Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Секачева М.И.

Отделение хирургии печени, желчных путей и поджелудочной железы Российского научного центра хирургии им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Фёдоров Д.Н.

РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Скипенко О.Г.

Российский научный центр хирургии им. Б.В. Петровского РАМН, Москва

Влияние предоперационной химиотерапии на экспрессию факторов апоптоза в метастазах колоректального рака в печени

Журнал: Архив патологии. 2014;76(4): 18-23

Просмотров : 8

Загрузок :

Как цитировать

Пальцева Е. М., Секачева М. И., Фёдоров Д. Н., Скипенко О. Г. Влияние предоперационной химиотерапии на экспрессию факторов апоптоза в метастазах колоректального рака в печени. Архив патологии. 2014;76(4):18-23.

Авторы:

Пальцева Е.М.

Лаборатория электронной микроскопии и иммуногистохимии Централизованного патологоанатомического отделения ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздравсоцразвития России

Все авторы (4)

Для лечения метастатического колоректального рака (КРР) наряду с хирургическим удалением опухолевых очагов применяется химиотерапия, что позволяет значительно улучшить прогноз данного заболевания. В настоящее время стандартными схемами лечения являются цитотоксические препараты (оксалиплатин или иринотекан) в комбинации с 5-фторурацилом и лейковорином [1]. Препарат 5-фторурацил блокирует образование тимидилатной кислоты и таким образом синтез ДНК, а лейковорин стабилизирует его связывание с тимидилатсинтазой. Оксалиплатин - цитотоксический препарат, являющийся производным платины, взаимодействует с ДНК, образуя внутри- и межспиральные сшивки, что блокирует ее синтез и последующую репликацию [2]. Иринотекан - цитотоксический препарат из группы камптотецинов, механизм действия которого основан на ингибировании топоизомеразы I, ядерного фермента, поддерживающего и модулирующего структуру ДНК [3]. В ответ на повреждения ДНК в опухолевых клетках происходит индукция апоптоза.

Несмотря на то что применение цитотоксических препаратов значительно улучшило безрецидивную выживаемость пациентов с метастатическим КРР, для повышения эффективности терапии в настоящее время применяются таргетные препараты, как правило, в комбинации со стандартной химиотерапией. Их действие направлено на ингибирование клеточного цикла и путей репарации ДНК, индукцию апоптоза опухолевых клеток [4]. Так, в настоящее время для лечения метастатического КРР применяется таргетный анти-VEGF препарат, представляющий собой моноклональное антитело, связывающееся с сосудистым эндотелиальным фактором роста (VEGF) и ингибирующее его активность, подавляющее ангиогенез и таким образом рост и метастатическое прогрессирование опухоли [5]. Кроме того, последние исследования свидетельствуют о его проапоптотической активности, также основанной на блокировании VEGF, который ингибирует внутриклеточные сигнальные пути, запускающие апоптоз [5-7].

Апоптоз, или запрограммированная смерть клеток, наблюдается при различных физиологических и патологических состояниях и играет важную роль в патогенезе опухолей. Апоптоз - это механизм, с помощью которого многие химиотерапевтические средства оказывают цитотоксическое действие на опухолевые клетки. Тем не менее злокачественные клетки приобретают устойчивость к этому механизму воздействия благодаря измененной экспрессии или мутации генов, участвующих в процессе апоптоза. Кроме того, чувствительность опухолевых клеток к цитотоксическим препаратам зависит от баланса между про- и антиапоптотическими молекулами [1].

Про- и антиапоптотические белки, члены семейства Bcl-2, играют основную роль в индукции апоптотического каскада. Проапоптотические белки, регулируемые геном-супрессором опухолевого роста p53, включают Bik, Bak, Bax, PUMA. p53 и Bax являются детерминантами ответа опухолевых клеток на воздействие цитотоксическими препаратами [2, 8]. Высокий уровень экспрессии Bax, сопровождающийся усиленной индукцией апоптоза, коррелирует с эффективностью данных препаратов при раке различной локализации [9]. В исследованиях, проведенных на культурах клеток КРР, показано, что воздействие оксалиплатина и иринотекана приводит к усилению апоптоза, увеличению количества экспрессирующих клеток Bax и p53 [4, 8, 10], а также снижению экспрессии ингибирующих апоптоз Bcl-2 и Bcl-xl [11]. К усиленной экспрессии Bax приводит и воздействие таргетного анти-VEGF препарата [6].

Среди ингибиторов апоптоза, к которым относят Bcl-2, Mcl-1, XIAP, FLIP [6], в аденокарциномах желудочно-кишечного тракта отмечается повышенная экспрессия протоонкогена Bcl-2. Существует большое количество исследований на культурах клеток КРР, демонстрирующих, что повышенная экспрессия Bcl-2 вызывает устойчивость к воздействию цитотоксических препаратов [12].

Одним из регуляторов апоптоза является опухолевый супрессор PML, локализующийся в ядре клетки, иногда в виде макромолекул, получивших название PML-ядерных телец [13-15]. PML контролирует индукцию апоптоза, подавление роста и старение клеток в ответ на онкогенные стимулы и повреждение ДНК [13]. PML обнаруживается в нормальных тканях, но его экспрессия снижается или полностью исчезает в опухолях, причем его количество уменьшается с прогрессией заболевания. Так, по данным C. Gurrieri [13], при КРР он отсутствовал в 65% метастатических очагов в печени и в 44% первичных опухолей. Способность PML контролировать апоптоз клеток, подвергшихся повреждению ДНК или воздействию проапоптотических стимулов, объясняет тот факт, что его исчезновение приводит к развитию опухолей.

Хотя апоптоз является одним из основных механизмов противоопухолевого действия цитотоксических и таргетных анти-VEGF препаратов, существующие публикации посвящены изучению апоптоза под действием этих препаратов либо в эксперименте [7], либо при различных локализациях [6, 16], но не при колоректальном раке. Изучение соотношения экспрессии про- и антиапоптотических белков помогло бы объяснить чувствительность опухолевых очагов к данным препаратам. Выявление прогностических маркеров эффективности химиотерапии тем или иным препаратом является очень важным, так как КРР - гетерогенное заболевание с различными биологическими и клиническими проявлениями. Поэтому в данной работе мы исследовали воздействие цитотоксических и таргетных анти-VEGF препаратов на некоторые механизмы апоптоза.

Материал и методы

В исследование включены 84 пациента ФГБУ «РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского» РАМН с метастазами КРР в печени, которым было произведено хирургическое удаление метастатического очага. Из них 35 пациентов (мужчин - 14, женщин - 21; возраст от 27 до 72 лет, медиана возраста - 57 лет) получали предоперационную терапию цитотоксическими препаратами в качестве первой линии.

14 больным (мужчин - 7, женщин - 7; возраст от 46 до 75 лет, медиана возраста - 57 лет) была проведена комбинированная цитотоксическая и таргетная анти-VEGF-терапия также в качестве первой линии. Группу контроля составили 35 пациентов с метастазами в печени (мужчин - 20, женщин - 15; возраст - от 39 лет до 71 года, медиана возраста - 59 лет), у которых химиотерапию не применяли. Было проведено иммуногистохимическое (ИГХ) исследование операционного материала метастазов в печени.

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), после проводки на гистопроцессоре образцы заливали в парафин. Для гистологического и ИГХ-исследования изготавливали срезы толщиной 3-4 мкм. Для исследования срезы монтировали на высокоадгезивные предметные стекла (Polysine Slides, «Gerhard Menzel GmbH»). Депарафинирование и ИГХ-исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max, Leica. Использовали первичные антитела к Bax («Santa Cruz Biotechnology», клон B-9; разведение 1:150), PML («Santa Cruz Biotechnology», клон PG-M3; разведение 1:100) и Bcl-2 («Dako», клон 124; разведение 1:200).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Интенсивность окрашивания при иммунопероксидазной реакции оценивали полуколичественным методом. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру (Leica).

Полученные данные проанализированы с помощью программы Statistica 8.0. Сравнительный анализ выполнен с использованием χ2-критерия Пирсона, точным методом Фишера. Статистическую значимость принимали при p<0,05. Анализ выживаемости проводили методом Каплана-Мейера и Log-rank-тестом.

Результаты и обсуждение

В нашей работе проведено исследование изменения экспрессии индукторов (Bax, PML) и ингибиторов (Bcl-2) апоптоза под действием различных химиотерапевтических препаратов и в контрольной группе. В метастатических очагах КРР в печени выявлялась цитоплазматическая экспрессия Bax. Тип экспрессии Вcl-2 в позитивных клетках был преимущественно цитоплазматический, в отдельных опухолевых железистых эпителиальных клетках выявлялась более интенсивная реакция в участках цитоплазмы вокруг ядер и окраска ядерных мембран. Для анализа данных типы экспрессии Bax и Bcl-2 были объединены в 2 группы: со сниженной и повышенной экспрессией. Экспрессия PML оценивалась как положительная при выявлении окрашивания 10-50% ядер, а также более 50% ядер, отрицательная - при отсутствии окрашивания ядер опухолевых железистых эпителиальных клеток.

При ИГХ-исследовании экспрессии проапоптотического белка Bax в метастатических очагах в печени пациентов, получавших предоперационную цитотоксическую терапию, а также комбинированную терапию с таргетным анти-VEGF препаратом, выявлено, что в обеих группах не отмечалось случаев отсутствия данного маркера в отличие от группы нелеченых пациентов, в которой у 9% больных экспрессии не обнаружено. Сниженная экспрессия выявлена у 40% (14 случаев) пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами, у 71% (10 случаев) - комбинированную терапию цитотоксическими и анти-VEGF препаратами, и у 69% (24 случая) пациентов из группы контроля (см. рисунок, а).

Рисунок 1. Экспрессия Bax, Bcl-2 и PML в метастазах колоректального рака в печени. а - сниженная экспрессия Bax у пациента контрольной группы. ×200; б - повышенная экспрессия Bax при терапии цитотоксическими препаратами. ×200; в - сниженная экспрессия Bcl-2 при сочетанной терапии цитотоксическими и анти-VEGF препаратами. ×200; г - повышенная экспрессия Bcl-2 у пациента контрольной группы. ×200; д - окрашивание >50% ядер опухолевых железистых эпителиальных клеток при терапии цитотоксическими препаратами. ×200; е - окрашивание 10-50% ядер опухолевых клеток при сочетанной терапии цитотоксическими и анти-VEGF препаратами. ×200; а-е - иммуногистохимическая окраска.
Повышенная экспрессия проапоптотического белка Bax отмечалась соответственно у большинства больных, подвергшихся лечению цитотоксическими препаратами (60%, 21 пациент), а также у 29% (4 человека) пациентов, получавших сочетанную терапию, и 31% (11 человек) из контрольной группы (см. таблицу, рисунок, б).

Сравнение экспрессии Bax в группе пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами, с группой нелеченых пациентов показало, что повышенная экспрессия данного маркера достоверно чаще встречалась после проведенной химиотерапии (р=0,01). При сопоставлении содержания данного маркера в метастазах КРР в печени после проведения сочетанной терапии цитотоксическими и таргетным анти-VEGF препаратами с контрольной группой достоверных различий не получено (р=0,5). При этом экспрессия Bax была статистически значимо повышена при проведении только цитотоксической химиотерапии (без анти-VEGF) при сравнении данной группы с группой пациентов, получавших сочетанную химиотерапию (р=0,04).

ИГХ-исследование антиапоптотического белка Bcl-2 выявило его сниженную экспрессию у большинства пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение: у 27 (77%) в группе леченных цитотоксическими препаратами и у 11 (79%) человек в группе получавших сочетанную терапию. В то время как в контрольной группе выявлено примерно одинаковое количество пациентов со сниженной и повышенной экспрессией данного маркера (54 и 46% соответственно) (см. таблицу, рисунок, в, г).

Сопоставление экспрессии Bcl-2 в метастазах КРР в печени в группе пациентов, получавших терапию цитотоксическими препаратами, с группой нелеченых пациентов показало, что в первой группе достоверно чаще встречалась его сниженная экспрессия (р=0,04). Сравнительный анализ содержания данного маркера после проведения сочетанной терапии цитотоксическими и таргетным анти-VEGF препаратами с контрольной группой достоверных различий не выявил (р=0,1), так же как и сравнение его экспрессии в двух группах пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение (р=0,6).

Нами было проанализировано соотношение экспрессии маркеров Вах/Всl-2 в метастазах КРР в печени. Больные были разделены на 4 группы на основании иммуногистохимических особенностей реакции с антителами к Вах и Bcl-2: Вах(–)/Bcl-2(–), Вах(–)/Bcl-2(+), Вах(+)/Bcl-2(–), Вах(+)/Bcl-2(+). Сравнение соотношения экспрессии Вах/Всl-2 в группах пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение, и контрольной группе статистически достоверных различий не выявило. Отмечено лишь, что у пациентов, не проходивших химиотерапию, чаще выявлялось подавление этого пути апоптоза как за счет снижения содержания обоих маркеров (37% случаев), так и вследствие повышенной экспрессии Bcl-2 при сниженной - Bax (34% случаев).

Анализ экспрессии PML в метастазах КРР в печени выявил, что у пациентов, получавших терапию только цитотоксическими препаратами и не проходивших химиотерапевтического лечения, данный маркер не определялся в 57% (20 больных) и 69% (24 больных) случаев соответственно. Воздействие таргетной анти-VEGF терапии привело к уменьшению количества таких случаев до 29%. В группе сравнения установлена положительная экспрессия данного маркера у 31% (12 человек) больных, в группе леченных цитотоксическими препаратами - у 43% (15 человек) пациентов. При добавлении к терапии таргетного препарата отмечено увеличение количества таких случаев до 71% (10 пациентов) (см. таблицу, рисунок, г, д).

Сопоставление экспрессии PML в группе пациентов, подвергшихся терапии цитотоксическими препаратами, с группой пациентов, не получавших химиотерапевтического лечения, статистически значимой разницы не выявило (р=0,22), хотя отмечено некоторое увеличение случаев положительной экспрессии. Напротив, при добавлении к терапии анти-VEGF препарата достоверно чаще выявлялась положительная экспрессия PML по сравнению с группой контроля (р=0,01). При этом сравнение двух групп пациентов, получавших химиотерапевтическое лечение, между собой показало более частое выявление данного маркера при применении сочетанной терапии, хотя статистической достоверности не получено (р=0,06).

Таким образом, в нашем исследовании выявлены отсутствие либо ослабление экспрессии проапоптотических белков Bax и PML и повышенная экспрессия антиапоптотического белка Bcl-2 в метастазах КРР в печени у большинства пациентов, не получавших химиотерапевтического лечения, что свидетельствует о подавлении механизмов, запускающих апоптоз опухолевых клеток. Известно, что экспрессия Bax и PML снижается или полностью исчезает в опухолях, причем их количество уменьшается с прогрессией заболевания. Так, по данным F. Pietrantonio [17], Bax не выявлялся в 51% метастазов КРР в печени, а в исследовании C. Gurrieri [13] PML отсутствовал в 65% метастатических очагов в печени и в 44% первичных опухолей. Экспрессия ингибитора апоптоза Bcl-2, напротив, усиливается уже на ранних стадиях развития КРР [12].

Терапия цитотоксическими препаратами привела к статистически значимому увеличению экспрессии активатора апоптоза Bax, снижению содержания ингибитора апоптоза Bcl-2 и небольшому повышению экспрессии PML, контролирующего индукцию апоптоза, т.е. цитотоксические препараты активируют апоптоз опухолевых клеток в метастазах КРР в печени. Исследования, посвященные влиянию изучаемых нами химиотерапевтических препаратов на данные маркеры апоптоза при КРР in vivo, в литературе не представлены. Тем не менее наши данные согласуются с результатами других авторов, полученными на культурах клеток КРР, в которых показано, что воздействие оксалиплатина и иринотекана приводит к увеличению количества экспрессирующих клеток Bax и усилению апоптоза [4, 8, 10], а также снижению экспрессии ингибиторов апоптоза Bcl-2 и Bcl-xl [11].

Исследование активатора апоптоза Bax в метастазах в печени пациентов, получавших сочетанную терапию, продемонстрировало, что его содержание было практически таким же, как и в контрольной группе, т.е. таргетный анти-VEGF препарат не оказывал на него никакого влияния. Анализ экспрессии ингибитора апоптоза Bcl-2 после проведения сочетанной цитотоксической и анти-VEGF-терапии показал снижение его содержания по сравнению с группой контроля, хотя статистически достоверной разницы не получено, возможно, из-за малочисленности группы леченых пациентов. Добавление к цитотоксической терапии анти-VEGF препарата привело к более частой положительной экспрессии PML, участвующего в индукции апоптоза, по сравнению с группой контроля и группой пациентов, получавших только цитотоксическую химиотерапию. В литературе нам не удалось найти данных о влиянии таргетных анти-VEGF препаратов на экспрессию данных участников апоптоза в эпителиальных опухолях. Лишь в исследованиях J. Bogusz (2013), проведенных на культуре клеток неэпителиальной опухоли, получены иные данные, свидетельствующие о том, что воздействие таргетного анти-VEGF препарата приводит к усиленной экспрессии Bax [6].

Заключение

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о подавлении механизмов, запускающих апоптоз опухолевых клеток в метастазах КРР в печени у пациентов, не получавших химиотерапевтического лечения, в результате снижения экспрессии проапоптотических белков Bax и PML и повышения содержания антиапоптотического белка Bcl-2. Цитотоксические препараты активируют апоптоз опухолевых клеток в метастазах КРР в печени, достоверно увеличивая экспрессию активатора апоптоза Bax и снижая содержание ингибитора апоптоза Bcl-2, а также несколько повышая экспрессию PML, контролирующего индукцию апоптоза. Сочетанная терапия цитотоксическими и анти-VEGF препаратами не оказала статистически значимого влияния на Bax и Bcl-2, но также привела к усилению апоптоза опухолевых клеток за счет увеличения экспрессии индуктора апоптоза PML. Понимание механизмов элиминации опухолевых клеток путем апоптоза под действием химиотерапевтических препаратов позволит объяснить степень их эффективности и выявить маркеры для определения чувствительности к тем или иным препаратам.

Работа выполнена в рамках проекта, поддержанного Российским фондом фундаментальных исследований, №14-04-00844.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.М.П., М.И.С.

Сбор и обработка материала: Е.М.П., М.И.С., Д.Н.Ф., О.Г.С.

Статистическая обработка данных: М.И.С.

Написание текста: Е.М.П.

Редактирование: О.Г.С.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail