Саакян С.В.

ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва

Амирян А.Г.

ФГБУ "Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Цыганков А.Ю.

ФГБУ "Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца" Минздрава России

Логинов В.И.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», ул. Балтийская, 8, Москва, 125315, Российская Федерация

Бурденный А.М.

ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии», ул. Балтийская, 8, Москва, 125315, Российская Федерация

Ассоциация гена АВСВ1 с риском развития увеальной меланомы

Журнал: Архив патологии. 2014;76(2): 3-7

Просмотров : 14

Загрузок :

Как цитировать

Саакян С. В., Амирян А. Г., Цыганков А. Ю., Логинов В. И., Бурденный А. М. Ассоциация гена АВСВ1 с риском развития увеальной меланомы. Архив патологии. 2014;76(2):3-7.

Авторы:

Саакян С.В.

ФГБУ «Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца» Минздрава России, Москва

Все авторы (5)

Злокачественные внутриглазные опухоли меланоцитарного генеза представляют угрозу не только для зрения, но и для жизни пациента. Их частота достигает 15% от общего числа меланом других локализаций, при этом частота увеальной меланомы (УМ) составляет 85-88% всех первичных внутриглазных злокачественных новообразований [3]. В России заболеваемость УМ колеблется от 6,23 до 8 человек на 1 млн взрослого населения в год [1, 3]. УМ характеризуется агрессивным прогрессирующим течением, высокой вероятностью метастазирования и летального исхода. Установлено, что через 5 лет у 50% пациентов с УМ после проведенного лечения диагностированы метастазы в печени [12, 14].

В последние годы уделяется особое внимание поиску факторов прогноза течения опухолевого процесса при УМ. Исторически первыми были изучены клинические факторы. К ним относятся пол, возраст, расовая принадлежность, иммунологический статус, общий статус больного, сопутствующие заболевания, локализация и размер опухоли [5]. К сожалению, в настоящее время взаимосвязь многих из вышеперечисленных факторов с УМ изучена недостаточно. Более чувствительными являются патоморфологические факторы. К ним можно отнести тип гистологического строения опухоли, степень инвазии склеры, прорастание за пределы фиброзной капсулы, характер и тип ангиогенеза, степень лимфоидной инфильтрации в строме опухоли, уровень пролиферативной активности клеток новообразования, размеры ядра и ядрышкового анализатора и др. [9]. Выявление молекулярно-генетических изменений при УМ представляется наиболее перспективным способом прогнозирования течения заболевания. В настоящее время накоплен большой опыт исследований цитогенетических изменений при УМ [2]. К наиболее характерным хромосомным перестройкам и нарушениям численности отдельных хромосом можно отнести потерю одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), что коррелирует с увеличением размера опухоли, вовлеченностью цилиарного тела, наличием в опухоли эпителиоидных клеток, полей оранжевого пигмента на поверхности опухоли, а также наличием замкнутых сосудистых петель [13].

При анализе клинических образцов, полученных от пациентов с УМ, были выявлены субпопуляции клеток, экспрессирующих маркер множественной лекарственной устойчивости (MDR), известный также как ABCB1 [8]. Ген MDR1/ABCB1 кодирует транспортный белок, гликопротеин Р, играющий ключевую роль в выведении целого ряда лекарственных веществ, включая препараты, применяемые при лечении УМ. На сегодняшний день у человека известно около 40 полиморфных маркеров гена MDR1. Как показали исследования, наибольшее клиническое значение имеет полиморфный маркер С3435Т, представляющий собой замену в нуклеотидной последовательности в положении 3435 цитозинового нуклеотида на тимидиновый [7]. Полиморфный маркер С3435Т гена MDR1, локализованный в экзоне 26, обусловливает изменение его экспрессии [10], что может приводить к замедленному выведению лекарственных препаратов. В работе

S. Landreville и соавт. [8] было показано, что субпопуляция клеток, содержащая АВСВ1-ген (ABCB1+), обладала как высокой метастатической, так и митохондриальной активностью в отличие от клеток, не содержащих данный ген (ABCB1–). При этом опухоли ABCB1+ соответствуют по своим свойствам опухолям, относящимся к классу 2 (по классификации AJCC TNM, учитывающей в том числе профиль экспрессии генов - GEP) [6], т.е. часто метастазируют и состоят из клеток различной степени дифференцировки, начиная от высокодифференцированных веретеновидных клеток и заканчивая низкодифференцированными эпителиоидными клетками. Опухоли ABCB1–, напротив, соответствуют опухолям класса 1 по той же классификации и обладают низкой метастатической активностью в сочетании с преобладанием дифференцированных веретеновидных клеток [11]. К недостаткам проведенных исследований относится невозможность проведения исследований in vivo с использованием первичных некультурированных клеток УМ. Такие факторы, как относительная редкость УМ и малое количество опухолевых клеток, полученных из относительно небольших новообразований, также препятствуют полноценным исследованиям в этой области [8]. Таким образом, исследование экспрессии гена ABCB1/MDR1 представляет интерес для практической офтальмоонкологии в связи с его потенциальной прогностической значимостью.

В связи с этим целью настоящей работы было изучение частоты распределения генотипов полиморфного маркера С3435Т гена MDR1/ABCB1 у больных с УМ in vivo и их взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли.

Материал и методы

Всего обследовано 30 ранее не леченных пациентов с УМ (12 мужчин и 18 женщин; 1:1,5) в возрасте от 23 до 72 лет (средний возраст 52,5±9,1 года). Во всех случаях глаза были энуклеированы. Гистологическая верификация опухоли проведена в отделе патологической анатомии и гистологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца.

Высота опухоли составила от 2,6 до 13,8 мм (9,05±3,8 мм), диаметр основания - от 8,2 до 21,9 мм (15,4±5,6 мм). По локализации в исследование вошли опухоли цилихориоидальной области (n=5, 16,7%), хориоидеи (n=22, 73,3%) и иридоцилиохориоидальной области (n=3, 10%). По пигментации выделяли слабо- (n=17, 56,7%) и сильнопигментированные опухоли (n=13, 43,3%). Также опухоли разделяли по следующим клиническим параметрам: наличие (n=4, 13,3%) и отсутствие (n=26, 86,7%) гемофтальма; наличие невысокой (n=12, 40%), высокой (n=11, 36,7%) отслойки сетчатки и ее отсутствие (n=7, 23,3%); наличие (n=14, 46,7%) и отсутствие (n=16, 53,3%) субретинального экссудата, наличие (n=5, 16,7%) и отсутствие (n=25, 83,3%) эпибульбарного роста опухоли, наличие (n=11, 36,7%) и отсутствие (n=19, 63,3%) онкологических заболеваний в семейном анамнезе пациента. По гистологическому строению выделяли веретеноклеточные (n=16, 53,3%) (рис. 1)

Рисунок 1. Веретеноклеточная УМ. Окраска гематоксилином и эозином. ×40.
, смешанно-клеточные (n=9, 30%) и эпителиоидно-клеточные (n=5, 16,7%) опухоли (рис. 2)
Рисунок 2. Эпителиоидно-клеточная УМ. Клеточный полиморфизм. Окраска гематоксилином и эозином. ×40.
.

Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями. В качестве популяционного контроля использовали сопоставимую по возрасту и полу выборку лиц без онкологических заболеваний (n=60).

Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с помощью протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре –20 °С. Идентификацию аллелей полиморфного маркера C3435T (rs1045642) гена АBСB1 проводили с помощью ПЦР-ПДРФ. Для ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды: ABCB-3435-F 5’-aggtttcacatcaccaagattcc-3’ и ABCB-343а5-R 5’-TTCTCAGAAAGGAGTATGCCTTA-3’. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мМ трис-HCl; рН 8,9, 10 мМ 2-меркаптоэтанол,

25 мМ КС1, 0,1% тритон Х-100; 0,25 мМ каждого dNTP; 1-10 нг ДНК; 25 пмоль каждого праймера; 0,5 ед. Taq-полимеразы («СибЭнзим»); MgCl2 в концентрации 2 мM. Амплификацию проводили по следующей программе: 94 °С 1 мин 30 с; 35 циклов 92 °С 15 c; 60 °С 20 с; 72 °С 15 с; 72 °С 1 мин 30 с на амплификаторe Терцик (Россия).

