Голицына Е.П.

НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека

Варшавский В.А.

Кафедра патологической анатомии им. А.И. Струкова ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздрава России

Бочарникова А.В.

Кафедра патологической анатомии им. А.И. Струкова ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздрава России

Роль тубулина в патогенезе фибриллярного гломерулонефрита

Журнал: Архив патологии. 2013;75(3): 3-7

Просмотров : 13

Загрузок :

Как цитировать

Голицына Е. П., Варшавский В. А., Бочарникова А. В. Роль тубулина в патогенезе фибриллярного гломерулонефрита. Архив патологии. 2013;75(3):3-7.

Авторы:

Голицына Е.П.

НИИ уронефрологии и репродуктивного здоровья человека

Все авторы (3)

Фибриллярный гломерулонефрит (ФГН) — заболевание из группы гломерулярных болезней с отложением организованных депозитов [1]. Впервые в 1977 г. его описали E. Rosenmann и M. Eliakim [2]. В литературе имеется достаточно публикаций (описаний отдельных случаев [3—11] и серийных исследований [12—16]), что свидетельствует об актуальности данной проблемы. Многие авторы отмечают крайне неблагоприятный прогноз заболевания: развитие терминальной стадии почечной недостаточности в течение нескольких лет после постановки диагноза практически у половины пациентов с ФГН [8, 13, 17]. Известно, что ФГН встречается как у взрослых, так и у детей [3—7]. Этиология заболевания неизвестна, а патогенез не изучен.

В России работы по изучению ФГН практически не встречаются. По данным зарубежных авторов, ФГН диагностируется у взрослых пациентов приблизительно в 10% биопсий почек, поступивших на электронно-микроскопическое исследование, клинически проявляется почечной недостаточностью, протеинурией в рамках нефротического синдрома, микрогематурией [12, 13, 18]. Светооптически ФГН может проявляться различными формами гломерулонефрита (мезангиопролиферативного, мезангиокапиллярного, фибропластического) и некоторых гломерулопатий (мембранозной нефропатии, фокального сегментарного гломерулярного склероза/гиалиноза). Окраска конго красным всегда отрицательная, что привело к образованию термина «неамилоидная фибриллярная гломерулопатия» [19, 20]. Диагностических критериев ФГН на светооптическом уровне не существует. Диагноз ставится исключительно с помощью электронной микроскопии при обнаружении депозитов, состоящих из хаотично расположенных «фибрилл», имеющих просвет, который определяется при увеличении от 30 000, т.е. тубулярных структур (микротубул) [1]. Депозиты при ФГН могут быть чисто тубулярными или смешанными с веществом иммунных комплексов [21].

В настоящее время известно несколько заболеваний почек, характеризующихся наличием депозитов из тубулярных структур с разными морфологическими характеристиками: иммунотактоидная нефропатия, поражение почек при криоглобулинемии, ФГН. В 1992 г. G. Yang и соавт. [14] иммуноэлектронно-микроскопическим методом исследовали нефробиоптаты 7 пациентов с конго-негативной амилоидоподобной фибриллярной гломерулопатией. Во всех случаях в «фибриллах» обнаружены IgG, C3-компонент комплемента и Р-компонент амилоида. Матричные и микрофибриллярные белки, включая коллаген IV типа, гепаринсульфат протеогликан, фибронектин и фибриллин не обнаружены [14]. Наличие Р-компонента амилоида в микротубулах при ФГН и полого центра в фибриллах амилоида при амилоидозе [1] наводит на мысль о сходном процессе «фибриллообразования» при этих заболеваниях. Нельзя исключить, что ФГН, как и амилоидоз, может быть отнесен к протеинопатиям.

Из цитологии известно, что микротрубочки являются обычным компонентом клеток эукариотов. Стенка микротрубочек состоит из полимеризованных молекул белка тубулина и ассоциированных белков, наружный диаметр микротрубочки составляет около 24—25 нм, внутренний — 15 нм. В живой нормальной клетке микротрубочки растут, укорачиваются, исчезают, т.е. находятся в динамической нестабильности. Существует ряд веществ, которые влияют на полимеризацию тубулина. Стабилизирующее влияние на микротрубочки оказывает таксол, который способствует полимеризации тубулина. Это приводит к образованию аномальных трубочек (диаметром до 20 нм), не способных к разборке. В клетке их накапливается огромное количество, полностью нарушаются процесс деления и многие другие функции, и клетка гибнет. Эти свойства таксола используются в онкологической практике [22].

