Злокачественные внутриглазные опухоли меланоцитарного генеза представляют угрозу не только для зрения, но и для жизни пациента. Их частота достигает 15% от общего числа меланом других локализаций, при этом частота увеальной меланомы (УМ) составляет 85-88% всех первичных внутриглазных злокачественных новообразований [3]. В России заболеваемость УМ колеблется от 6,23 до 8 человек на 1 млн взрослого населения в год [1, 3]. УМ характеризуется агрессивным прогрессирующим течением, высокой вероятностью метастазирования и летального исхода. Установлено, что через 5 лет у 50% пациентов с УМ после проведенного лечения диагностированы метастазы в печени [12, 14].
В последние годы уделяется особое внимание поиску факторов прогноза течения опухолевого процесса при УМ. Исторически первыми были изучены клинические факторы. К ним относятся пол, возраст, расовая принадлежность, иммунологический статус, общий статус больного, сопутствующие заболевания, локализация и размер опухоли [5]. К сожалению, в настоящее время взаимосвязь многих из вышеперечисленных факторов с УМ изучена недостаточно. Более чувствительными являются патоморфологические факторы. К ним можно отнести тип гистологического строения опухоли, степень инвазии склеры, прорастание за пределы фиброзной капсулы, характер и тип ангиогенеза, степень лимфоидной инфильтрации в строме опухоли, уровень пролиферативной активности клеток новообразования, размеры ядра и ядрышкового анализатора и др. [9]. Выявление молекулярно-генетических изменений при УМ представляется наиболее перспективным способом прогнозирования течения заболевания. В настоящее время накоплен большой опыт исследований цитогенетических изменений при УМ [2]. К наиболее характерным хромосомным перестройкам и нарушениям численности отдельных хромосом можно отнести потерю одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), что коррелирует с увеличением размера опухоли, вовлеченностью цилиарного тела, наличием в опухоли эпителиоидных клеток, полей оранжевого пигмента на поверхности опухоли, а также наличием замкнутых сосудистых петель [13].
При анализе клинических образцов, полученных от пациентов с УМ, были выявлены субпопуляции клеток, экспрессирующих маркер множественной лекарственной устойчивости (MDR), известный также как ABCB1 [8]. Ген MDR1/ABCB1 кодирует транспортный белок, гликопротеин Р, играющий ключевую роль в выведении целого ряда лекарственных веществ, включая препараты, применяемые при лечении УМ. На сегодняшний день у человека известно около 40 полиморфных маркеров гена MDR1. Как показали исследования, наибольшее клиническое значение имеет полиморфный маркер С3435Т, представляющий собой замену в нуклеотидной последовательности в положении 3435 цитозинового нуклеотида на тимидиновый [7]. Полиморфный маркер С3435Т гена MDR1, локализованный в экзоне 26, обусловливает изменение его экспрессии [10], что может приводить к замедленному выведению лекарственных препаратов. В работе
S. Landreville и соавт. [8] было показано, что субпопуляция клеток, содержащая АВСВ1-ген (ABCB1+), обладала как высокой метастатической, так и митохондриальной активностью в отличие от клеток, не содержащих данный ген (ABCB1–). При этом опухоли ABCB1+ соответствуют по своим свойствам опухолям, относящимся к классу 2 (по классификации AJCC TNM, учитывающей в том числе профиль экспрессии генов - GEP) [6], т.е. часто метастазируют и состоят из клеток различной степени дифференцировки, начиная от высокодифференцированных веретеновидных клеток и заканчивая низкодифференцированными эпителиоидными клетками. Опухоли ABCB1–, напротив, соответствуют опухолям класса 1 по той же классификации и обладают низкой метастатической активностью в сочетании с преобладанием дифференцированных веретеновидных клеток [11]. К недостаткам проведенных исследований относится невозможность проведения исследований in vivo с использованием первичных некультурированных клеток УМ. Такие факторы, как относительная редкость УМ и малое количество опухолевых клеток, полученных из относительно небольших новообразований, также препятствуют полноценным исследованиям в этой области [8]. Таким образом, исследование экспрессии гена ABCB1/MDR1 представляет интерес для практической офтальмоонкологии в связи с его потенциальной прогностической значимостью.
В связи с этим целью настоящей работы было изучение частоты распределения генотипов полиморфного маркера С3435Т гена MDR1/ABCB1 у больных с УМ in vivo и их взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами опухоли.
Материал и методы
Всего обследовано 30 ранее не леченных пациентов с УМ (12 мужчин и 18 женщин; 1:1,5) в возрасте от 23 до 72 лет (средний возраст 52,5±9,1 года). Во всех случаях глаза были энуклеированы. Гистологическая верификация опухоли проведена в отделе патологической анатомии и гистологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца.
Высота опухоли составила от 2,6 до 13,8 мм (9,05±3,8 мм), диаметр основания - от 8,2 до 21,9 мм (15,4±5,6 мм). По локализации в исследование вошли опухоли цилихориоидальной области (n=5, 16,7%), хориоидеи (n=22, 73,3%) и иридоцилиохориоидальной области (n=3, 10%). По пигментации выделяли слабо- (n=17, 56,7%) и сильнопигментированные опухоли (n=13, 43,3%). Также опухоли разделяли по следующим клиническим параметрам: наличие (n=4, 13,3%) и отсутствие (n=26, 86,7%) гемофтальма; наличие невысокой (n=12, 40%), высокой (n=11, 36,7%) отслойки сетчатки и ее отсутствие (n=7, 23,3%); наличие (n=14, 46,7%) и отсутствие (n=16, 53,3%) субретинального экссудата, наличие (n=5, 16,7%) и отсутствие (n=25, 83,3%) эпибульбарного роста опухоли, наличие (n=11, 36,7%) и отсутствие (n=19, 63,3%) онкологических заболеваний в семейном анамнезе пациента. По гистологическому строению выделяли веретеноклеточные (n=16, 53,3%) (рис. 1)
Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями. В качестве популяционного контроля использовали сопоставимую по возрасту и полу выборку лиц без онкологических заболеваний (n=60).
Материалом для исследования служила геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов периферической крови с помощью протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре –20 °С. Идентификацию аллелей полиморфного маркера C3435T (rs1045642) гена АBСB1 проводили с помощью ПЦР-ПДРФ. Для ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды: ABCB-3435-F 5’-aggtttcacatcaccaagattcc-3’ и ABCB-343а5-R 5’-TTCTCAGAAAGGAGTATGCCTTA-3’. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мМ трис-HCl; рН 8,9, 10 мМ 2-меркаптоэтанол,
25 мМ КС1, 0,1% тритон Х-100; 0,25 мМ каждого dNTP; 1-10 нг ДНК; 25 пмоль каждого праймера; 0,5 ед. Taq-полимеразы («СибЭнзим»); MgCl
Далее амплифицированный фрагмент ДНК гена АBСB1 подвергали обработке с использованием рестриктазы PctI («СибЭнзим») в термостате при 50 °С в течение 16 ч. При наличии мутантного ТТ-генотипа амплифицируемый в ходе ПЦР фрагмент гена АBСB1 размером 206 п.н. гидролизуется рестриктазой PctI на два фрагмента - 143 и 63 п.н. В гетерозиготном генотипе гена АBСB1 СТ присутствуют все 3 фрагмента.
Результаты ПДРФ анализировали электрофоретически в 10% полиакриламидном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете (рис. 3)
Статистическую обработку результатов проводили с использованием закона генетического равновесия Харди-Вайнберга для аутосомных признаков. При сравнении частот встречаемости генотипов применяли критерий Пирсона, а для малых выборок - точный критерий Фишера. Комплексную оценку связей между исследуемыми группами проводили с использованием логистической регрессии, определяя отношение шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (CI) с уровнем значимости, равным 0,05. Рассматривали также результаты статистически маргинально значимые (0,05<р≤0,1), что соответствует доверительному интервалу 94% (в отличие от стандартного доверительного интервала 95% при р=0,05). При сопоставлении генотипов и клинико-морфологических параметров опухоли учитывали такие факторы, как возраст пациента, высота и диаметр основания опухоли, локализация, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, отягощенного семейного онкологического анамнеза, а также гистологический тип опухоли. Расчеты проводили в системе для статистического анализа данных Statistica 6.1 RUS.
Результаты и обсуждение
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в контрольной группе и группе больных с УМ представлено в табл. 1
В 80% случаев был выявлен аллель С, что свидетельствует о высокой специфичности данного аллеля для УМ. При этом в опытной группе аллель С встречался почти в 2 раза чаще, чем в контрольной (80% против 41,7%).
Показана достоверная ассоциация предрасполагающего генотипа СС гена АBСB1 с риском развития УМ. Так, частота данного генотипа в группе больных оказалась в 4 раза выше по сравнению с группой контроля, в то же время генотип ТТ у больных обнаружен не был. Ассоциация генотипа CТ с риском развития УМ отмечалась в 40% случаев от общего количества аллелей С, тем не менее данная ассоциация не была значимой (p>0,05). Таким образом, можно предположить, что наличие аллеля С является неблагоприятным фактором при развитии УМ, в то время как аллель Т можно рассматривать как благоприятный фактор.
Нами была проведена оценка ранговых корреляций между генотипами гена ABCB1 и такими параметрами опухоли, как ее локализация, высота и диаметр, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, офтальмоскопически видимых собственных сосудов, гистологический тип опухоли, наличие эпибульбарного роста и отягощенного семейного анамнеза (табл. 2)
Корреляция частот генотипов СТ и СС полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с параметрами прогрессии увеальной меланомы представлены на рис. 4
Анализ распределения частот генотипов СС и СТ в зависимости от высоты опухоли показан на рис. 4, б. Исследованные опухоли были разделены на 2 группы: менее
10 мм (n=18) и 10 мм и более (n=12). При этом частота генотипов СС и СТ в первой группе была одинаковой и составила 50% (по 9 глаз в каждой подгруппе). Во второй группе мы отметили 3-кратное увеличение частоты генотипа СС по сравнению с генотипом СТ (75 и 25% соответственно), что свидетельствует о важной роли предрасполагающего генотипа СС гена ABCB1 в прогрессии УМ.
Нами была выявлена значимая ассоциация частот генотипов СС и СТ с наличием видимых сосудов в опухоли (n=23), что также принято считать относительно неблагоприятным прогностическим фактором (см. рис. 4, в). При этом частота генотипа СС составила 65%, а генотипа СТ - 35%. В 7 случаях видимые собственные сосуды при офтальмоскопии не выявляли, при этом частоты генотипов СС и СТ отличались незначительно и составили 42 и 58% соответственно.
При оценке ассоциации генотипов гена ABCB1 с различными гистологическими типами опухоли, такими как прогностически благоприятный веретеноклеточный (n=16), менее благоприятный смешанно-клеточный (n=9) и неблагоприятный эпителиоидно-клеточный (n=5), смешанно-клеточный и эпителиоидно-клеточный типы были объединены в одну группу (см. рис. 4, г). Частоты генотипов СС и СТ при веретеноклеточном типе опухоли не различались и составили по 50% (по 8 глаз в каждой группе). В случае смешанно-клеточного типа опухоли частота генотипа СТ составила 33% (3 глаза), тогда как частота генотипа СС была в 2 раза больше и составила 66% (6 глаз). При эпителиоидно-клеточном типе опухоли разница была еще больше - частота генотипа СТ была 20% (1 глаз), а генотипа СС - 80% (4 глаза). В объединенной группе с эпителиоидно-клеточным и смешанно-клеточным типом опухоли частота генотипа СТ составила 30%, а генотипа СС - 70%. Таким образом, убедительно показана неблагоприятная прогностическая значимость генотипа СС гена ABCB1 для развития УМ.
В одной из работ авторами была показана возможность выявления данных полиморфизмов в плазме крови, что в перспективе можно рассматривать как возможность потенциального скрининга по УМ для пациентов, входящих в группу риска по данному заболеванию, а также прогнозирования течения заболевания [4].
Заключение
В настоящей работе впервые изучены распределение частот генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с риском развития УМ и их связь с клинико-патоморфологическими параметрами УМ. Впервые показана статистически значимая ассоциация генотипа СС и ряда клинических (умеренная пигментация опухоли, высота опухоли и наличие видимых собственных сосудов) и патоморфологических (смешанно-клеточный и эпителиоидно-клеточный тип опухоли) факторов. При этом не выявлено связи между генотипами гена ABCB1 и такими клиническими факторами, как возраст пациента, локализация опухоли, диаметр основания, наличие гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, эпибульбарного роста опухоли и отягощенного семейного анамнеза. Полученные нами данные могут свидетельствовать о значимости генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в развитии УМ и их патогномоничности для этой патологии. В то же время наличие аллеля Т гена АBСB1, безусловно, свидетельствует об относительно благоприятном течении опухолевого процесса. Выявленные особенности могут использоваться для разработки в ходе дальнейших исследований современных подходов к прогнозированию течения УМ, а также для скрининга пациентов, находящихся в группе риска по данному заболеванию.