Гипотеза опухолевых стволовых клеток (СК) подразумевает существование в опухоли клеточной иерархии с наличием небольшой субпопуляции клеток, способных к неограниченному самовоспроизведению. Эти клетки служат источником пополнения основного клеточного пула опухоли. Изначально СК были описаны при лейкемии, затем при многих других новообразованиях, в том числе при опухолях мозга (глиомах, медуллобластомах, эпендимомах) [1]. В последнее время эта гипотеза нашла подтверждение не только при злокачественных опухолях ЦНС, но и при некоторых доброкачественных.

Теоретически СК находятся в состоянии покоя, вступая в клеточный цикл лишь в ответ на внешние воздействия, в частности под влиянием ростовых факторов. Нахождение в состоянии покоя делает их менее уязвимыми к повреждающим факторам, в том числе к химиотерапии (ХТ) и лучевой терапии (ЛТ). Опухолевые СК отличаются от более дифференцированных клеток опухоли активацией или, наоборот, подавлением некоторых сигнальных путей и, таким образом, они могут быть устойчивы к действию препаратов, имеющих целями эти сигнальные пути. В целом опухолевые СК играют ведущую роль в возникновении опухоли, ее прогрессии, опухолевом ангиогенезе и инфильтрации в здоровые окружающие ткани, а также отвечают за химио- и радиорезистентность и рецидивирование после хирургического и лучевого лечения.

A. Vescovi и соавт. [2] предложили пять основных характеристик стволовых клеток глиомы (СКГ): 1) неограниченная способность к самовоспроизведению, 2) способность к образованию опухоли при ортотопической имплантации, 3) генетические повреждения, 4) способность к генерации неопухолевых клеток, 5) способность к мультилинейной дифференцировке.

Происхождение СКГ остается предметом дискуссии. Высказано предположение, что возможны взаимные трансформации между СКГ, нейральными стволовыми клетками (НСК), нейроглиальными клетками-предшественниками (НГКП) и дифференцированными клетками глиомы (ДКГ). Наиболее вероятный источник СКГ — это НСК, поскольку в этом случае требуется меньше активирующих мутаций для запуска опухолевой прогрессии, чем для эктопического очага пролиферации. Кроме этого, НСК существуют относительно длительное время, что способствует накоплению мутаций. А. Shiras и соавт. [3] выделили CD133(+) НСК из ткани глиомы и подтвердили возможность спонтанной трансформации нетуморогенной НСК в СКГ. Молекулярные механизмы, контролирующие клеточную пролиферацию, одинаковы у СКГ и НСК. Дисфункция генов может привести к злокачественной трансформации НСК в СКГ, но пока окончательно не определено, какие именно мутации приводят к такой трансформации, поскольку для данной патологии не описано состояние предрака, хотя есть несколько сообщений о так называемых предраковых СК, которые способны как к доброкачественной, так и к злокачественной дифференцировке в зависимости от сигналов микроокружения.

Кроме НСК источником СКГ могут быть НГКП.

В частности, описано возникновение олигодендроглиальных опухолей (ОДО) из НГКП. При этом задействованы PDGFR-ассоциированные пути [4].

М. Junier и А. Sharif [5] обнаружили, что после нескольких дней воздействия трансформирующего ростового фактора TGF-α (который относится к семейству EGF и часто экспрессируется на ранних стадиях прогрессирования опухоли) зрелые астроциты могут обрести фенотип НГКП, а впоследствии под действием облучения приобретают злокачественные свойства, хотя считается, что нормальные астроциты не реагируют на γ-излучение. Эти данные свидетельствуют о возможности индукции злокачественной трансформации в зрелых глиальных клетках и образования из них СКГ.

Было показано, что в некоторых условиях (прежде всего при гипоксии) ДКГ могут дедифференцироваться в СКГ [6].

Панель специфических для СКГ маркеров до настоящего времени окончательно не определена. СКГ, выделенные из мультиформной глиобластомы (МГБ), экспрессируют маркеры CD133, CD105, CD90, Nanog, Oct 3/4, CXCR4 (CD184), NF (neurofilament protein), GAPDH (human glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase) [7]. Кроме того, СКГ экспрессируют маркеры, характерные для неопухолевых НСК, такие как астроцитарный маркер GFAP (glial fibrillary acidic protein), нестин, Sox-2, Misashi-1, Bmi-1 и не экспрессируют ранние (Tuj1) и поздние (NeuN) нейрональные маркеры и олигодендроглиальный маркер Olig-1 [8]. При культивировании СКГ могут дифференцироваться и приобретать маркеры нейрональной, астроцитарной и олигодендроглиальной линий (Tuj1, βIII-тубулин, Olif-1 и позднее NeuN).

Широко используемый маркер CD133 (prominin-1) является неспецифичным и его роль в возникновении и прогрессировании глиом до конца не раскрыта. Ранее считалось, что экспрессия CD133 коррелирует со степенью злокачественности опухоли [9], однако последние сведения не подтверждают этого. В злокачественных глиомах (ЗГ) CD133(+)-клетки представляют собой субпопуляцию мелких клеток с голубой цитоплазмой, способных к объемному росту в виде округлых нейросфер. Эти клетки высокотуморогенны. Интракраниальная инъекция всего 100 CD133(+)-клеток иммунодефицитным мышам приводит к развитию опухоли, которая может длительно существовать в виде вновь перевиваемых опухолей с сохранением исходного фенотипа. В то же время инъекция 10⁵ CD133(–)-клеток не в состоянии сформировать перевиваемую опухоль. Тем не менее в ряде случаев трудно объяснить быстрый рост опухоли только за счет CD133(+)-клеток, поскольку более половины больных имеют МГБ с низким содержанием CD133(+)-клеток [10]. Однако это стало объяснимым с обнаружением CD133(–)-клеток со свойствами СКГ, которые растут не в виде нейросфер, а в виде двухмерной пленки [11]. CD133(+) и CD133(–) СКГ имеют одинаковый туморогенный потенциал и образуют морфологически одинаковые опухоли, но в опухолях, образованных CD133(–) СКГ, содержится больше микрососудов и пролиферирующих клеток. МГБ с низким содержанием CD133(+)-клеток (менее 3%) имеют тенденцию к расположению в более глубинных структурах полушарий, обладают более инвазивным ростом с более частыми вовлечением желудочков и прогрессированием на фоне химиолучевого лечения (ХЛЛ), а также генным профилем, характерным для мезенхимального и пролиферативного подтипов. В то же время МГБ с высоким содержанием CD133(+)-клеток обладают пронейральным фенотипом [12]. Показана возможность трансформации CD133(+) СКГ в CD133(–) СКГ и наоборот. При этом МГБ, полученная из CD133(+)-клеток, при дальнейшем культивировании меняет свой молекулярно-генетический профиль (МГП) с пронейрального на мезенхимальный или пролиферативный, что может свидетельствовать о преимуществах в выживаемости и пролиферации CD133(–)-клеток [12]. В целом подобные трансформации подтверждают более сложный фенотип СКГ, обусловленный не только наличием CD133, но и многими другими факторами.

Нестин, изначально описанный как маркер НСК, позднее был обнаружен и в СКГ. Уровень его экспрессии повышается с увеличением злокачественности опухоли. Недавно обнаружена экспрессия нестина на молодых эндотелиоцитах. В ткани МГБ обнаружена коэкспрессия CD133, нестина и эндотелиального маркера CD31 на СКГ и эндотелиоцитах, что указывает на возможность трансформации СКГ в эндотелий [13].

Sox-2 — один из ключевых транскрипционных факторов, который отвечает за поддержание «стволовых» свойств клеток в эмбриогенезе и во взрослом организме. Он играет роль в формировании как нейронов, так и нейроглии, а также в канцерогенезе и развитии глиобластом. Амплификация гена Sox-2 наблюдается в 14,4% МГБ и 11,1% анапластических олигодендроглиом. Имеется положительная корреляция между степенью злокачественности опухоли и экспрессией Sox-2. Показано, что гиперцеллюлярные и гиперпролиферативные участки глиобластом имеют наивысшую экспрессию Sox-2 [14].

Протеин Bmi-1 подавляет транскрипцию гена INK4α, и этим способствует активации циклинзависимых киназ Cdk2 и Cdk4 и, следовательно, пролиферации. Bmi-1 был обнаружен на СК при различных гистологических типах глиом. Его экспрессия является независимым маркером плохого прогноза при ОДО [15].

CD90 является маркером гемопоэтических, мезенхимальных, печеночных СК и СК рака печени. CD90(+)-клетки с высокой частотой экспрессируются при ЗГ, крайне редко при глиомах низкой степени злокачественности (ГНСЗ — WHO II) и отсутствует в нормальной ткани мозга и при астроцитомах WHO I. При ЗГ CD90(+)-клетки обнаруживаются во всех опухолях, при анапластической астроцитоме (АА) — в 7% клеток, при МГБ — в 9% клеток. CD133(+)-клетки являются субпопуляцией CD90(+)-клеток. 100% CD133(+) СКГ являются также CD90(+), но лишь 80% CD90(+) СКГ являются CD133(+). Уровень экспрессии CD133 и CD90 снижается по мере дифференцировки СКГ в клетки глиомы. Способность к формированию нейросфер сопоставима между CD90(+)/CD133(+) и CD90(+)/CD133(–)-клетками и в 2 раза выше, чем у CD90(–)/CD133(–)-клеток [16].

Так называемая «side population» — субпопуляция опухолевых клеток, способных избавляться от флюоресцентных красителей, ранее также рассматривалась как популяция СК. Однако в дальнейшем эта их способность была признана недостаточной для того, чтобы относить их к СК [17].

Фенотип СКГ может существенно различаться как среди разных опухолей одного гистологического типа, так и внутри одной опухоли. При МГБ генный анализ обнаружил 117 генов, экспрессия которых различается в CD133(+) и CD133(–) подтипах СКГ [18]. На основании этого С. Lottaz и соавт. [11] выделили и два подтипа СКГ. Тип I демонстрирует «пронейральный» фенотип и имеет сходство с фетальными НСК, в то время как для типа II характерен «мезенхимальный» транскрипционный профиль, сходный с НСК взрослых, которые локализуются в субвентрикулярной зоне и гиппокампусе. Фенотипически тип I является CD133(+) с высокой экспрессией PDGFRα, EGFR и DCX (протеина нейрональной миграции) и низкой экспрессией CD44. Другие гены, активированные в СКГ I типа, такие как гены протеинов теплового шока, процессинга РНК и оксидативного фосфорилирования, указывают на высокую пролиферативную и метаболическую активность этих клеток. От фетальных НСК (своих немалигнизированных аналогов) СКГ I типа отличаются большей скоростью пролиферации, снижением способности к дифференцировке и стабилизацией теломер. Поскольку существование фетальных НСК у взрослых не доказано, то возникает вопрос о происхождении СКГ I типа. Наиболее вероятно приобретение НСК взрослых плюрипотентного фетального фенотипа посредством активации транскрипционного фактора Oct4 с последующей трансформацией в СКГ.

Тип II СКГ является CD133(–) с низкой экспрессией PDGFRα и DCX и высокой экспрессией CD44. EGFR при II типе экспрессируется в части клеток. В целом II тип СКГ более гетерогенен по своей молекулярной биологии. Также в СКГ II типа наблюдается активация TGF-β/BMP-сигнального пути, что делает эти клетки потенциальной мишенью для анти-TGF-β-терапии, и повышенная экспрессия интегринов, что может быть предиктором ответа на лечение ингибитором интегриновых рецепторов силенгитидом. От НСК взрослых (своих немалигнизированных аналогов/предшественников) СКГ II типа отличаются сниженной способностью к дифференцировке (прежде всего по олигодендроглиальной и нейрональной линиям) и большей пролиферативной активностью.

СКГ как I, так и II типа отличаются от своих немалигнизированных аналогов прежде всего сниженной способностью к дифференцировке, но не активацией аберрантных сигнальных путей. Поэтому лечебные стратегии, направленные на элиминацию СКГ, должны включать в себя не только блокирование сигналов от рецепторов ростовых факторов (это более актуально для «нестволовых» клеток глиом), но и дифференцирующую терапию.

На существование различий в фенотипе СКГ косвенно указывает то, что глиобластомы, развивающиеся в субвентрикулярной зоне, отличаются от глиобластом кортикальной зоны по молекулярному профилю и биологическим свойствам. Субвентрикулярные глиобластомы отличаются более высокой туморогенностью и имеют черты МГБ мезенхимального типа, в то время как кортикальные МГБ — пронейрального типа [19]. Можно предположить различное происхождение данных глиобластом от СКГ

II типа (субвентрикулярные глиобластомы) или СКГ I типа (кортикальные глиобластомы).

Имеются существенные различия между СК, выделенными из первичных и вторичных МГБ. Способностью к образованию микросфер на средах, предназначенных для культивирования НСК, обладают только СКГ, выделенные из первичных глиобластом. Это может свидетельствовать об общности происхождения СКГ и НСК. В то же время СКГ, выделенные из вторичных глиобластом, не формируют микросферы на средах для НСК, что свидетельствует об их происхождении от других клеточных предшественников, наиболее вероятно от НГКП или нейробластов. Это подтверждается схожим «пронейральным» молекулярно-генетическим фенотипом вторичных глиобластом и нейробластов [20].

В пределах одной опухоли фенотип СКГ также может различаться в зависимости от места нахождения клеток. Так, CD133(+) СКГ, находящиеся в периваскулярных нишах, имеют значительно большую экспрессию Sox-2, EGFR, Bmi-1 и нестина, но меньшую пролиферативную активность (лишь 3% Ki-67 по сравнению с 14% у одиночных CD133(+) СКГ). Кроме того, клетки в нишах имеют низкий уровень экспрессии эндотелиальных маркеров, в то время как одиночные CD133(+) СКГ в 43% экспрессируют CD31 и в 25% CD34, что указывает на их важную роль в неоангиогенезе и возможность трансдифференцировки в эндотелиоциты [21].

СКГ отвечают за возникновение, развитие и рецидивирование опухоли. Однако неопухолевые клетки, образующие микроокружение СКГ, также участвуют в регуляции опухолевого роста. Опухолевая сосудистая сеть не только выполняет функцию снабжения опухоли кислородом, но также служит нишей для СКГ, которые, подобно НСК, концентрируются в непосредственной близости от кровеносных сосудов, в так называемых периваскулярных нишах (ПВН) [22]. Нормальные НСК не распространены диффузно по всему мозгу, а в основном расположены в ПВН субвентрикулярной зоны. Нахождение именно в ПВН, где происходит контакт СК с эндотелиоцитами и другими клетками микроокружения, является обязательным условием поддержания «стволового» фенотипа. Здесь продуцируются факторы, контролирующие количество СК, пролиферацию, тип деления и дифференцировку.

В ЗГ ПВН в основном локализуются в зонах опухоли с наиболее выраженной микроваскулярной пролиферацией и псевдопалисадными некрозами. Структура ниш для СКГ и НСК схожа: она состоит из СК, астроцитов, клеток сосудистой стенки(эндотелиоцитов и перицитов), иммунных клеток (микроглии), фибробластов. Каждый из этих видов клеток оказывает влияние на прогрессирование опухоли, создавая условия для функционирования СКГ.

НСК. В исследовании R. Pallini и соавт. [23] было показано, что среди CD133(+)-клеток в глиобластоме от 20 до 60% составляют неопухолевые CD133(+) НСК, причем увеличение их количества благоприятно влияет на выживаемость больных с рецидивной МГБ. Обнаружено, что НСК обладают антионкогенными свойствами и в молодом возрасте способны блокировать глиомагенез. При развитии опухоли мозга НСК мигрируют в ткань опухоли, где проявляют противоопухолевые свойства, выделяя супрессорные факторы [24], в частности протеин ВМР-7 [25]. ВМРs (bone morphogenetic proteins) относятся к семейству цитокина TGF-β. На разных этапах канцерогенеза роль TGF-β прямо противоположна, т.е., с одной стороны, он уменьшает риск возникновения опухолей, а, с другой стороны, стимулирует рост уже возникших новообразований. СКГ экспрессируют рецепторы к ВМР и, таким образом, могут регулироваться этими протеинами. При воздействии BMPs СКГ замедляют пролиферацию и дифференцируются по астроцитарному или нейрональному пути, что снижает их туморогенные свойства. Однако те СКГ, которые не несут рецепторов к BMPs, при воздействии этих протеинов вместо дифференцировки начинают активно пролиферировать. Таким образом, необходимым условием ответа на BMPs-терапию является наличие соответствующих рецепторов.

Эндотелиоциты являются ключевым компонентом гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Они участвуют, с одной стороны, в защите нервной системы от потенциально опасных субстанций, а с другой — в обеспечении питания ткани мозга. Эндотелиоциты происходят из гемопоэтических СК и несут маркеры CD31, CD34, CD36. СКГ, подобно НСК, располагаются вдоль сосудистой стенки, где тесно прилежат к эндотелиоцитам, с которыми взаимодействуют как напрямую, так и посредством медиаторов, обеспечивающих пролиферацию и/или дифференцировку СК, среди которых PEDF (pigment epithelium derived factor), LIF (leukemia inhibitory factor), BDNF (brain derived neurotrophic factor) [26]. На влияние эндотелиоцитов указывает, в частности, тот факт, что увеличение их числа в ПВН ведет к увеличению количества СКГ и ускорению опухолевого роста. Эндотелиоциты выделяют NO — высокореактивный липофильный свободный радикал с периодом полураспада около 2—5 с. Высокая активность NO обнаружена в ПВН глиом. NO активирует гуанилциклазу, в результате чего образуется циклический гуанозин-3,5-монофосфата (cGMP), который осуществляет свои функции через эффектор протеинкиназу G (PKG). Кроме того, NO активирует в СКГ Notch-каскад, который является важным компонентом взаимодействия СКГ и эндотелиоцитов и способствует поддержанию «стволового» фенотипа СКГ [27]. Notch — трансмембранные белки, функционирующие и как протоонкогены, и как опухолевые супрессоры. Способность Notch проявлять онкогенную или антиканцерогенную активность зависит от гистогенеза экспрессирующих его клеток. Показана существенная роль рецептора Notch-1 и его лигандов Jagged-1 и Delta-1 в развитии ЗГ [28]. Среди генов-мишеней находятся транскрипционные факторы семейств HES (hairy and enhancer of split), HRT, HERP, отвечающие за разные линии дифференцировки, а также гены циклина D1 и p21^Cip1/Waf1, контролирующие клеточный цикл. Экспрессия Hey1 (одной из конечных мишеней Notch) коррелирует со степенью злокачественности и выживаемостью больных МГБ [29].

Помимо выделения NO, эндотелиальные клетки являются источником Notch-лиганд, которые связываются с соответствующими рецепторами на мембране СКГ [30]. В свою очередь СКГ стимулируют пролиферацию эндотелиоцитов и ангиогенез через продукцию VEGF и BDNF. Более того, СКГ также могут продуцировать Notch-лиганды, а эндотелиоциты имеют рецепторы к ним.

В частности, экспрессия СКГ лиганда Delta-4 запускает Notch-каскад в эндотелиоцитах и приводит к неоангиогенезу. Интересно, что анти-Delta-4-терапия приводит к снижению опухолевого роста, но не за счет снижения ангиогенеза, а благодаря парадоксальному усилению роста нефункциональных опухолевых сосудов [31]. Эти данные свидетельствуют о том, что Notch-путь может быть эффективной мишенью для воздействия на опухолевое микроокружение. Фармакологическое подавление активности Notch-пути приводит к уменьшению популяции нестин(+) и CD133(+)-клеток, а также к снижению способности к образованию опухолей в опытах in vivo [32].

Перициты, происходящие из мезенхимальных СК, стабилизируют и поддерживают единство сосудистой стенки, участвуют в иммунных процессах [33]. HIF-1 вызывает миграцию предшественников перицитов в перивентрикулярную область с последующим их вовлечением в процесс неоангиогенеза в опухоли. Перициты экспрессируют различные маркеры, в том числе нейроглиальный протеогликан-2 (NG2), гладкомышечный актин-α (α-SMA), десмин, PDGFRβ, хотя ни один из этих маркеров не является специфичным для перицитов. Перициты тесно связаны с эндотелиоцитами, отделяясь от них лишь общей базальной мембраной. Есть сведения, что эти клетки могут влиять на митотическую активность друг друга [34].

Микроглия. В ткани МГБ до 30% составляют иммунные клетки микроглии [35]. Иммунные клетки являются компонентом неопухолевой клеточной популяции и представлены макрофагами, лимфоцитами и натуральными киллерами. Преобладающими клетками являются макрофаги, которые происходят из CD34(+) костномозговых предшественников. Считалось, что наличие иммунных клеток в опухоли является защитным механизмом, направленным на торможение опухолевой пролиферации [36]. Однако последние исследования указывают на то, что опухолевые клетки напрямую стимулируют приток макрофагов в опухоль посредством HIF-1α и медиаторов МСР-1 (monocyte chemoattraction protein-1), МСР-3, sCSF-1 (soluble colony-stimulating factor — растворимый колониестимулирующий фактор) [37]. Под влиянием СКГ макрофаги меняют свой фенотип с провоспалительного на иммуносупрессивный, т.е. утрачивают способность к фагоцитозу, продукции провоспалительных медиаторов и индукции Т-лимфоцитов, но зато начинают вырабатывать факторы, способствующие иммуносупрессии и опухолевой прогрессии [38]. Это сопровождается снижением активности STAT1 и повышением активности STAT3, который является ключевым механизмом развития тумориндуцированной иммуносупрессии. Рекрутированные в опухоль макрофаги являются первым источником цитокинов и медиаторов, направленных на поддержание опухолевого роста: интерлейкин-10 способствует опухолевой пролиферации и миграции, матриксная металлопротеиназа ММР-14 (МТ1-ММР) — клеточной инвазии, Tie-2 и VEGF — сосудистой пролиферации и ангиогенезу, причем макрофагальная инфильтрация коррелирует с сосудистой плотностью в глиоме. Экспериментальное подавление функции микроглии в опытах in vivo приводит к уменьшению размера опухоли и увеличению выживаемости, а медикаментозная стимуляции макрофагов — к усилению опухолевой пролиферации и снижению апоптоза [39].

Астроциты в нормальной ткани мозга выполняют функцию стромы и экспрессируют маркер GFAP (glial fibrillary acidic protein). Периваскулярные астроциты тесно связаны с эндотелиоцитами, участвуя в образовании и функционировании ГЭБ [40]. Также они регулируют активность СК при непосредственном контакте и с помощью нейромедиаторов. О. Becher и соавт. [41] показали, что неопухолевые астроциты могут изменять свой фенотип и продуцировать многие факторы, влияющие на опухолевую биологию. Такие активированные астроциты встречаются в ПВН глиом. Они экспрессируют SHH (sonic hedge-hog), а активация SHH/Gli сигнального пути является одним из условий самовоспроизведения СКГ, которые несут на себе рецептор этого пути Patched. Экспрессия как SHH, так и его эффектора Gli1 коррелирует со степенью злокачественности глиом, а подавление SHH/Gli-сигнального пути приводит к значительному снижению клеточной миграции и инвазии глиом [42]. Кроме того, астроциты играют роль в опухолевой инвазии путем активации металлопротеиназ и экспрессируя AEG-1 (astrocyte elevated gene-1), также отвечающий за инвазию СКГ [43]. Таким образом, реактивные астроциты в ПВН помогают поддерживать «стволовой» фенотип соседним СКГ.

Фибробласты в ПВН продуцируют проММР-2, ассоциированную с опухолевой инвазией и прогрессией [44].

Помимо уже упомянутых TGF-β/BMP, NO/cGMP, NOTCH и SHH/Gli-1 сигнальных путей в СКГ также наблюдается повышенная активность PI3K/Akt, MEK/ERK, Wnt-каскадов.

Значение PI3K/Akt-при медуллобластомах подробно изучали D. Hambardzumyan и соавт. [45]. СК в ПВН оказались более устойчивы к действию ЛТ по сравнению с нестволовыми опухолевыми клетками именно из-за повышенной активности PI3K/Akt-пути, благодаря которому СК не подвергаются апоптозу, как большинство нестволовых клеток, а выходят из клеточного цикла и возобновляют деление примерно через 72 ч, восстанавливая опухолевый объем. При глиомах PI3K/Akt-сигнальный путь активирован примерно у 70% больных и ассоциируется с агрессивным течением и резистентностью к терапии [46].

С PI3K/Akt-сигнальным каскадом тесно связан MEK/ERK-сигнальный путь [47]. Блокирование MEK/ERK-пути приводит к снижению образования нейросфер СКГ в сочетании с усилением их дифференцировки на нейрональную и глиальную линию. Это проявляется снижением экспрессии нестина, Misashi, Bmi-1, Sox2 и других стволовых маркеров и повышением экспрессии βIII-тубулина (нейрального маркера). Инактивация MEK/ERK или PI3K/mTOR приводит к активации другого пути, что указывает на их тесную взаимосвязь. Протеин FoxО3а является общим звеном, объединяющим PI3K/Akt/mTOR и MEK/ERK-сигнальные пути, и ключевым транскрипционным фактором, вызывающим дифференцировку СКГ с соответствующим снижением их туморогенных свойств. Одновременная инактивация обоих путей наиболее эффективна: число βIII-тубулин-позитивных клеток достигает 95%, хотя на жизнеспособность клеток это не влияет, т.е. ингибирование указанных путей имеет прежде всего дифференцирующую, а не цитостатическую направленность. Методы комбинированной блокады указанных сигнальных путей или методы активации FoxO3a могут быть потенциальной целью лечения МГБ [47, 48].

Wnt-сигнальный путь играет роль в пролиферации нейральных клеток-предшественников субвентрикулярной зоны и в дифференцировке НСК. При глиомах Wnt-путь обусловливает пролиферативную и инвазивную активность опухолевых клеток. При МГБ часто наблюдается гиперметилирование гена-промотора DKK-1, эндогенного антагониста Wnt [49]. Реактивация DKK-1 вызывает усиление апоптоза и замедление опухолевого роста на 60%. Подавление активности Wnt-пути отражается на функционировании PI3K/Akt-пути, подтверждая тесную связь между этими двумя механизмами канцерогенеза [50].

Понимание механизмов взаимодействия опухоли с окружающими клетками может помочь в разработке новых лечебных стратегий, направленных на опухолевое микроокружение.

Инвазия опухолевых клеток в здоровую ткань мозга является одной из основных отличительных черт ЗГ. CD133(+) СКГ обнаруживают высокую (в 4—5 раз большую) инвазивную способность по сравнению с нестволовыми опухолевыми клетками как in vitro, так и in vivo. Это связано с гиперэкспрессией различных протеинов.

В частности, ММР-13, 14, 16 отвечают за деградацию межклеточного матрикса и облегчают клеточную инвазию. SEMA3C (Semaphorin 3C) под воздействием ADAMTS1 (a disintegrin and a metalloprotease with trombospondin motifs 1) стимулирует клеточную миграцию. L1CAM (L1 cell adhesion molecule или CD171) обеспечивает клеточную адгезию, его наибольшая экспрессия обнаружена на клетках опухолевого края, непосредственно проникающих в соседние ткани [51]. Кроме того, СКГ экспрессируют CDH-11 (Cadherin-11) — кальцийзависимую молекулу межклеточной адгезии, играющую роль как в развитии нормальной ткани мозга, так и в миграции опухолевых клеток.

Одной из наиболее характерных особенностей МГБ, которая включена в качестве диагностического критерия в классификацию ВОЗ, является микроваскулярная пролиферация [52]. Ангиогенез в МГБ развивается в ответ на гипоксию и наиболее интенсивен в глубоко гипоксичных областях вокруг псевдопалисадных некрозов. Гипоксия приводит к увеличению продукции факторов HIF-1α и HIF-2α, которые индуцируют экспрессию VEGF, что в свою очередь ведет к микроваскулярной гиперплазии и эндотелиальному спрутингу из существующих сосудов. Для продукции VEGF «нестволовыми» опухолевыми клетками достаточно воздействия HIF-1α, но для СК необходимо комплексное воздействие HIF-1α и HIF-2α [53]. В условиях опухолевой гипоксии численность CD133(+)-клеток увеличивается в 3 раза. Причем количество CD133(+)-клеток не возвращается к исходным показателям после перехода к нормоксии, а остается на стабильно высоком уровне не менее 7 сут. Увеличение численности СКГ происходит за счет как их усиленной пролиферации, так и генетического репрограммирования более дифференцированных клеток глиомы в сторону «стволового» фенотипа и их трансформации в СКГ [54]. Это проявляется существенным повышением экспрессии «стволовых» маркеров OCT4, NANOG, c-MYC, отвечающих за поддержание плюрипотентных свойств СКГ.

Участие СКГ в опухолевом ангиогенезе многообразно. Прежде всего СКГ продуцируют значительно большее, чем нестволовые опухолевые клетки, количество проангиогенных факторов, таких как VEGF, SDF-1 (stromal-derived factor 1), HDGF (hepatoma-derived growth factor), которые индуцируют миграцию циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (ЦЭКП) и неоангиогенез в опухоли. Бевацизумаб достаточно эффективно нейтрализует ангиогенные эффекты VEGF. В опытах in vivo было показано, что наибольший эффект бевацизумаба наблюдается на ксенографтах глиобластом, полученных из популяции СКГ, в то время как в отношении ксенографтов, полученных из опухолевых клеток с «нестволовым» фенотипом, эффект бевацизумаба весьма скромный. Это свидетельствует, что именно СКГ являются основным источником ангиогенных факторов [55].

Помимо продукции медиаторов ангиогенеза, предполагается возможность трансдифференцировки СКГ в эндотелиоциты, хотя в этом вопросе имеются определенные противоречия. С одной стороны, в некоторых исследованиях показано, что неопухолевые НСК могут дифференцироваться в эндотелиальные клетки [56], а учитывая, что наиболее вероятный источник СКГ — именно НСК, логично предположить такую способность и для СКГ.

L. Ricci-Vitiani и соавт. [57] обнаружили, что значительное количество эндотелиальных клеток в опухоли (от 20 до 90%, в среднем 60,7%) несет те же генные мутации, что и клетки МГБ (альтерации хромосом 10, 19q, 22q) что указывает на их опухолевое происхождение. R. Wang и соавт. [58] выявили дефекты хромосомы 7, связанные с EGFR, на CD105(+) эндотелиальных клетках, полученных из МГБ. Было установлено, что доля эндотелиальных клеток с аберрацией хромосомы 7 примерно соответствует доле CD133(+)-клеток глиомы с такой аберрацией. Абляция VEGF или VEGFR блокирует созревание опухолевых предшественников эндотелиоцитов в зрелый эндотелий и препятствует формированию сосудов из ЦЭКП, но не влияет на дифференцировку CD133(+)-клеток в предшественники эндотелиоцитов. В то же время инактивация NOTCH-пути блокирует эту дифференцировку, что указывает на целесообразность одновременного воздействия на VEGF и NOTCH-сигнальные пути для более эффективного подавления опухолевого неоангиогенеза. Y. Soda и соавт. [59] также подтвердили возможность VEGF-независимой трансдифференцировки опухолевых клеток в эндотелиоциты. Таким образом, небольшая группа мультипотентных СКГ может давать начало не только опухолевым массам, но и их микроокружению.

С другой стороны, группа патоморфологов под руководством F. Rodriguez [60], не подвергая сомнению принципиальную возможность трансформации СКГ в эндотелиоциты, отмечает, что в тканях глиобластом, удаленных у пациентов, васкулярные и периваскулярные неопластические клетки составляют менее 10% от общего количества сосудистых клеток, и, по-видимому, этот механизм ангиогенеза не играет существенной роли в реальных условиях.

В дополнение к двум указанным механизмам неоангиогенеза существует феномен васкулогенной мимикрии (ВМ), который предполагает, что наиболее агрессивные опухолевые клетки (к которым относятся СКГ) могут самостоятельно формировать сосудоподобные структуры, способные проводить кровь и лимфу [61, 62]. ВМ матриксного типа отличается полным отсутствием эндотелиоцитов; каналы образованы базальными мембранами, к которым с наружной стороны прилежат опухолевые клетки. ВМ тубулярного типа характеризуется появлением каналов, похожих на сосуды эндотелиального типа с наличием клеточной выстилки на внутренней поверхности базальной мембраны. Однако эти клетки отличаются отсутствием экспрессии CD34 и эндотелиальных маркеров и наличием экспрессии EGFR и маркеров, ассоциированных с васкулогенной мимикрией, таких как EphA2, ламинин 5γ2, нейропилин-2. S. El Hallani и соавт. [62] обнаружили ВМ тубулярного типа в 57,5% глиобластом, в том числе в 45% как единичные сосудоподобные структуры в препарате и в 12,5% как множественные, охватывающие несколько участков. Кроме того, показано, что CD133(+), но не CD133(–), СКГ способны трансформироваться в гладкомышечные клетки, участвующие в образовании сосудистой стенки.

Как уже было отмечено, для поддержания стволового фенотипа как нормальных НСК, так и СКГ необходима гипоксия, которая поддерживается в ПВН. Гипоксические условия обусловливают некоторые особенности метаболизма СКГ, в частности низкий уровень митохондриального дыхания и повышенный уровень гликолиза. Этот метаболический сдвиг, описанный как «Варбургский эффект», характеризуется повышенным образованием лактата из пирувата в ущерб превращению пирувата в ацетилкоэнзим А. По сравнению с нормальными НСК в СКГ этот эффект выражен сильнее. При этом СКГ становятся малочувствительны к обычной терапии, но уязвимы к подавлению гликолиза. Комбинация ингибиторов гликолиза и стандартной терапии эффективна в отношении гибели СКГ in vitro и подавления образования опухоли in vivo [63].

Кроме того, в условиях гипоксии повышается уровень протеинфосфатазы РР2А (protein phosphatase 2A), которая является регулятором клеточного цикла и клеточной смерти. Активность РР2А коррелирует с экспрессией HIF-1α (р=0,002) и выживаемостью пациентов: при высокой активности РР2А пациенты имеют достоверно худшую выживаемость (8,1 мес против 21 мес, р=0,002). РР2А обусловливает блокирование клеточного роста в G1/S фазе за счет активации ДНК-чекпойнта посредством активации Chk-1-киназы и дефосфорилирования фосфолипазы К (PLK). Остановка клеточного цикла снижает потребление АТФ в СКГ при гипоксии. РР2А также негативно регулирует RTK/RAS/PI3K-путь, что является еще одним механизмом торможения пролиферации и повышения выживаемости СКГ в гипоксических условиях. Подавление активности РР2А приводит к повышению клеточной пролиферации, истощению клеточных запасов АТФ и р53-независимому апоптозу гипоксических СКГ. Таким образом, использование ингибиторов гликолиза или ингибиторов РР2А может быть потенциальной целью противоопухолевой терапии [64].

Считается, что СКГ более резистентны к стандартной ХТ и лучевому лечению, чем «нестволовые» клетки. Существует несколько объяснений. Во-первых, это активизация механизмов репарации ДНК [82]. Во-вторых, снижение повреждения ДНК из-за меньшего образования свободных радикалов. В-третьих, активация сигнальных путей, отвечающих за стволовой фенотип. Вопрос о чувствительности или резистентности СКГ к ЛТ до конца не раскрыт.

По мнению S. Bao и соавт. [65] CD133(+)-клетки как in vitro (в клеточной культуре), так и in vivo (на внутримозговых ксенографтах у безтимусных мышей) демонстрируют бóльшую устойчивость к γ-излучению по сравнению с CD133(–)-клетками из-за ранней активации механизмов клеточного контроля (checkpoint). Активность чекпойнткиназ Chk1 и Chk2 существенно повышена в СКГ, что приводит к остановке клеточного цикла в контрольной точке G2/M (G2/M-арест) и включению механизмов репарации ДНК. Таким образом, СКГ избегают апоптоза и впоследствии возобновляют пролиферацию, что приводит к рецидиву опухоли. Специфическое блокирование чекпойнткиназы Chk1с помощью лентивирусного вектора приводит к увеличению в 2 раза (с 17,82±0,38 до 37,87±0,32%) количества клеток в состоянии апоптоза и трехкратному (с 60,2±1,28 до 22,37±2,01%) снижению доли клеток в состоянии G2/M ареста, т.е. повышает чувствительность СКГ к облучению [66]. Это может способствовать преодолению радиорезистентности опухоли.

А. McCord и соавт. [67] в опытах in vitro обнаружили, что CD133(+) СКГ более чувствительны к ЛТ по сравнению с обычными клетками глиобластомы. Так, после облучения в дозе 4 Гр фракция живых СКГ не превышает 12%, в то время как среди остальных клеток составляет около 33%. После облучения в мес?