Далее амплифицированный фрагмент ДНК гена АBСB1 подвергали обработке с использованием рестриктазы PctI («СибЭнзим») в термостате при 50 °С в течение 16 ч. При наличии мутантного ТТ-генотипа амплифицируемый в ходе ПЦР фрагмент гена АBСB1 размером 206 п.н. гидролизуется рестриктазой PctI на два фрагмента - 143 и 63 п.н. В гетерозиготном генотипе гена АBСB1 СТ присутствуют все 3 фрагмента.

Результаты ПДРФ анализировали электрофоретически в 10% полиакриламидном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете (рис. 3)

Рисунок 3. Примеры анализа полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в 10% полиакриламидном геле. Н2О — отрицательный контроль (dd вода), К+ — образец до обработки рестриктазой, M — Lad 50 — маркер с шагом полос в 50 п.н.
.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием закона генетического равновесия Харди-Вайнберга для аутосомных признаков. При сравнении частот встречаемости генотипов применяли критерий Пирсона, а для малых выборок - точный критерий Фишера. Комплексную оценку связей между исследуемыми группами проводили с использованием логистической регрессии, определяя отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI) с уровнем значимости, равным 0,05. Рассматривали также результаты статистически маргинально значимые (0,05<р≤0,1), что соответствует доверительному интервалу 94% (в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р=0,05). При сопоставлении генотипов и клинико-морфологических параметров опухоли учитывали такие факторы, как возраст пациента, высота и диаметр основания опухоли, локализация, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, отягощенного семейного онкологического анамнеза, а также гистологический тип опухоли. Расчеты проводили в системе для статистического анализа данных Statistica 6.1 RUS.

Результаты и обсуждение

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в контрольной группе и группе больных с УМ представлено в табл. 1

.

В 80% случаев был выявлен аллель С, что свидетельствует о высокой специфичности данного аллеля для УМ. При этом в опытной группе аллель С встречался почти в 2 раза чаще, чем в контрольной (80% против 41,7%).

Показана достоверная ассоциация предрасполагающего генотипа СС гена АBСB1 с риском развития УМ. Так, частота данного генотипа в группе больных оказалась в 4 раза выше по сравнению с группой контроля, в то же время генотип ТТ у больных обнаружен не был. Ассоциация генотипа CТ с риском развития УМ отмечалась в 40% случаев от общего количества аллелей С, тем не менее данная ассоциация не была значимой (p>0,05). Таким образом, можно предположить, что наличие аллеля С является неблагоприятным фактором при развитии УМ, в то время как аллель Т можно рассматривать как благоприятный фактор.

Нами была проведена оценка ранговых корреляций между генотипами гена ABCB1 и такими параметрами опухоли, как ее локализация, высота и диаметр, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, офтальмоскопически видимых собственных сосудов, гистологический тип опухоли, наличие эпибульбарного роста и отягощенного семейного анамнеза (табл. 2)

.

Корреляция частот генотипов СТ и СС полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с параметрами прогрессии увеальной меланомы представлены на рис. 4

Рисунок 1. Корреляция частот генотипов СТ и СС полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с параметрами прогрессии УМ. а — пигментация опухоли в 13 случаях, в 17 — умеренная или отсутствует; б — высота опухоли в 18 случаях менее 10 мм, в 12 — 10 мм и более; в — состояние сосудов: в 23 случаях видны, в 7 — не видны; г — гистологическое строение: 16 случаев — веретеноклеточный тип (Вер), 9 — смешанно-клеточный (Сме) и эпителиоидно-клеточный (Эпит).
. При этом удалось выявить значимую ассоциацию генотипа СС полиморфного маркера C3435T гена ABCB1 со степенью пигментации опухоли: с выраженной пигментацией исследовано 13 случаев, со слабой - 14, без пигментации - 3 (см. рис. 4). Частоты генотипов СТ и СС при выраженной пигментации опухоли значительно не отличались друг от друга и составили 52 и 46%, соответственно. В случае умеренно выраженной пигментации или ее отсутствия частота генотипа СС более чем в 2 раза превосходила таковую для генотипа СТ (71% (12 из 17 случаев) против 29% (5 из 17)). В настоящее время нет единого мнения относительно роли пигментации в течении опухолевого процесса при УМ, однако большая часть исследователей считают, что именно беспигментные и малопигментированные опухоли являются прогностически наиболее неблагоприятными [15]. В связи с этим наши данные могут свидетельствовать о большей злокачественности опухолей с генотипом СС.

Анализ распределения частот генотипов СС и СТ в зависимости от высоты опухоли показан на рис. 4, б. Исследованные опухоли были разделены на 2 группы: менее

10 мм (n=18) и 10 мм и более (n=12). При этом частота генотипов СС и СТ в первой группе была одинаковой и составила 50% (по 9 глаз в каждой подгруппе). Во второй группе мы отметили 3-кратное увеличение частоты генотипа СС по сравнению с генотипом СТ (75 и 25% соответственно), что свидетельствует о важной роли предрасполагающего генотипа СС гена ABCB1 в прогрессии УМ.

Нами была выявлена значимая ассоциация частот генотипов СС и СТ с наличием видимых сосудов в опухоли (n=23), что также принято считать относительно неблагоприятным прогностическим фактором (см. рис. 4, в). При этом частота генотипа СС составила 65%, а генотипа СТ - 35%. В 7 случаях видимые собственные сосуды при офтальмоскопии не выявляли, при этом частоты генотипов СС и СТ отличались незначительно и составили 42 и 58% соответственно.

При оценке ассоциации генотипов гена ABCB1 с различными гистологическими типами опухоли, такими как прогностически благоприятный веретеноклеточный (n=16), менее благоприятный смешанно-клеточный (n=9) и неблагоприятный эпителиоидно-клеточный (n=5), смешанно-клеточный и эпителиоидно-клеточный типы были объединены в одну группу (см. рис. 4, г). Частоты генотипов СС и СТ при веретеноклеточном типе опухоли не различались и составили по 50% (по 8 глаз в каждой группе). В случае смешанно-клеточного типа опухоли частота генотипа СТ составила 33% (3 глаза), тогда как частота генотипа СС была в 2 раза больше и составила 66% (6 глаз). При эпителиоидно-клеточном типе опухоли разница была еще больше - частота генотипа СТ была 20% (1 глаз), а генотипа СС - 80% (4 глаза). В объединенной группе с эпителиоидно-клеточным и смешанно-клеточным типом опухоли частота генотипа СТ составила 30%, а генотипа СС - 70%. Таким образом, убедительно показана неблагоприятная прогностическая значимость генотипа СС гена ABCB1 для развития УМ.

В одной из работ авторами была показана возможность выявления данных полиморфизмов в плазме крови, что в перспективе можно рассматривать как возможность потенциального скрининга по УМ для пациентов, входящих в группу риска по данному заболеванию, а также прогнозирования течения заболевания [4].

Заключение

В настоящей работе впервые изучены распределение частот генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с риском развития УМ и их связь с клинико-патоморфологическими параметрами УМ. Впервые показана статистически значимая ассоциация генотипа СС и ряда клинических (умеренная пигментация опухоли, высота опухоли и наличие видимых собственных сосудов) и патоморфологических (смешанно-клеточный и эпителиоидно-клеточный тип опухоли) факторов. При этом не выявлено связи между генотипами гена ABCB1 и такими клиническими факторами, как возраст пациента, локализация опухоли, диаметр основания, наличие гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, эпибульбарного роста опухоли и отягощенного семейного анамнеза. Полученные нами данные могут свидетельствовать о значимости генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в развитии УМ и их патогномоничности для этой патологии. В то же время наличие аллеля Т гена АBСB1, безусловно, свидетельствует об относительно благоприятном течении опухолевого процесса. Выявленные особенности могут использоваться для разработки в ходе дальнейших исследований современных подходов к прогнозированию течения УМ, а также для скрининга пациентов, находящихся в группе риска по данному заболеванию.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail