Суррогатное материнство — современный вид вспомогательных репродуктивных технологий, при котором в процедуре экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) используются донорские ооциты по программе суррогатного материнства (ЭКО-СМ). Особенностью данных беременностей является вынашивание плода, не несущего материнских генов и являющегося аллогенным по отношению к материнскому организму [1]. Данное обстоятельство, несомненно, влияет на становление иммунологической толерантности в системе мать—плацента—плод и повышает риск развития реакций по типу хозяин против трансплантанта, а также трансплантант против хозяина [1, 2]. По данным Н.С. Трифоновой и соавт. [3], несмотря на соматическое здоровье суррогатных матерей и положительный акушерский анамнез, беременность при ЭКО-СМ протекает со значительным количеством осложнений, таких как преэклампсия, преждевременные роды, гестационная артериальная гипертензия и др. Таким образом, можно предположить, что предиктором развития осложнений беременности при донации ооцитов в программе суррогатного материнства является нарушение иммунологической толерантности в системе мать—плацента—плод, что морфологически проявляется иммунной альтерацией последа в точках наиболее тесного контакта материнских и плодовых тканей. Такими участками являются децидуальная ткань, ткани плацентарного ложа и ворсинчатый хорион [4].

Цель исследования — выявление структурных и иммуногистохимических особенностей последа и плацентарного ложа после ЭКО-СМ.

В ряд морфологических исследований включены 26 пациенток, беременность которых наступила в результате ЭКО-СМ. В группу сравнения вошли 13 пациенток, беременность которых наступила после ЭКО с собственной яйцеклеткой (ЭКО-СО). От всех пациенток, включенных в исследование, получено добровольное информированное согласие (ЛЭК ФГАОУ ВО «МГМУ им. И.М. Сеченова» на основании приказа № 470 Р от 19.10.12). Критериями включения в группу исследования стали одноплодная беременность, родоразрешение в сроки гестации более 30 нед, отсутствие тяжелой экстрагенитальной патологии, а также осложнений беременности с хорошо изученным патогенезом (преэклампсия, антифосфолипидный синдром, наследственные формы тромбофилии и др.). Морфологическое исследование выполнено на материале плацент (плацентарный диск) и плацентарного ложа, полученных после родоразрешения путем кесарева сечения.

Проводили макроскопическое исследование нефиксированных частей последов согласно принятому протоколу [5]. Последовательно изучали все части последа: пуповину, плодные оболочки и плацентарный диск. Массу ворсинчатой части определяли после удаления оболочек, пуповины и свертков крови. Для каждого последа рассчитывали плацентарно-плодный коэффициент (отношение массы плацентарного диска к массе плода в граммах, при доношенном сроке равное 0,12—0,17) [6]. Гистологическое исследование проводили на парафиновых срезах плацент и плацентарного ложа, окрашенных гематоксилином и эозином. Изучали образцы из парацентральных и краевых отделов последа. Определяли ряд патологических изменений ткани последа, характерных для материнской мальперфузии (центральные ишемические инфаркты, децидуальная васкулопатия, гипоплазия дистальных отделов ворсин), плодных стромально-сосудистых поражений (васкулопатия сосудов стволовых ворсин, патологическая незрелость ворсин, диссоциированное развитие котиледонов), компенсаторно-приспособительных (изменения Тенни—Паркера) и иммунопатологических процессов (массивные отложения фибриноида, лимфоплазмоцитарный децидуит). Признак считали выраженным, если его обнаруживали более чем в 5 из 10 полей зрения (×200) в характерной части плацентарного диска. Также проводили полуколичественную оценку очагов хронического воспаления в децидуальной ткани последа и тканях плацентарного ложа по методике Amsterdam Placenta Working Group, 2014 [7]. При этом активность децидуита определяли по количеству клеток лимфоплазмоцитарного ряда в поле зрения (0 баллов — отсутвие/единичные клетки, 1 балл — до 15 клеток в поле зрения, 2 балла — до 30 клеток в поле зрения, 3 балла — более 30 клеток в одном поле зрения).

