Серозная карцинома яичника высокой степени злокачественности (CКЯВСЗ) является одним из наиболее смертельно опасных заболеваний в структуре злокачественных новообразований у женщин, составляя около 70% всех карцином яичника [1]. СКЯВСЗ в большинстве случаев диагностируется на поздних стадиях, пациентки имеют плохой прогноз, поэтому в настоящее время раннее выявление данной опухоли является одной из наиболее важных задач как для клинических специалистов (онкологов, гинекологов, функциональных диагностов), так и для патологов и молекулярных биологов [2—4].

В последнее десятилетие накоплено множество доказательств того, что предшественники CКЯВСЗ развиваются в маточной трубе [5—7]. Полученные данные легли в основу изменения теории патогенеза серозных карцином яичника, и в качестве основного источника их развития в настоящее время рассматривает эпителий маточной трубы, а не поверхностный эпителий яичника [8].

В эпителии маточной трубы различают три типа клеток — реснитчатые, секреторные и вставочные клетки, причем последние, как полагают, являются предшественниками секреторных и обладают прогениторными свойствами [9]. Около 20—30% клеток составляют реснитчатые клетки, 55—65% — секреторные (включая вставочные), при этом данные типы клеток не распределены равномерно по маточной трубе — секреторные клетки преобладают в ампулярном и фимбриальном отделах маточной трубы. В результате проведенных экспериментов было сделано предположение, что именно в секреторных клетках происходят изменения, дающие начало развитию СКЯВСЗ. Вначале, как полагают, происходит экспансия секреторных клеток без изменения их фенотипа, но с нарушением репарации ДНК. Потом возникает мутация в гене TP53 с развитием р53-signature, далее происходит накопление мутаций в других генах, изменение фенотипа клеток с развитием серозного трубного интраэпителиального поражения и, наконец, возникновение мутаций BRCA½ с образованием серозной трубной интраэпителиальной карциномы (СТИК) [10]. На основании данной модели патогенеза серозной карциномы тазовой области высокой степени злокачественности проводятся многочисленные исследования самых ранних этапов развития серозной карциномы, которые включают в себя экспансию секреторных клеток. Наиболее ранним секреторным поражением пионеры изучения данной проблемы считают так называемое разрастание секреторных клеток — РСК (англ.: Secretory cells outgrowth — SCO). Данное изменение представляет собой участок эпителия маточной трубы, состоящий из 30 непрерывно расположенных секреторных клеток [11]. РСК, как было показано, утрачивает экспрессию фактора транскрипции PAX2 и имеет выраженную экспрессию Вcl-2, однако может быть диагностировано и без дополнительных методов исследования с использованием только световой микроскопии. Учитывая этот факт, а также то, что показано значительное увеличение выявляемости РСК при серозных карциномах, РСК может служить потенциальным маркером для скрининга серозной карциномы яичника [12].

Однако дискуссионным остается вопрос, действительно ли именно ограничение в 30 клеток необходимо для того, чтобы экспансия секреторных клеток могла рассматриваться в качестве самостоятельного маркера СКЯВСЗ. Ряд авторов полагают, что даже меньшее число подряд расположенных секреторных клеток способно выполнять данную роль и являться самостоятельным поражением. Таким образом, цель нашего исследования — проверить данную гипотезу, а также изучить иммунофенотип секреторных поражений маточной трубы с помощью таких молекул, как PAX2, Вcl-2, β-catenin и ALDH1A1, сравнить их с иммунофенотипом более тяжелых трубных интраэпителиальных поражений и показать их биологическую роль на ранних этапах патогенеза СКЯВСЗ.

Всего обследовано 287 пациенток, прооперированных в центре с 2012 по 2016 г. Выделены 4 группы: 70 пациенток с экстраяичниковой патологией (показаниями к оперативному лечению являлись миома матки, аденомиоз, выпадение матки), 75 с серозными цистаденомами/цистаденофибромами яичника, 73 с серозными пограничными опухолями яичника и 69 с CКЯВСЗ. Для исследования отобрано 287 маточных труб (маточные трубы на стороне опухолей и по одной маточной трубе от пациенток из группы с экстраяичниковой патологией). Исследовано по 5—6 фрагментов маточной трубы с обязательным взятием участков истмического, ампулярного и фимбриального отделов маточной трубы.

В маточной трубе оценены следующие интраэпителиальные изменения: 1) экспансия секреторных клеток, которая разделена на два типа: 1а — пролиферация секреторных клеток — ПСК (англ.: Secretory cells expansion — SCE), более 10 подряд расположенных секреторных клеток и 1б — разрастание секреторных клеток, более 30 подряд расположенных секреторных клеток (PСК, англ.: Secretory cells outgrowth, SCO); 2) р53-signature (РСК, в которых отмечалась высокая экспрессия р53, более чем в 75% клеток); 3) серозное трубное интраэпителиальное поражение — СТИП (промежуточное между р53-signature и СТИК); 4) СТИК.

Иммуногистохимическим (ИГХ) методом оценена экспрессия р53, Ki-67 (только в маточных трубах пациенток с серозными пограничными опухолями и серозными карциномами яичника), PAX2, β-catenin, Вcl-2, ALDH1A1. Использовали следующие антитела для постановки реакций: р53 (клон DO-7, RTU, «Dako»), Ki-67 (клон MIB-1, RTU, «Dako»), Bcl-2 (клон 124, разведение 1:100, «Cell Marque»), ALDH1A1 (клон EP1933Y, 1:200, «GeneTex»), PAX2 (разведение 1:10, «Cell Marque»), β-catenin (клон 14, RTU, «Cell Marque»). Всего проанализировано 50 ИГХ-препаратов для каждого исследуемого маркера. Оценка экспрессии р53, Вcl-2, PAX2 и β-catenin проведена в баллах (0 — отсутствие экспрессии, 1 — слабая экспрессия, 2 — умеренная экспрессия, 3 — сильная экспрессия). Оценку экспрессии Ki-67 проводили в процентах на 3000 клеток.

Материалы исследования подвергали статистической обработке с использованием программы IBM SPSS Statistics 20.

Совокупности количественных показателей, распределение которых отличалось от нормального (проверка на нормальность распределения проводилась с использованием критерия Колмогорова—Смирнова), описывали при помощи значений медианы (Me) и нижнего и верхнего квартилей (Q₁—Q₃). Графически результаты представляли с помощью ящичных диаграмм. Для сравнения показателей использовали критерии Краскела—Уоллиса (при множественных сравнениях) и Манна—Уитни (при парных сравнениях независимых совокупностей), а также критерий Уилкоксона (при парных сравнениях зависимых совокупностей).

Оценку связи между количественными показателями проводили с помощью непараметрического корреляционного анализа с расчетом и интерпретацией коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Сопоставимость показателей экспрессии маркеров при изучении различных участков маточной трубы определяли с помощью коэффициента конкордации Кендалла.

Различия считали существенными при уровне значимости p<0,05.

Для исследования зависимости экспансии секреторных клеток от возраста все пациентки были разделены на следующие группы: 26—35, 36—45, 46—55, 56—65 и 66—75 лет. Оценку ПСК и РСК проводили как с помощью световой микроскопии, так и ИГХ-исследования на Вcl-2 и PAX2. Число участков, состоящих из секреторных клеток, выявленных с помощью указанных методов, в настоящем исследовании было сопоставимо в отличие от нашего предыдущего исследования [13], что, вероятно, связано с более жесткими критериями для верификации ПСК и РСК в настоящей работе.

Результаты сопоставления показателей экспансии секреторных клеток с возрастом пациенток с помощью непараметрического корреляционного анализа по Спирмену представлены в табл. 1.

Согласно полученным данным, между показателем ПСК и возрастом пациенток при всех исследуемых формах патологии установлена прямая статистически значимая связь, теснота которой по шкале Чеддока была от заметной (при серозных аденокарциномах и серозных пограничных опухолях) до высокой (при серозных цистаденомах или цистаденофибромах и экстраяичниковой патологии), уровень значимости соответствовал p<0,001. Показатель РСК также имел прямую статистически значимую корреляционную связь с возрастом во всех случаях, кроме серозных аденокарцином, при которых уровень значимости связи составил p=0,089. Теснота связи РСК и возраста по шкале Чеддока была от слабой при серозных пограничных опухолях до высокой при экстраяичниковой патологии.

Кроме того, проведены подсчет и сравнение с помощью критерия Уилкоксона количества ПСК и РСК в фимбриальном, ампулярном и истмическом отделах маточной трубы при различной патологии (табл. 2).

Различия количества ПСК и РСК при сравнении истмического и ампулярного отделов маточной трубы были в основном несущественны. Количество ПСК несколько выше в ампулярном отделе при серозных цистаденомах или цистаденофибромах, а также при экстраяичниковой патологии (p=0,003 и p=0,002 соответственно). Количество РСК в ампуле маточной трубы по сравнению с истмическим отделом было статистически значимо выше при серозных цистаденомах или цистаденофибромах и серозных аденокарциномах (p=0,027 и p<0,001 соответственно).

При сопоставлении количества ПСК и РСК между фимбриальным и другими отделами маточной трубы выявлены статистически значимые различия во всех случаях (p<0,001). В фимбриальном отделе отмечались существенно более высокие показатели экспансии секреторных клеток, чем в ампулярной или истмической частях.

Также следует отметить отсутствие статистически значимых различий количества ПСК (за исключением ампулярного отдела маточной трубы) и РСК при сопоставлении показателей с помощью критерия Краскела—Уоллиса у пациенток с серозными пограничными опухолями, серозными цистаденомами или цистаденофибромами яичника и экстраяичниковой патологии. При сравнении указанных форм патологии с серозными аденокарциномами яичника установлены статистически значимые различия ПСК и РСК во всех отделах маточной трубы (p<0,001), за исключением количества РСК в истмическом отделе (p=0,286).

Установленная зависимость количества ПСК и РСК от локализации в определенном отделе маточной трубы при различных опухолях яичника и экстраяичниковой патологии графически отражена на рис. 1, 2 соответственно.

Частота возникновения ПСК в фимбриальном отделе маточных труб варьировала от 0 до 57, медиана показателя составляла от 3 (Q₁—Q₃: 2—5) при экстраяичниковой патологии до 16 (Q₁—Q₃: 12—23) при СКЯВСЗ. Такая же тенденция наблюдалась и в отношении частоты выявления РСК, медиана составляла от 1 (Q₁—Q₃: 0,75—2) при экстраяичниковой патологии до 2 (Q₁—Q₃: 2—4) при СКЯВСЗ. Следует отметить, что в фимбриальном отделе продемонстрирована значительно бо́льшая разница в выявляемости ПСК между группами пациенток с экстраяичниковой патологией и серозными карциномами яичника (в 5,3 раза), чем в выявляемости РСК между теми же группами (в 2 раза).

В проведенных в последнее десятилетие исследованиях показано, что секреторные клетки эпителия маточной трубы являются источником развития серозных карцином высокой степени злокачественности в тазовой области. Поэтому большинство авторов в качестве самого раннего события в схеме патогенеза данных опухолей считают РСК (SCO), которое представляет собой 30 и более подряд расположенных секреторных клеток [11, 12]. Однако в норме эпителий маточной трубы состоит из секреторных и реснитчатых клеток, которые организованы таким образом, что подряд располагаются не более 10 клеток одного типа. Именно поэтому в нашей работе была исследована выявляемость ПСК (10 подряд расположенных секреторных клеток). Показано, что распространенность ПСК выше во всех исследуемых группах и любом возрасте. Как ПСК, так и РСК чаще выявлялись при СКЯВСЗ, однако ПСК показала бо́льшую (в 1,7 раза) чувствительность, чем РСК. На основании данных наблюдений предполагаем, что ПСК может стать более точным маркером ранних этапов патогенеза СКЯВСЗ, не требующих дополнительных исследований. Дальнейшее молекулярно-генетическое исследование данных изменений, возможно, позволит разработать алгоритмы ранней профилактики и лечения таких пациенток.

Иммуногистохимическое исследование с использованием маркеров PAX2, Вcl-2, β-catenin, ALDH1A1 проведено в срезах маточных труб, где были выявлены ПСК и РСК, с использованием световой микроскопии. Достоверно значимых различий в количестве РСК и ПСК, выявленных иммуногистохимически (с помощью рекомендуемых зарубежными авторами для выявления экспансии секреторных клеток маркеров PAX2 и Вcl-2 [12, 14]) и с помощью светового микроскопа не выявлено (p>0,05). При этом отсутствие экспрессии PAX2 и выраженная экспрессия Вcl-2 в области ПСК отмечалось более чем в 90% случаев (выявлено 5 PAX2-негативных ПСК со слабой экспрессией Вcl-2 и 8 PAX2-позитивных ПСК, имеющих сильную экспрессию Вcl-2).

В отличие от нормального эпителия маточных труб, для которого характерно отсутствие экспрессии ALDH1A1, или фокальное слабое окрашивание, в области ПСК и РСК отмечалась выраженная ядерная и цитоплазматическая экспрессия ALDH1A1. Для β-catenin в нормальном эпителии характерно мембранное окрашивание (от умеренного до сильного), в то время как в области ПСК и РСК отмечалась выраженная ядерная и цитоплазматическая окраска.

Помимо верификации ПСК и РСК, в настоящем исследовании проводили иммунофенотипический анализ СТИК и ткани опухоли СКЯВСЗ, (диагностика СТИК выполнена в соответствии с алгоритмом R. Vang и соавт. [15]). В области СТИК и СКЯВСЗ отмечалось снижение экспрессии PAX2, Вcl-2, β-catenin и ALDH1A1.

При сопоставлении результатов оценки экспрессии маркеров в зависимости от исследуемых областей с помощью коэффициента конкордации Кендалла установлены статистически значимые различия показателей при анализе нормального эпителия, областей ПСК и РСК (p<0,001). В случае анализа областей СТИК и СКЯВСЗ результаты оценок по данным различных маркеров были сопоставимы (p=0,289 и p=0,621).

Сводные данные об иммуногистохимической характеристике исследуемой патологии представлены в табл. 3 и проиллюстрированы изображениями срезов на рис. 3.

Статистически значимые различия экспрессии исследуемых маркеров в различных областях при сравнении с помощью критерия Краскела—Уоллиса были выявлены в каждом случае. Парные сравнения с помощью критерия Манна—Уитни позволили установить следующие существенные различия:

1) для PAX2 между нормальным эпителием и патологией — поражениями маточной трубы и СКЯВСЗ (p<0,001);

2) для Вcl-2 при сравнении нормального эпителия и СТИК (p=0,008), а также СКЯВСЗ (p=0,002), показателей экспансии секреторных клеток (ПСК и РСК) и СТИК (p=0,01 в обоих случаях), а также СКЯВСЗ (p=0,002 в обоих случаях);

3) для β-catenin: между нормальным эпителием и экспансией секреторных клеток (ПСК и РСК), а также между экспансией секреторных клеток и СТИК, экспансией секреторных клеток и СКЯВСЗ (p<0,001 во всех случаях);

4) для ALDH1A1, так же как и в случае β-catenin, при сравнении нормального эпителия и экспансии секреторных клеток, а также экспансии секреторных клеток и СТИК или СКЯВСЗ (p<0,001 во всех случаях).

В предыдущих исследованиях показано, что поражения, представляющие собой экспансию секреторных клеток (ПСК и РСК), являются изменениями, в которых происходит нарушение репарации ДНК, однако мутаций в гене ТР53, которые характерны для более поздних этапов патогенеза СТИК, не отмечается [11]. В то же время и в настоящем исследовании, и по данным зарубежных авторов показано, что распространенность РСК значительно выше в маточных трубах пациенток при СКЯВСЗ [12, 14]. Именно поэтому мы рассматриваем ПСК и РСК в качестве наиболее ранних изменений эпителия маточной трубы, а изучение их молекулярных особенностей позволит уточнить механизм развития СТИК и СКЯВСЗ. Следует отметить, что была показана связь между PAX2, Вcl-2 и р53 в экспериментальных исследованиях [16]. В таких органах, как щитовидная железа, почки, отмечено, что PAX2 обладает позитивным влиянием на экспрессию Вcl-2, координируя процесс апоптоза [17, 18].

Однако в интраэпителиальных поражениях маточной трубы на ранних этапах данная конкордантность не прослеживается. В нашем исследовании, а также по данным других авторов отмечается утрата экспрессии PAX2 в области РСК и усиленная экспрессия Вcl-2 [11, 19]. Также необычным является и тот факт, что при утрате экспрессии PAX2 в области РСК отмечается экспрессия дикого типа р53, который в других тканях является стимулятором экспрессии PAX2. Некоторые авторы утрату экспрессия PAX2 в области СТИК и СКЯВСЗ связывают именно с отсутствием позитивного влияния дикого р53, который при данных поражениях заменяется мутантным. Возможно, в эпителии маточной трубы р53- и PAX2-сигнальные пути работают независимо друг от друга, однако существует и вероятность того, что функция белка р53 на этапе формирования PAX2-негативных РСК уже нарушена, хотя мутантный белок еще не секретируется.

Особое внимание следует уделить анализу экспрессии ALDH1A1. Данный маркер, как было показано, является одним из маркеров стволовых клеток в эпителии маточной трубы и поверхностном эпителии яичника [20]. Поскольку источником экспансии секреторных клеток скорее всего являются прогениторные клетки, активация ALDH1A1 может играть ключевую роль на начальных этапах патогенеза СТИК/СКЯВСЗ. Действительно, в фенотипически неизмененных клетках эпителия маточной трубы отмечается высокая экспрессия ALDH1A1, однако в СТИК уже отмечается ее снижение, которое продолжается в СКЯВСЗ. В некоторых исследованиях отмечались схожие результаты [21], в других — даже полное исчезновение экспрессии ALDH1A1 на этапе возникновения р53-signature [22].

Полученные результаты тем не менее свидетельствуют о том, что ALDH1A1 нельзя рассматривать в качестве облигатного маркера стволовых клеток эпителия маточной трубы, однако снижение его экспрессии сопряжено с изменением фенотипа эпителиальных клеток и происходит примерно на тех же этапах карциногенеза, что и мутация в гене ТР53. Возможно, в дальнейшем будет продемонстрирована связь между этими двумя событиями.

Было показано, что пролиферация секреторных клеток является самостоятельным интраэпителиальным поражением. Выявляемость данного поражения увеличивалась с возрастом, а также достоверно различалась у пациенток с поражением маточных труб при экстраяичниковой патологии от таковой у больных со злокачественными серозными опухолями яичника (в 5,3 раза), при этом уровень разрастания секреторных клеток в данных группах больных различался всего в 2 раза. Таким образом, пролиферация секреторных клеток может служить более чувствительным маркером ранних этапов патогенеза серозной карциномы яичника высокой степени злокачественности. Также следует отметить, что для изученных типов экспансии секреторных клеток продемонстрированы множественные молекулярные события (утрата экспрессии PAX2, усиление экспрессии Вcl-2, β-catenin и ALDH1A1), некоторые из которых претерпевали значительные изменения с усилением тяжести патологического процесса (утрата экспрессии ALDH1A1, β-catenin, Вcl-2). Кроме того, отмечена значительная разнонаправленность и дискордантность экспрессии компонентов сигнальных путей, принимающих участие в развитии серозной карциномы яичника высокой степени злокачественности. Таким образом, терапевтическое воздействие на ранних этапах патогенеза может иметь несколько точек приложения, и сразу несколько молекул могут служить независимыми маркерами ранних патологических изменений эпителия маточной трубы.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.В.А.

Сбор и обработка материала: А.В.А., Н.М.Ф., Л.В.А.

Статистическая обработка данных: А.В.А., М.В.С.

Написание текста: А.В.А., Н.М.Ф.

Редактирование: Л.С.Е., Г. Н.Х.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.