При электронно-микроскопическом изучении клубочков почек с тубулярными депозитами при ФГН у нас иногда создавалось впечатление, что из клеток, чаще всего мезангиоцитов, в мезангиальное пространство через плазмалемму выходят если не готовые тубулярные структуры, то нитевидные белковые молекулы, имеющие топографическую связь с тубулярными депозитами, которые предположительно могут быть материалом для образования микротубул. В связи с этим мы решили проверить возможность участия белка тубулина в образовании микротубул при ФГН.

Материал и методы

Материалом для исследования служили биоптаты почек, поступившие в лабораторию электронной микроскопии и иммуногистохимии централизованного патологоанатомического отделения Первого МГМУ им. И.М. Сеченова с 2008 по 2011 г. Пациентам проводилось светооптическое, иммунофлюоресцентное и электронно-микроскопическое исследование. С 2008 по 2011 г. для электронно-микроскопического исследования почек поступил материал от 536 пациентов, в 91 случае был диагностирован ФГН. Среди всех пациентов с ФГН были отобраны 45 случаев удовлетворяющих условию достаточного количества материала в парафиновых блоках для дополнительного исследования. Контролем служили 10 пациентов без клинических признаков гломерулонефрита с морфологическим диагнозом «минимальные изменения». Мы разделили пациентов на две группы: 1-ю группу составили дети и подростки (до 16 лет), 2-ю группу — лица старше 16 лет. Были рассчитаны средние значения возраста, суточной протеинурии, проанализированы длительность заболевания до взятия биопсии, креатинин крови и морфологическая картина внутри групп. Для светооптического исследования использовали окраски гематоксилином и эозином, реактивом Шиффа, пикрофуксином по ван Гизону и конго красным. Иммуногистохимический анализ проводили с антителами к IgA, IgM, IgG и C3-компоненту комплемента. Электронно-микроскопическое исследование проведено с помощью электронного микроскопа TECNAI 12 («Philips»). Для проверки гипотезы о возможной роли тубулина в патогенезе ФГН проведено иммуногистохимическое исследование с мышиными моноклональными антителами к тубулину («ABCAM»). Для оценки результатов иммуногистохимического исследования применен полуколичественный метод. Полуколичественный анализ проводили на основании интенсивности окрашивания и распространенности признака в препарате (критерии оценки: «–» — отсутствует, «+» — слабое, «++» — умеренное, «+++» — выраженное). Экспрессию тубулина оценивали в клубочках, извитых канальцах, тонком отделе нефрона, сосудах, строме. Полученные данные обработаны с помощью программы SPSS 11.5.

Результаты

Распространенность ФГН с 2008 по 2011 г. составила 16,97% среди нефробиопсий, поступивших в наше учреждение на электронно-микроскопическое исследование. Такой высокий уровень диагностики ФГН можно объяснить тем, что обычно электронно-микроскопическое исследование почек не является обязательным, а проводится пациентам с тяжелыми проявлениями или неясным диагнозом. ФГН чаще страдают мужчины (63 мужчины, 28 женщин), т.е. отношение составило 2:1.

Средний возраст в 1-й группе (26 человек) составил 9,48±0,902 года, суточная протеинурия — 9,348±8,9724 г/л, длительность заболевания до взятия биопсии — в среднем 3,952± 0,79923 года (минимальное значение — 3 мес, максимальное — 15 лет 3 мес). Креатинин крови был повышен только в одном случае (142 ммоль/л). У 11 пациентов имела место гематурия. На момент взятия биопсии 14 пациентов получали терапию глюкокортикостероидами.

При светооптическом исследовании наиболее часто у пациентов 1-й группы обнаруживался мезангиопролиферативный гломерулонефрит (в 46,2% случаев; см. рисунок, а).

Рисунок 1. Фибриллярный гломерулонефрит. а — мезангиопролиферативный гломерулонефрит, окраска гематоксилином и эозином. ×400; б — очагово-гранулярное свечение IgM в базальной мембране клубочка и мезангиуме, иммунофлюоресцентный метод. ×200; в — отрицательная экспрессия белка тубулина в ткани почки, иммунопероксидазный метод. ×400; г — выраженная мембранно-цитоплазматическая и внеклеточная экспрессия белка тубулина в ткани почки, иммунопероксидазный метод. ×400; д — интрамембранозное отложение микротубулярных депозитов. ×26 500, ЭМ; е — «фибриллярные» отложения, имеют микротубулярное строение (↓). ×87 000, ЭМ; ж — микротубулярные отложения (↓) и депозиты иммунных комплексов обычного строения (↓↓). ×60 000, ЭМ; з — тубулярные депозиты контактирующие с мезангиоцитами (↓). ×87 000, ЭМ.
Вторым по частоте встречаемости стал диагноз «минимальные изменения» (42,3%). Фокально-сегментарный гломерулярный склероз/гиалиноз обнаружен в 11,5% случаев. Мезангиокапиллярный гломерулонефрит не встретился ни у одного пациента.

Данные иммунофлюоресцентного исследования с антителами к IgA, IgM, IgG и C3-компоненту комплемента представлены в табл. 1.

У подавляющего большинства пациентов 1-й группы отмечалось свечение IgМ (84,6%; см. рисунок, б) очагово-гранулярного характера в базальной мембране клубочков и/или мезангиуме. IgG обнаружился у 69,2% пациентов этой группы, IgA — у 57,7%, С3-компонент — у 34,6%.

При электронной микроскопии выявлено, что диаметр тубулярных структур у больных 1-й группы варьировал от 9,0 до 16,8 нм, но в большинстве случаев составлял 12,7 нм. При больших увеличениях электронного микроскопа «фибриллы» по своей сути являлись микротубулами с электронно-полым центром (см. рисунок, е). Микротубулы откладывались преимущественно субэндотелиально (84,0%) и в мезангиуме (76,9%). У 15 пациентов (57,6%) имели место обе перечисленные локализации. У 4 пациентов (15,3%) микротубулярные депозиты располагались субэндотелиально, интрамембранозно (см. рисунок, д) и в мезангиуме. Субэпителиального отложения микротубул у пациентов этой группы не выявлено.

Во 2-й группе (19 человек) средний возраст пациентов составил 35,37±2,562 года (минимальное значение — 18 лет, максимальное — 55 лет). Анализ клинических данных показал, что суточная протеинурия в среднем составила 1,808±0,50525 г/л, длительность заболевания до биопсии — 3,385±1,14180 года (минимальное значение — 5 мес, максимальное — 15 лет). Креатинин был повышен у 7 (36,8%) пациентов. Гематурия выявлена у 13 (68,4%) пациентов. Терапию глюкокортикостероидами на момент взятия биопсии получали 5 (26,3%) пациентов.

При светооптическом исследовании, как и в 1-й группе, у пациентов 2-й группы наиболее часто обнаруживали мезангиопролиферативный гломерулонефрит (47,4% случаев). Вторым по частоте встречаемости стал диагноз мезангиокапиллярный гломерулонефрит (26,3%). Фокально-сегментарный гломерулярный склероз/гиалиноз выявлен в 10,5% случаев. Минимальные изменения отмечены у одного (5,3%) пациента.

По данным иммунофлюоресцентного исследования (см. табл. 1), у пациентов 2-й группы, как и в 1-й, доля больных, имевших отложения IgМ очагово-гранулярного характера в базальной мембране клубочков (БМК) и/или мезангиуме, была высокой (89,5%). Реже во 2-й группе обнаруживались IgG (84,2% случаев), IgA (68,4%) и С3-компонент встретились у 52,6%.

При электронной микроскопии диаметр тубулярных структур у пациентов 2-й группы варьировал от 9,0 до 15,7 нм, но в большинстве случаев составлял 12,5 нм. Микротубулы также в основном откладывались субэндотелиально (78,9% случаев) и в мезангиуме (68,4%), в ряде случаев тубулярные депозиты тесно контактировали с мезангиоцитами (см. рисунок, з). При этом у 11 (57,8%) пациентов микротубулы обнаруживались как субэндотелиально, так и в мезангиуме. У 3 (15,8%) пациентов микротубулярные депозиты располагались субэндотелиально, интрамембранозно и в мезангиуме. Только в этой группе у 3 (15,8%) пациентов выявлено субэпителиальное отложение микротубул, причем у 2 из них отмечались четыре локализации (субэндотелиально, в мезангиуме, интрамембранозно, субэпителиально), а у одного — три (субэндотелиально, в мезангиуме и субэпителиально).

При интерпретации результатов иммуногистохимического исследования с антителами к тубулину учитывали локализацию иммунореактантов (БМК и мезангий клубочка; извитые канальцы, тонкий сегмент нефрона, сосуды, строма) и интенсивность их окрашивания, которую оценивали полуколичественным методом (см. рисунок, в, г).

Результаты полуколичественного анализа экспрессии тубулина в биоптатах пациентов с ФГН приведены в табл. 2.

Данные 10 пациентов из группы контроля представлены в табл. 3.

При анализе различий у пациентов с ФГН и в группе контроля с помощью параметра χ2 выявлено, что различия не были достоверными (р>0,05).

Обсуждение

На основании полученных нами данных об отсутствии достоверных различий экспрессии белка тубулина у пациентов с ФГН и группы контроля нельзя полностью исключить участие неизмененного тубулина в образовании микротубул, но его роль, по-видимому, не является определяющей. Скорее всего, формирование тубулярных структур происходит внеклеточно из различных белков, одни из которых обладают измененными антигенными свойствами, а другие — нет (IgG, C3). Возможно, среди этих белков имеется и тубулин, образующийся при распаде клеток. Окончательное решение этого вопроса, так же как и вопроса о присутствии в микротубулах IgA и IgM, возможно только с помощью иммуноэлектронно-микроскопического метода.

Топография расположения тубулярных депозитов, сходная с расположением иммунных комплексов при известных формах гломерулопатий, позволяет предположить, что входящие в состав микротубул белки, с одной стороны, образуются местно и представлены белками, входящими в состав мембраны капилляров и неклеточного вещества мезангия, а с другой — поступают с кровью. Различия в диаметре микротубул, составляющих депозиты при ФГН, могут быть связаны с разнообразием белков-предшественников.

Особенностью нашего исследования является преобладание отложения в депозитах IgM. По данным литературы, наиболее часто обнаруживаются отложения IgG, но не в 100% случаев [12, 13]. Нам известна единственная публикация, в которой приводятся результаты ультраструктурного иммуногистохимического исследования «фибрилл» при ФГН у 7 пациентов. Во всех 7 наблюдениях были обнаружены положительные метки к IgG [14]. Однако в этой работе не проводилось исследования с метками к IgM и IgA. Этот раздел требует дальнейшего изучения.

Следует обратить внимание на распространенность ФГН среди детей. В литературе имеется достаточно описаний ФГН у пациентов детского возраста [3—7]. В нашем исследовании 26 пациентов из 45 (57,7%) были не старше 16 лет. Учитывая эти данные, общепринятое мнение о том, что ФГН преимущественно поражает пациентов 50—60 лет, нельзя считать объективным [8, 15].

К сожалению, патогенез заболевания остается неясным. Можно предположить, что ФГН является процессом, родственным амилоидозу. К тому же иммуноэлектронно-микроскопически в составе «фибрилл» при ФГН был обнаружен Р-компонент амилоида [14]. При увеличении электронного микроскопа более 100 000 установлено, что фибриллы амилоида также могут представлять собой очень тонкие тубулярные структуры [1]. В настоящее время известно более 30 белков-предшественников амилоида [23]. В то же время пока нельзя утверждать, что все известные белки-предшественники обладают одинаковой способностью к образованию тубулярных структур. Можно предположить, что в патогенезе ФГН участвуют белки-предшественники, которые способны связываться с Р-компонентом амилоида, но при этом не образуют складчатую структуру, присущую фибриллам амилоида и определяющую его тинкториальные свойства.

На основании проведенных нами биопсийных исследований можно с большой вероятностью предположить, что ФГН бывает первичным и приобретенным (вторичным).

При первичном ФГН в крови, вероятно, появляется большое количество аномальных белков с измененными и неизмененными антигенными свойствами. Измененные белки образуют тубулярные депозиты, а неизмененные — иммунные комплексы обычной структуры, что может приводить к одновременному отложению обычных иммунных комплексов, тубулярных депозитов и образованию смешанных депозитов. Чаще всего такие депозиты выявляются субэндотелиально.

При приобретенном ФГН при разрушении массивных отложений иммунных комплексов, образовавшихся в результате первичного заболевания, с последующим образованием множественных повреждений БМК и мезангия, тубулярные отложения заполняют образовавшиеся пустоты и могут расцениваться как своеобразная регенерация. Такие депозиты выявляются интрамембранозно и в мезангии. Выраженность и характер отложений зависят от первичного заболевания.

Для дальнейшего изучения ФГН следует объединить усилия морфологов и клиницистов. Вероятно, большое значение имело бы максимально полное изучение белкового состава крови и мочи у больных с субэндотелиальными тубулярными депозитами, по результатам которого можно было бы осуществить более направленное иммуногистохимическое исследование.

Заключение

Таким образом, наше исследование показало, что неизмененный тубулин не является основным и единственным субстратом образования микротубул при ФГН. Однако полностью отрицать его участие в этом процессе нельзя. Вероятное изменение антигенных свойств, входящих в микротубулы белков, затрудняет дальнейшее исследование. В продвижении этих исследований, по-видимому, может помочь подробное изучение белкового состава крови и мочи у больных с субэндотелиальными тубулярными депозитами. Иммуноэлектронно-микроскопический анализ биопсийного материала больных с ФГН с антителами к IgA и IgM также представляет большой интерес.

Данная работа является фрагментом исследования, направленного на изучение феномена ФГН.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail