Демура Т.А.

Кафедра патологической анатомии им. И.М. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Коган Е.А.

Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова, Москва

Занозин А.С.

ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России

Колосовский Д.Ю.

ООО «Доктор Колосовский», Москва

Файзуллина Н.М.

ФГБУ "НЦАГиП им. акад. В.И Кулакова" Минздрава России, Москва

Калинина Е.А.

ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва

Роль наследственных тромбофилий и синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани в патогенезе женского бесплодия (клинико-морфологическое исследование)

Журнал: Архив патологии. 2015;77(4): 3-10

Просмотров : 23

Загрузок : 4

Как цитировать

Демура Т. А., Коган Е. А., Занозин А. С., Колосовский Д. Ю., Файзуллина Н. М., Калинина Е. А. Роль наследственных тромбофилий и синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани в патогенезе женского бесплодия (клинико-морфологическое исследование). Архив патологии. 2015;77(4):3-10. https://doi.org/10.17116/patol20157743-10

Авторы:

Демура Т.А.

Кафедра патологической анатомии им. И.М. Струкова Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова

Все авторы (6)

В литературе широко обсуждается роль наследственных тромбофилий (НТ) и синдрома недифференцированной дисплазии соединительной ткани (нДСТ) в патогенезе бесплодия и невынашивания беременности [1—7].

НТ — гетерогенная группа заболеваний, характеризующаяся склонностью к повышенной свертываемости крови в результате генных мутаций. Эти мутации могут затрагивать гены факторов свертывания крови (мутация фактора V Лейдена, мутация протромбина (F II) G20210A), гены рецепторов тромбоцитов, гены модуляторов активности факторов свертывания (MTHFR C677T, MTHFRA 1298C, тромбомодулин, гипергомоцистеинемия, дефицит антитромбина III, дефицит протеина С, дефицит протеина S, резистентность фактора V к активированному протеину С, TFPI) либо фибринолиза (PAI-1). Кроме того, необходимо принимать во внимание стойкое увеличение концентрации и/или активности факторов свертывания крови: фибриногена, факторов II, VIII, IX или XI, а также образование в крови антифосфолипидных антител, в том числе обладающих свойствами волчаночного антикоагулянта [1—3, 7, 8].

Как известно, тромбофилии оказывают негативное влияние на многие этапы беременности, начиная от имплантации яйцеклетки и заканчивая тромботическими осложнениями III триместра беременности [3]. Патогенез нарушений репродуктивной функции женщин при нДСТ и НТ не изучен. Известно, что при НТ существенно повышен риск неудач экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), а также «замерших» беременностей и выкидышей на ранних сроках гестации [5, 9—11].

Синдром нДСТ — группа генетически гетерогенных и клинически полиморфных патологических состояний, обусловленная нарушением развития соединительной ткани в эмбриональном и постнатальном периодах, характеризующаяся дефектами волокнистых структур и основного вещества соединительной ткани, приводящая к расстройству гомеостаза на тканевом, органном и организменном уровнях в виде различных морфофункциональных нарушений висцеральных и локомоторных органов и прогредиентному течению. Синдром нДСТ связан с рядом генов, часть из которых отвечает за НТ, например PAI-1, ADAMTS13 и др. [5, 6, 8, 12].

Нарушения имплантации яйцеклетки в эндометрий вследствие его патологии и изменения его рецептивности являются, согласно данным литературы, причиной около 75% потерь беременностей [4]. Рецептивность эндометрия — это комплекс структурно-функциональных характеристик эндометрия с конкретными пространственными и временны́ми константами, определяющий способность эндометрия к имплантации [12]. Отмечается ряд морфологических проявлений этого состояния: эндометрий находится в средней стадии фазы секреции (так называемом «окне имплантации»), на поверхностном эпителии эндометрия имеются в достаточном количестве зрелые пиноподии (не менее 30% площади поверхностного эпителия эндометрия), ряд маркеров (LIF, αvβ3-интегрин и др.) экспрессируется на поверхностном эпителии. Экспрессия PAI-1 определяет вероятность развития очагового фиброза стромы, а экспрессия VEGF — уровень неоангиогенеза в строме эндометрия [4, 6, 8]. Вопрос о состоянии эндометрия при нДСТ и НТ остается открытым.

Целью данного исследования является изучение морфологического субстрата нарушений рецептивности эндометрия у женщин с синдромом нДСТ, НТ, при их сочетании, а также роль этих синдромов в патогенезе женского бесплодия.

Материал и методы

Исследование выполнено на пайпель-биоптатах эндометрия, полученных от 81 пациентки, которых разделили на 4 группы: 1-я — 19 пациенток с сочетанием клинических диагнозов нДСТ и НТ (средний возраст 32,3±4,7 года), 2-я группа — 40 пациенток с клиническим диагнозом НТ (средний возраст 32,6±4,8 года), 3-я группа — 13 пациенток с клиническим диагнозом нДСТ (средний возраст 31,9±4,5 года) и 4-я группа, состоящая из 9 пациенток, — группа контроля, здоровые суррогатные матери.

Критерии включения в основные группы: репродуктивный возраст, бесплодие в анамнезе, наличие диагноза нДСТ и НТ либо сочетания этих заболеваний. Критерии исключения: наличие гиперпластических процессов эндометрия и тяжелой сопутствующей патологии (ревматические болезни, онкологические заболевания, сахарный диабет). Критерии постановки диагноза нДСТ: соответствующий набор симптомов, выявляемых при объективном осмотре, в соответствии с рекомендациями Т.И. Кадуриной и соавт. [13].

28 пациенткам с тромбофилиями (независимо от наличия нДСТ) по поводу бесплодия был проведен суммарно 81 протокол вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) — инсеминация и ЭКО, из них 73 (90,1%) протокола у 26 (92,9%) пациенток завершились неудачей, 8 (9,9%) — «замершей» беременностью на сроке до 10 нед. В группе нДСТ + НТ протоколы ЭКО завершились неудачей у 9 (90%) из 10 пациенток. В группе НТ протоколы ЭКО завершились неудачей у 17 (94,4%) из 18 пациенток.

У каждой пациентки, отобранной в исследование, брали пайпель-биоптаты эндометрия в период «окна имплантации» (6—8-й день после овуляции по данным УЗИ).

Материал фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. Приготавливали серийные парафиновые срезы толщиной 4 мкм. Часть срезов окрашивали гематоксилином и эозином, другую часть использовали для постановки иммуногистохимических реакций со следующими первичными антителами: к рецепторам эстрогена (ER, clone 1D5, «Dako», Дания, ready-to-use), к рецепторам прогестерона (PgR, clone 636, «Dako», Дания, ready-to-use), к белку PAI-1 (PAI-1, cloneH-135, разведение 1:100, «SantaCruz», США), к белку VEGF-A (разведение 1:100, «Abbiotec», США), к белку LIF (разведение 1:100, «Sigma», Швеция).

Депарафинирование срезов осуществляли в растворе Bioclear («Bio-Optica», Италия). Антигенную демаскировку проводили путем инкубации в 10 мМ цитратном буфере, рН 6,0 («Dako», Дания), путем автоматического нагрева буфера до 96 °C, поддерживали эту температуру в течение 20 мин. Ставили положительные и отрицательные контроли. Контрастирование ядер осуществляли раствором гематоксилина Майера (ООО «ЭргоПродакшн», Россия) [14]. Оценку степени экспрессии маркеров PgR, ER в эпителии и строме эндометрия осуществляли посредством шкалы HistoScore. По этой шкале результат реакции рассчитывали как сумму числа (в %) интенсивно окрашенных клеток (a), умноженного на 3, числа (в %) умеренно окрашенных клеток (b), умноженного на 2, и числа (в %) слабо окрашенных клеток ©, умноженного на 1 (HistoScore = 3⋅a + 2⋅b + 1⋅c). Cтромальный прогестерон-эстрогеновый индекс (СПЭИ) — соотношение степени экспрессии прогестероновых рецепторов в строме эндометрия к степени экспрессии эстрогеновых рецепторов в строме эндометрия. За норму принимали СПЭИ в промежутке от 2 до 4 [15]. Оценку степени экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF осуществляли посредством подсчета окрашенных клеток одного типа. Оценку «–» (0 баллов) ставили, если окрашенные клетки отсутствовали, «1+» (2 балла) — при 20% окрашенных клеток, «2+» (4 балла) — при 20—40% окрашенных клеток, «3+» (6 баллов) — при 40% окрашенных клеток и более. Для каждой из групп рассчитывали средний балл экспрессии маркеров LIF, PAI-1, VEGF и стандартное отклонение.

Статистическую обработку проводили с помощью программы Microsoft Excel. При статистической обработке для оценки достоверности различий средних значений между группами использовали t-критерий Стьюдента (формула для n≤30). Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Результаты

Для оценки рецептивности эндометрия морфологическому исследованию подвергали эндометрий в период «окна имплантации». В группе пациенток с нДСТ + НТ в 37% случаев выявлены изменения эндометрия, соответствующие поздней стадии фазы пролиферации — железы извитые, с митозами, ядра клеток железистого эпителия округлой формы, некоторые с ядрышками, отмечалась тенденция к расположению ядер в базальной части клеток, строма компактная, ядра фибробластоподобных клеток округлой формы, относительно крупные, фибробластоподобные клетки располагаются в густой сети ретикулиновых волокон. В 47% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для ранней стадии фазы секреции — в железистом эпителии эндометрия определяется множество базально-расположенных вакуолей, при этом апикальный край клеток все еще ровный, строма в структурном отношении имеет сходство с таковой поздней фазы стадии пролиферации; в 16% случаев выявлены изменения, характерные для средней стадии фазы секреции (табл. 1). В группе пациенток с НТ в 25% случаев выявлены изменения эндометрия, соответствующие поздней стадии фазы пролиферации; в 36% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для ранней стадии фазы секреции, в 39% — изменения, характерные для средней стадии фазы секреции. В группе пациенток с нДСТ в 38% случаев установлены изменения эндометрия, характерные для ранней стадии фазы секреции, в 62% — изменения, характерные для средней стадии фазы секреции: железы извитые с широким просветом, ядра везикулярные, располагались базально, апикальный край клеток неровный с признаками апокринной секреции в просвет желез, с образованием пиноподий — микропротрузий диаметром около 6 мкм в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, экспрессирующих на своей поверхности ряд белков, необходимых для адгезии бластоцисты к поверхности эндометрия, а также признаки васкуляризации и отека стромы.

Таблица 1. Распределение материала в группах по морфологическим стадиям эндометрия в период «окна имплантации»

В группе контроля в 22% случаев обнаружены признаки ранней стадии фазы секреции. В 78% случаев выявлены изменения эндометрия, характерные для средней стадии фазы секреции.

В основных группах у 60 (83,1%) женщин в период «окна имплантации» выявлен эндометрий с признаками нарушения созревания — секреторные изменения эндометрия отставали от фазы менструального цикла по данным УЗИ, что наиболее выражено в группах больных с нДСТ + НТ и НТ (см. табл. 1). При этом в исследуемых группах наблюдали нарушение формирования пиноподий в поверхностном эпителии эндометрия (рис. 1, 2).

Рис. 1. Доля биоптатов эндометрия, лишенного зрелых пиноподий, в период «окна имплантации».

Рис. 2. Рецептивность эндометрия при сочетании нДСТ + НТ и в группе контроля. а — пиноподии в поверхностном эпителии эндометрия в группе нДСТ + НТ (окраска гематоксилином и эозином, ×630); б — пиноподии в поверхностном эпителии эндометрия в группе контроля (окраска гематоксилином и эозином, ×630); в — LIF в поверхностном эпителии эндометрия и в пиноподиях в группе нДСТ + НТ (иммунопероксидазный метод, ×400); г — LIF в поверхностном эпителии эндометрия в группе контроля (иммунопероксидазный метод, ×400).

В группе пациенток с нДСТ + НТ отсутствие зрелых пиноподий выявили у 87,2% пациенток, а в группе с НТ — у 80,6% (см. рис. 2). В группах с нДСТ + НТ и НТ часто обнаруживали очаговый склероз, расстройства микроциркуляции (кровоизлияния в строме, сладж и тромбы в микрососудах), очаги дезорганизации в строме, мелкие очажки некроза стромы эндометрия (микроинфаркты) и новообразованные сосуды. В группе с нДСТ очаги дезорганизации, склероз и новообразованные сосуды выявлены в 64% случаев. Распределение по группам показано в табл. 2.

Таблица 2. Частота встречаемости очагового склероза и расстройств микроциркуляции в строме эндометрия в период «окна имплантации»

При иммуногистохимическом исследовании рецептивности эндометрия исследовали экспрессию эстрогеновых и прогестероновых рецепторов, а также изучали соотношение их экспрессии в строме эндометрия. Эстрогеновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия. Отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах, при этом не было выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Прогестероновые рецепторы экспрессировались в ядрах эпителия и стромы эндометрия, при этом не было выявлено статистически значимых различий в экспрессии между исследуемыми группами. Также отмечалась различная степень экспрессии этого маркера в ядрах.

При анализе средних значений экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов в строме эндометрия выявили, что в группах женщин с нДСТ + НТ и НТ было высокое (свыше 65%) количество пациенток с ненормальным СПЭИ. В группе пациенток с нДСТ это значение достигало 55% (рис. 3).

Рис. 3. Доля ненормального стромального прогестерон-эстрогенового индекса в эндометрии в период «окна имплантации».

Исследование маркера рецептивности LIF выявляло его экспрессию в цитоплазме поверхностного и железистого эпителия эндометрия, в пиноподиях и цитоплазме клеток стромы эндометрия, при этом наиболее важной считалась экспрессия LIF в пиноподиях поверхностного эпителия эндометрия. При анализе экспрессии выявили, что в основных группах были существенно снижены показатели экспрессии этого маркера в поверхностном эпителии эндометрия, особенно в группах больных с нДСТ + НТ и нДСТ. У женщин в основных группах также повышалась экспрессия маркера в строме, особенно в группе нДСТ + НТ (табл. 3, см. рис. 2).

Таблица 3. Средний балл и стандартная ошибка экспрессии LIF в эндометрии Примечание. * — p<0,05 при сравнении с группой контроля, ** — p<0,05 при сравнении с группой нДСТ.

Изучение маркера PAI-1, играющего важную роль в механизмах гемостаза и фиброгенеза, выявило его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, стромы и эндотелия сосудов эндометрия. При анализе экспрессии в основных группах обнаружили резкое статистически достоверное повышение уровня экспрессии маркера в эпителии, эндотелии сосудов и строме, особенно в группе пациенток с НТ, по сравнению с группой контроля (табл. 4, рис. 4).

Таблица 4. Средний балл и стандартная ошибка экспрессии PAI-1 в эндометрии Примечание. * — p<0,05 при сравнении с группой контроля, ** — p<0,05 при сравнении с группой контроля и НТ.

Рис. 4. PAI-1 в исследуемых группах. а — эндометрий в группе с нДСТ + НТ; б — эндометрий в группе с НТ; в — эндометрий в группе с нДСТ; г — эндометрий в группе контроля. Иммунопероксидазный метод. ×400.

При исследовании VEGF отметили его экспрессию в цитоплазме клеток поверхностного и железистого эпителия, в строме и эндотелии сосудов эндометрия. Анализ экспрессии VEGF выявил, что синдром нДСТ сопровождается понижением, а НТ — статистически достоверным повышением экспрессии маркера в эпителии, строме и эндотелии сосудов эндометрия по сравнению с группой контроля (табл. 5, рис. 5).

Таблица 5. Средний балл и стандартная ошибка экспрессии VEGF в эндометрии Примечание. * — p<0,05 при сравнении с группой контроля, ** — p<0,05 при сравнении с НТ, *** — p<0,05 при сравнении с нДСТ и группой контроля.

Рис. 5. VEGF в исследуемых группах. а — эндометрий в группе с нДСТ + НТ; б — эндометрий в группе с НТ; в — эндометрий в группе с нДСТ; г — эндометрий в группе контроля. Иммунопероксидазный метод. ×400.

Обсуждение

В данном исследовании установлен морфологический субстрат нарушений рецептивности эндометрия при НТ и нДСТ. При нДСТ + НТ и НТ выявлены признаки отставания процессов созревания эндометрия: в этих группах фаза менструального цикла не соответствовала морфологическим изменениям в эндометрии. При этом существенно чаще встречались очаговый склероз стромы эндометрия и расстройства микроциркуляции: очаговые кровоизлияния в строме, сладж и тромбоз в микрососудах. Кроме того, при нДСТ + НТ средний процент зрелых пиноподий на поверхности эндометрия был существенно ниже.

Нарушенная рецептивность эндометрия в группах с нДСТ, НТ и их сочетанием проявлялась частым отклонением СПЭИ от нормальных значений. Также в группах пациенток с нДСТ + НТ и НТ отмечены перераспределение экспрессии LIF из эпителия в строму, а также более выраженная экспрессия PAI-1 и VEGF в эпителии и строме. В группе с НТ выявлена более высокая экспрессия VEGF в эндотелии по сравнению с группой контроля и нДСТ.

На основании полученных данных может быть сформулирована гипотеза развития нарушений рецептивности эндометрия при сочетании синдромов нДСТ + Н.Т. Сами по себе эти синдромы могут неблагоприятно сказываться на состоянии эндометрия, а тем более их сочетание.

В патогенезе нарушений рецептивности эндометрия одну из основных ролей играют наследственные тромбофилии. Многочисленные тромбозы микроциркуляторного русла эндометрия, несмотря на усиленный ангиогенез, проявляющийся увеличением количества новообразованных сосудов, а также повышенной экспрессией VEGF, приводят к развитию множественных микроинфарктов и как следствие очаговому склерозу стромы и нарушению трофики эндометрия, что проявляется, к примеру, замедлением процессов созревания эндометрия: к периоду «окна имплантации» эндометрий приходит в состояние ранней секреции или даже пролиферации с очень незначительным количеством зрелых пиноподий, на которых в недостаточном объеме экспрессируются молекулы, необходимые для адгезии и инвазии бластоцисты (в частности LIF), что в конечном счете приводит к невозможности инвазии бластоцисты и развитию бесплодия [4].

Синдром нДСТ в патогенезе нарушений рецептивности эндометрия играет важную роль. При синдроме нДСТ соединительная ткань не может в полной мере выполнять все свои функции по сравнению с нормой, поэтому в строме эндометрия в процессе репарации после микроинфарктов, обусловленных тромбозом микрососудов, очень часто развиваются очаговые склеротические изменения, а не реституция, что было обнаружено при морфологическом исследовании. При сочетании нДСТ + НТ частота дисциркуляторных расстройств и склероза достоверно выше (p<0,05), чем при НТ без нДСТ. Кроме того, повышенная экспрессия PAI-1, по данным литературы [9], является важным фактором развития склероза (в первую очередь нефросклероза); в нашем исследовании при синдроме нДСТ, сопровождающемся повышенной склонностью к склерозу стромы эндометрия, была повышена экспрессия PAI-1. Также при синдроме нДСТ снижена экспрессия VEGF, что свидетельствует о низком уровне ангиогенеза, проявившемся меньшим количеством новообразованных сосудов и, следовательно, слабом развитии микроциркуляторного русла и хронической гипоксии, что также является важным фактором возникновения склеротических изменений.

При сочетании синдромов нДСТ + НТ резко возрастает количество пациенток с незрелым эндометрием (морфологическая стадия пролиферации или ранней секреции в период «окна имплантации») и соответственно также значительно снижается средний процент зрелых пиноподий. При этом несколько увеличивается доля пациенток с очаговым склерозом, кровоизлияниями в строме и сладжем, тромбами в микрососудах эндометрия. При сочетании нДСТ + НТ выявлено наиболее выраженное перераспределение экспрессии LIF в сторону стромы, притом что имплантация бластоцисты возможна лишь при экспрессии LIF в пиноподиях. Поэтому пациентки с синдромами НТ, нДСТ + НТ входят в группу риска по бесплодию, а проведение ВРТ имеет плохой прогноз в отношении беременности.

Таким образом, формируется порочный круг: тромбофилии усиливают вероятность тромбоза и развития микроинфарктов, а при синдроме нДСТ снижен ангиогенез и затруднено восстановление микроциркуляции после гипоксических повреждений, что в свою очередь еще сильнее усиливает ишемическое повреждение стромы эндометрия при дисциркуляторных расстройствах. Наличие такого порочного круга ведет к относительной ишемии, которая снижает кровоснабжение и трофику, а, следовательно, и функциональную активность эпителия эндометрия, тем самым существенно понижая рецептивность эндометрия и вероятность имплантации яйцеклетки. Это характеризуется уменьшением процента зрелых пиноподий на поверхности эндометрия, нарушением соотношения PgR и ER в строме, снижением экспрессии LIF на поверхности эндометрия и перераспределением его экспрессии в строму.

Заключение

Синдромы нДСТ и НТ и особенно их сочетание являются факторами риска развития бесплодия у женщин в результате нарушения рецептивности эндометрия. Проявлениями нарушений рецептивности эндометрия являются снижение количества зрелых пиноподий в поверхностном эпителии, очаговый склероз стромы, расстройства микроциркуляции, а также перераспределение экспрессии LIF из поверхностного эпителия в строму, отклонение СПЭИ от нормы, повышение экспрессии PAI-1, VEGF. Установлено, что при сочетании нДСТ + НТ имеются наиболее выраженные нарушения рецептивности эндометрия. Полученные данные могут быть использованы для диагностики, прогнозирования и разработки таргетной терапии бесплодия у женщин с синдромами нДСТ и НТ.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Т.А.Д., Е.А.К., Д.Ю.К.

Сбор и обработка материала: Е.А.К., Д.Ю.К., Н.М.Ф.

Анализ материала: Т.А.Д., Е.А.К.

Статистическая обработка: А.С.З., Т.А.Д.

Написание статьи: Т.А.Д., Е.А.К., А.С.З., Н.М.Ф., Д.Ю.К.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail