Рыжова М.В.

ФГБУ "НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко" РАМН, Москва

Снигирева Г.П.

ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава России, ул. Профсоюзная, 86, Москва, Россия, 117997

Голанов А.В.

ФГБУ "НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко" РАМН, Москва

Желудкова О.Г.

ГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздрава РФ им. Д. Рогачева, Москва

Трунин Ю.Ю.

ФГБНУ «НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» РАН, Москва

Антипина Н.А.

ФГБУ "НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко" РАМН, Москва

Корректное использование ДНК-зондов Kreatech для выявления амплификации гена MYC в медуллобластомах методом флюоресцентной гибридизации in situ

Журнал: Архив патологии. 2019;81(4): 66-72

Просмотров : 21

Загрузок : 2

Как цитировать

Рыжова М. В., Снигирева Г. П., Голанов А. В., Желудкова О. Г., Трунин Ю. Ю., Антипина Н. А. Корректное использование ДНК-зондов Kreatech для выявления амплификации гена MYC в медуллобластомах методом флюоресцентной гибридизации in situ. Архив патологии. 2019;81(4):66-72. https://doi.org/10.17116/patol20198104166

Авторы:

Рыжова М.В.

ФГБУ "НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко" РАМН, Москва

Все авторы (6)

Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) является одним из самых простых в применении и интерпретации, экономичных и менее трудозатратных методов исследования хромосомных аномалий в рутинной практике отделений, занимающихся онкопатологией [1—5]. Однако на сегодняшний день все больше патологов и биологов сталкиваются с необходимостью использовать именно те расходные материалы и генетические зонды, которые имеют регистрационное удостоверение на территории Российской Федерации. С сожалением должны констатировать, что наличие регистрационного удостоверения не всегда свидетельствует о том, что данный зонд подходит для изучения количественных изменений генов-кандидатов.

В рутинной практике патолого-анатомического отделения ФГАУ «Национальный медицинский исследовательский центр нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко» Минздрава России мы неожиданно столкнулись с проблемой, когда оказались не способны обнаружить амплификацию гена MYC. Врачи-специалисты, вовлеченные в комплексное лечение медуллобластом у детей, обратили внимание нейропатологов на то, что как минимум у 4 детей с диагнозом медуллобластомы, несмотря на проводимое лечение и диагностированный у них методом FISH сбалансированный профиль 8-й хромосомы (отсутствие амплификации гена MYC), характер ответа на лечение и течение заболевания в виде неконтролируемой прогрессии с последующим быстрым летальным исходом соответствовали атипической тератоидно-рабдоидной опухоли либо MYC-амплифицированной медуллобластоме.

Мы попросили наших немецких коллег исследовать эти 4 опухоли методом метилирования ДНК на платформе Illumina 850k в Хайдельберге (Германия) и повторили метод FISH для выявления возможной амплификации гена MYC с зондами Kreatech, Vysis и Zytolight в патолого-анатомическом отделении НМИЦ нейрохирургии и в лаборатории молекулярной биологии и цитогенетики РНЦРР, при этом с удивлением выявили, что не все ДНК-зонды пригодны для обнаружения амплификации гена MYC в медуллобластомах.

Материал и методы

Для постановки реакции флюоресцентной гибридизации in situ использовали фрагменты ткани опухолей медуллобластом, фиксированные в формалине и залитые в парафин. С парафиновых блоков подготавливали срезы толщиной 2 мкм, помещали на предметные стекла Polysine Menzel-Gläser и инкубировали ночь в термостате при 45 °C. На одно стекло помещали один образец опухоли.

Далее использовали методику флюоресцентной гибридизации in situ с применением стандартных протоколов, прилагающихся к наборам для предварительной обработки Leica (Kreatech) Biosystems Tissue Digestion Kit I и Vysis Paraffin Pretreatment IV & Post-Hybridization Wash Buffer Kit. Использовали следующие пробы: Kreatech MYC (8q24) / SE 8, Kreatech TERC (3q26) / MYC (8q24)/SE 7 Triple-Color, Kreatech MYCN (2P24)/AFF3 (2q11), Vysis LSI MYC SO, Vysis CEP 8 (D8Z2) SG, Vysis LSI N-MYC SG/CEP 2 SO, Zytolight SPEC MYC/CEN 8 Dual Color Probe. После нанесения проб предметные стекла накрывали покровными стеклами и обрабатывали клеем Leica (Kreatech) Fixogum Rubber Cement.

ДНК-зонды Kreatech имеют регистрационное удостоверение на территории РФ. ДНК-зонды Vysis и Zytolight на момент написания статьи не имели регистрационного удостоверения на территории РФ.

Метод FISH проводили с помощью гибридизационных камер ThermoBrite Abbott Molecular и Hybridizer DAKO, денатурацию — при 83 °C в течение 8 мин, гибридизацию — при 37 °C 22 ч. Препараты освобождали от клея, покровных стекол, промывали и заключали под покровное стекло со средой DAPI из набора Leica (Kreatech) Biosystems Tissue Digestion Kit I либо средой Vector Vectashield Mounting medium for fluorescence with DAPI. Готовые препараты хранили в холодильнике при 4 °C. Результаты оценивали спустя как минимум 3 ч на флюоресцентном микроскопе Zeiss Axioskop 40 с помощью фильтров DAPI, FITC и Orange.

Результаты

Исследование методом Illumina 850k подтвердило диагноз медуллобластомы во всех 4 случаях, у всех пациентов была диагностирована медуллобластома группы 3 с амплификацией гена MYC (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярный профиль медуллобластомы с амплификацией гена MYC (стрелка), полученный на основе исследования методом Illumina 850k. По оси абсцисс — хромосомы от 1 до 22; по оси ординат — количественные изменения на хромосомах. Зеленым цветом показаны добавки и амплификации, красным цветом — делеции.

Однако мы определили амплификацию гена MYC лишь в 3 случаях из 4. Амплификацию гена MYC удалось выявить с помощью проб (ДНК-зондов): Kreatech MYC (8q24)/SE 8, Vysis LSI MYC SO, Vysis CEP 8 (D8Z2) SG, Vysis LSI N-MYC SG/CEP 2 SO и Zytolight SPEC MYC/CEN 8 Dual Color Probe, в то время как проба Kreatech TERC (3q26)/MYC (8q24)/SE 7 Triple-Color показывала отсутствие амплификации гена MYC и сбалансированный профиль 8-й хромосомы (рис. 2).

Рис. 2. Флюоресцентная гибридизация in situ с различными ДНК-зондами к гену MYC у одного и того же пациента. С пробой Kreatech TERC (3q26)/MYC (8q24)/SE 7 Triple-Color выявлен сбалансированный профиль, в то время как пробы Kreatech MYC (8q24)/SE 8, Vysis LSI MYC SO, Vysis CEP 8 (D8Z2) SG (в красном спектре) и проба Zytolight SPEC MYC/CEN 8 Dual Color Probe (в зеленом спектре) показывают амплификацию гена MYC.

В оставшемся случае у пациента с медуллобластомой группы 3 и амплификацией гена MYC по данным исследования Illumina 850k не выявили амплификацию этого гена с использованием 4 проб, лишь Zytolight SPEC MYC/CEN 8 Dual Color Probe показывала добавку гена MYC (рис. 3).

Рис. 3. Флюоресцентная гибридизация in situ с различными ДНК-зондами к гену MYC у пациента с выявленной амплификацией гена MYC методом Illumina 850k. ДНК-зонды Kreatech TERC (3q26)/MYC (8q24)/SE 7 Triple-Color, Kreatech MYC (8q24)/SE 8, Vysis LSI MYC SO, Vysis CEP 8 (D8Z2) SG демонстрируют сбалансированный профиль: в то время как проба Zytolight SPEC MYC/CEN 8 Dual Color Probe (в зеленом спектре) показывает небольшую полисомию гена MYC.

Кроме того, как выяснилось в результате обсуждения и сравнительно-сопоставительного анализа между исследованием медуллобластом методом Illumina 850k и флюоресцентной гибридизации in situ, были также пропущены две амплификации гена MYCN. Обе имеющиеся у нас в наличии пробы Kreatech MYCN (2P24) / AFF3 (2q11) и Vysis LSI N-MYC SG/CEP 2 SO выявили сбалансированный профиль 2-й хромосомы, в то время как Illumina 850k показывала четкую амплификацию гена MYCN (рис. 4).

Рис. 4. Молекулярный профиль медуллобластомы с амплификацией гена MYCN (стрелка), полученный на основе исследования методом Illumina 850k. По оси абсцисс — хромосомы от 1 до 22, а также хромосомы X и Y; по оси ординат — количественные изменения на хромосомах. Зеленым цветом показаны добавки и амплификации, красным цветом — делеции.

Обсуждение

Как известно, медуллобластома является злокачественной опухолью, однако на сегодняшний день это курабельное заболевание, у большинства пациентов удается достичь стойкой ремиссии. Лишь одно достаточно редкое генетическое нарушение делает медуллобластому потенциально летальным заболеванием — это амплификация гена MYC [6, 7]. Поэтому нам необходимо в диагностике медуллобластом иметь простой в использовании метод для оценки копийности 8-й хромосомы, несомненно, таким методом является флюоресцентная гибридизация in situ. Особую роль играет и качество ДНК-зондов, с чем нам абсолютно неожиданно пришлось столкнуться на практике, что, безусловно, послужило не только печальным, но и поучительным опытом, заставляющим с большей осторожностью относиться к появляющимся в мире ДНК-зондам для диагностики онкопатологии. Лишь сопоставление с данными, полученными при помощи метода Illumina 850k, привело нас к мысли аккуратнее использовать пробы Kreatech. В настоящей работе доказано, что одна из имеющих регистрационное удостоверение проб Kreatech не должна использоваться для диагностики копийности гена MYC, однако мы не сравнивали результаты гибридизации других проб Kreatech с ДНК-зондами других производителей. В настоящий момент ДНК-пробы Kreatech широко применяются для исследования количественных изменений на 1-, 7- и19-й хромосомах в глиальных опухолях у взрослых и для оценки копийности гена HER-2 (human epidermal growth factor receptor 2) в метастазирующих в мозг опухолях молочной железы, поскольку от результатов гибридизации напрямую зависит выбор протокола лечения олигодендроглиом, глиобластом и метастазов рака молочной железы.

Следует отметить, что альтернативой флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) для оценки гена MYC может служить хромогенная гибридизация in situ CISH при наличии в лаборатории иммуностейнера Ventana, обладающего специальной программой и зондом. В своей практике ранее мы использовали методы FISH и CISH, результаты показали четкую корреляцию (рис. 5).

Рис. 5. Сравнение хромогенной и флюоресцентной гибридизации in situ.

Безусловно, идеальным методом молекулярной диагностики медуллобластом, как собственно и всех других опухолей центральной нервной системы, а также круглоклеточных детских сарком, является оценка структуры метилирования ДНК на уровне всего генома на платформе Illumina 850k [8—10]. Методом Illumina 850k диагностированы те редкие амплификации генов MYC/MYCN, которые ни одна из использованных проб не смогла выявить, вероятно, речь идет о некоей особой локализации генов интереса в данных медуллобластомах.

Однако в рутинной практике отделений и лабораторий, вовлеченных в диагностику и исследования генетических нарушений в опухолях, методом выбора для исследования копийности гена MYC может являться флюоресцентная гибридизация in situ с ДНК-зондами Kreatech MYC (8q24) / SE 8, Vysis LSI MYC SO, Vysis CEP 8 (D8Z2) SG и Zytolight SPEC MYC/CEN 8 Dual Color Probe. Однако пробу Kreatech TERC (3q26)/MYC (8q24)/SE7 Triple-Color мы настоятельно не рекомендуем использовать для данной цели, несмотря на наличие регистрационного удостоверения на территории Российской Федерации. Кроме того, нам кажется, что пробы/зонды для флюоресцентной гибридизации in situ перед применением в широкой практике и получением регистрационного удостоверения на территории Российской Федерации должны быть обязательно тестированы с использованием позитивных и негативных контролей в крупных референсных лабораториях, занимающихся той или иной онкопатологией.

Исследование проведено в рамках:

— Соглашения о научном сотрудничестве № 10 от 18.05.16 между НМИЦ нейрохирургии и РНЦРР;

— НИР РНЦРР, выполняемой согласно государственному заданию Минздрава России, запланированному на 2018—2020 гг. по платформе «Онкология» и по теме 3: Идентификация и оценка клинической значимости молекулярно-генетических маркеров риска возникновения и прогноза злокачественных новообразований и разработка новых методов противоопухолевой терапии на основании перспективных терапевтических мишеней (клеточные технологии, средства генной и пептидной терапии) в разделе «Молекулярно-генетические факторы прогноза и предиктивные маркеры при злокачественных опухолях головного мозга»;

— Гранта РНФ 18−45−06012 «Индивидуализация стратегии лечения медуллобластом у детей на основании молекулярно-генетического типирования».

Авторы сердечно благодарят prof. Andrey Korshunov (Heidelberg, Германия) за оказанные неоценимые помощь, дружескую поддержку, ценные советы, а также предоставленную возможность исправить собственные ошибки.

Авторы выражают признательность Благотворительному фонду Константина Хабенского за оказанную поддержку при приобретении для проведения флюоресцентной гибридизации in situ имеющих высокое качество, но не имеющих регистрационного удостоверения зондов Vysis.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Рыжова М.В. — д-р мед. наук, https://orcid.org/0000-0001-7206-6365, e-mail: mrizhova@nsi.ru;

Снигирева Г.П. — д-р биол. наук, https://orcid.org/0000-0002-2584-802X, e-mail: sni_gal@mail.ru;

Голанов А.В. — д-р мед. наук, проф., https://orcid.org/000;0-0002-0976-4547, e-mail: golanov@nsi.ru;

Желудкова О.Г. — д-р мед. наук, проф., https://orcid.org/0000-0002-8607-3635; e-mail: clelud@mail.ru;

Трунин Ю.Ю. — канд. мед. наук, e-mail: ytrunin@nsi.ru;

Антипина Н.А. — e-mail: nantipina@nsi.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Рыжова М.В., Снигирева Г.П., Голанов А.В., Желудкова О.Г., Трунин Ю.Ю., Антипина Н.А. Корректное использование ДНК-зондов Kreatech для выявления амплификации гена MYC в медуллобастомах методом флюоресцентной гибридизации in situ. Архив патологии. 2019;81(4):-72. https://doi.org/10.17116/patol201981041

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail