 6·10⁷. В контроле трансплантат представлял собой смесь диспергированной в фосфатном буфере (ФБ) коллагеновой губки и плазмы в равном объеме. В опыте содержание губки и БТП не было строго 50%: оно незначительно менялось ради постоянства числа тромбоцитов в трансплантате. БТП получали из цельной крови кролика, взятой из ушной вены в 9% цитрат натрия (9:1) и центрифугированной (900 об/мин, 10 мин, 23 °С). Надосадочную часть, которая и являлась БТП, забирали, а оставшуюся часть центрифугировали при 2700 об/мин еще 10 мин (23 °С). После 2-го центрифугирования в надосадке оставалась бесклеточная плазма.

Через 7 сут после создания очага и последней проверки двигательной активности, под эфирным наркозом проводили транскардиальную перфузию мозга. Катетер перфузирующей системы вводили в левый желудочек сердца крысы и через него последовательно пропускали 15 мл 0,9% раствора NaCl и 10 мл 4% раствора параформальдегида на ФБ. Череп вскрывали, головной мозг извлекали целиком и фиксировали в 4% растворе параформальдегида на ФБ.

Место введения трансплантата было видно на извлеченном мозге, и в дальнейшем все манипуляции проводили, ориентируясь на расположение трансплантата. На вибратоме получали фронтальные срезы толщиной 20 мкм, проходящие через место введения трансплантата. Срезы помещали на стекло с поли-L-лизиновым покрытием, высушивали и окрашивали по разработанной нами методике [16]. Съемку препаратов проводили с помощью микроскопа BX51 Olympus и программы Cell-F. При гистологической обработке материала бóльшая часть трансплантата обычно не сохранялась, она была представлена только узкой границей с тканью мозга. Далее к периферии различали зону инфильтрата и пограничную область, занятую клетками инфильтрата и нейронами (судя по морфологии, среди них встречались живые и мертвые). Окружающую пограничную область зону нейронов, не имеющих видимых структурных изменений, считали неповрежденной корой.

Для увеличения точности морфологического анализа в зонах инфильтрата, пограничной и неповрежденной коры вырезали кусочки размером 1 мм3 для заливки в эпоксидную смолу и приготовления полутонких (1 мкм) срезов.

Условия микрогравитации моделировали снятием нагрузки с задних и частично с передних конечностей путем создания режима антиортостатической гипокинезии (АНОГ; 2-я подопытная группа). С этой целью крыс, оперированных по схеме 1-й подопытной группы, после выхода из наркоза одевали в специальные костюмы и на 7 сут подвешивали в сконструированных для таких экспериментов клетках головой вниз под углом 30°. Костюмы были сшиты из плотной синтетической ткани с отверстиями для передних и задних лап; в области спины в ткань костюма вшивали металлические пластины, которые обеспечивали прямое положение позвоночного столба и исключали прогибание спины животного во время эксперимента. Стенки клетки были выполнены из органического стекла, пол — сетчатый. Подвеска на блоке и карабин позволяли животному беспрепятственно перемещаться по клетке, иметь свободный круглосуточный доступ к воде и пище. Поскольку задние конечности крысы не имели контакта с полом, животное передвигалось с помощью передних лап.

Двигательную активность исследовали перед операцией и на 7-е сутки после операции на установке Beam walking для крыс (ООО «НПК Открытая Наука»). Движения животных 2-й подопытной группы исследовали через 1 ч после возврата из АНОГ к нормальному положению тела. Двигательную активность оценивали полуколичественным методом — по увеличению количества начисляемых баллов, соответствующих углублению расстройства движений. Использовали следующую шкалу:

— время прохождения установки — не более 15 с. Соскальзывание передних лап было случайным — 1 балл;

— систематическое соскальзывание правой передней лапы с верхней планки на нижнюю с дальнейшей опорой на нее в последней четверти дистанции — 2 балла;

— систематическое соскальзывание правой передней лапы с верхней планки на нижнюю с дальнейшей опорой на нее на протяжении второй половины дистанции — 3 балла;

— передвижение по стреле с хромотой. Систематическое соскальзывание правой передней лапы с верхней планки на нижнюю на всей дистанции — 4 балла;

— передвижение по стреле с явно выраженной хромотой. Избегание опоры на правую переднюю лапу. Перенос опоры при движении на левую половину тела — 5 баллов;

— правая передняя конечность недееспособна. Животное теряет равновесие, замирает на установке и дрожит. Остановки продолжительностью более 6 мин — 6 баллов.

В контрольной группе из 9 оперированных животных в первую ночь после операции погибли 3 крысы, в 1-й подопытной группе из 12 — 4 особи, во 2-й из 24 — 18 крыс. На вскрытии обнаруживали обширные эпидуральные и субдуральные кровоизлияния в левом полушарии головного мозга. При морфологическом анализе фронтальных срезов головного мозга погибших крыс установили, что кровоизлияния распространялись только на кору полушария, не проникая в белое вещество и в желудочки. Создание моделированного кровоизлияния в мозг выразилось парезом правой передней лапки у всех 45 оперированных животных.

При оценке функции движения по описанной системе баллов получены следующие результаты (каждая цифра — одно животное из группы). В контроле — 4, 2, 3, 3, 3, 2 балла. М=2,8±0,75; в 1-й подопытной группе (тромбоциты, нормальная гравитация) — 2, 2, 3, 1, 1, 2, 2, 2 балла. М=1,8±0,64; во 2-й подопытной группе (тромбоциты, АНОГ): 6, 5, 5, 6, 5, 5 баллов. М=5,3±0,51. Наиболее полное восстановление двигательной активности происходило в 1-й подопытной группе, значения в которой достоверно различались по критерию Вилкоксона (р<0,01) от контрольной и 2-й подопытной группы. Функциональные различия групп представлены на рис. 1.

Морфологическое исследование мозга контрольных животных позволило обнаружить признаки расстройства кровообращения, сохраняющиеся на 7-е сутки после операции. На рис. 2

Наряду с разрушением сосудистой сети в этой группе наблюдали и восстановление ее — новообразование сосудов (рис. 3).

Первая подопытная группа (суспензия тромбоцитов в очаге, нормальная гравитация) заметно отличалась от контроля.

Кровеносные сосуды встречались в пограничной зоне в количестве, значительно большем, чем в контрольной группе (рис. 5).

Животные 1-й подопытной группы отличались от таковых в контрольной реакцией макрофагов, которых было значительно больше. Почти у всех гранулы были окрашены в зеленый цвет (метахромазия). Наблюдалась интересная особенность «поведения» макрофагов: они участвовали в образовании сосудистой стенки (рис. 6).

Стимуляция ангиогенеза тромбоцитами ярко выразились в случайной находке, представленной на рис. 7.

Стимуляция ангиогенеза проявлялась и гипертрофией сосудов в пограничной зоне (рис. 8).

Морфологические изменения у животных, подвергнутых АНОГ, выразились снижением стимулирующего действия тромбоцитов на заживление очага. Грубое нарушение циркуляции — экстравазаты, редкие в 1-й подопытной группе, во 2-й обнаруживались часто. На нарушение оттока и застой крови указывал тот факт, что многие продольно срезанные капилляры, незаметные при нормальном кровообращении, четко визуализировались. Это наблюдалось как в пограничной зоне, так и в окружающей очаг нормальной коре (рис. 9, 10).

Анализ материала 2-й подопытной группы убедил, что появление в очаге особой популяции макрофагов с зелеными гранулами обусловлено присутствием тромбоцитов. В контрольной группе таких макрофагов не было, а в обеих подопытных группах с тромбоцитами в очаге эти макрофаги постоянно встречались (рис. 12).

Словом «макрофаги» в представленном тексте обозначаются клетки по их структуре. По происхождению это истинные макрофаги — бывшие моноциты и микроглиоциты. Будучи активированными, эти клетки структурно и цитохимически не различаются. Основываясь на том, что наши макрофаги с зелеными гранулами сосредоточены в сосудистой стенке и около нее, выскажем предположение, что примененное нами окрашивание позволяет выявить так называемую пере- и юкставаскулярную микроглию после активации. Макрофаги с зелеными гранулами присутствовали только в опыте, т.е. при наличии тромбоцитов. Однако если в 1-й подопытной группе почти все макрофаги имели зеленые гранулы, то во 2-й вдали от сосудов было много клеток со светлыми гранулами (рис. 13).

1. Разработанная модель воспалительного очага (кровоизлияния) в коре головного мозга обеспечивает строго воспроизводимое по локализации и нарушению функции повреждение. Модель позволяет вводить и длительно сохранять в очаге испытуемые материалы. Крупный недостаток модели — высокая послеоперационная смертность.

2. Присутствие суспензии ксеногенных тромбоцитов в очаге стимулирует заживление. Быстрее восстанавливается функциональная активность, резко снижается распространенность экстравазатов, увеличиваются число вновь образованных сосудов и их калибр. В очаг привлекается больше макрофагов. Появляется особая популяция макрофагов, отличающаяся зеленым цветом гранул и локализацией в сосудистой стенке и около нее.

3. Помещение крыс после операции создания очага в условия АНОГ 30° в 2 раза увеличивает послеоперационную смертность от кровоизлияний в мозг. Мы считаем это следствием нарушения циркуляции, вызванного АНОГ. Нарушения циркуляции при АНОГ документируются стазом крови в капиллярах и более крупных сосудах, причем стаз развивается не только в очаге, но и в сосудах неповрежденной (по структуре нейронов) коры вблизи очага. АНОГ существенно увеличивает распространенность и массив кровоизлияний (экстравазатов). Это объясняет повышение летальности. АНОГ не изменяет обусловленное тромбоцитами появление особой популяции макрофагов с зелеными гранулами.

4. В условиях АНОГ через 7 сут после операции двигательная функция не восстанавливается. Движения крыс достоверно отличаются от таковых в группе сравнения (1-й подопытной) и практически соответствуют критерию «конечность недееспособна».