Иммуногистохимическое исследование выполняли на парафиновых срезах, изготовленных из биопсийного материала. Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4—5 мкм, расположенных на стеклах, покрытых полилизиновым слоем (Menzel Glаser Polylisine, Германия). Неокрашенные срезы каждого случая обрабатывали с помощью стандартного метода иммуногистохимии с термической демаскировкой антигенов. Демаскировку проводили на водяной бане с микропроцессором PT Module (Thermo Scientific, США). Для блокировки эндогенной пероксидазы стекла инкубировали в течение 10 мин с ингибитором пероксидазы, после чего срезы ополаскивали в фосфатном буфере (рН 7,0—7,6) и для блокирования неспецифических белковых взаимодействий инкубировали с Ultrа-V-Block (LаbVision, США) в течение 30 мин. В качестве первичных антител использовали мышиные антитела к общему цитокератину (клон AE1/AE3) (Dako, разведение 1:50) и HLA-DR (клон TAL.1B5) (Dako, разведение 1:50), CD138 (клон MI15) (Dako, разведение 1:50).

После инкубации с первичными антителами срезы тщательно отмывали в фосфатном буфере (рН 7,0—7,6). Для выявления первичных антител, связавшихся с соответствующими антигенами, использовали универсальную полимерную систему Histofine Simple Stain MAX PO (MULTI) (Nichirei, Япония). Для визуализации места связывания антитела с антигеном использовали реакцию окисления субстрата 3,3-диаминобензидина (ДАБ) пероксидазой хрена в присутствии перекиси водорода с образованием нерастворимого в органических растворителях конечного продукта реакции, который обнаруживался в виде коричневого окрашивания специфических структур клеток (N-Histofine DAB-2V, Nichirei, Япония).

При постановке иммуногистохимических реакций в обязательном порядке ставили положительные и отрицательные контроли. Положительный контроль для каждого антитела отбирали в соответствии с рекомендациями производителя антител.

Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи программного пакета для статистических исследований IBM SPSS Statistics 23 (IBM, США).

Для переменных, относящихся к интервальной шкале (вес, средний коэффициент), при помощи построения гистограмм с расчетом среднего значения и стандартного отклонения проверяли, подчиняются ли их значения нормальному распределению. Поскольку полученное распределение значительно отклонялось от нормального, при анализе применяли непараметрические методы, так же как и для анализа переменных, относящихся к порядковой шкале (степень выраженности морфологических изменений). Для сравнения средних величин использовали следующие непараметрические тесты:

1) точный метод Фишера для малых выборок;

2) U-тест по методу Манна–Уитни при сравнении двух независимых выборок;

3) t-критерий Стьюдента при сравнении двух независимых выборок.

Утверждение о различии сравниваемых выборок считали справедливым, если вероятность составляла р<0,05.

При макроскопическом исследовании плацент группы ЭКО-СМ было отмечено увеличение средней массы плацент (687,62±81,2 г) по сравнению с ЭКО-СО (490,00±25,1 г), а также увеличение среднего плацентарно-плодного коэффцицтента (0,21±0,15 против 0,18±0,02). В группе ЭКО-СМ были обнаружены ложные узлы пуповины в 2 (7,6%) случаях, центральные и краевые инфаркты в 5 (19,2%) и 14 (53,2%) случаях соответственно. Также в 2 (7,6%) случаях определены межворсинчатые тромбы. Полученная разница не была статистически достоверной, частота встречаемости описанных макроскопических признаков не превышала таковую, по данным литературы. Гистопатология плацент в обеих группах представлена в табл. 1.

При гистологическом исследовании плацент в группе ЭКО-СМ отмечали высокую частоту встречаемости центральных ишемических инфарктов (в 69% плацент), диссоциированного развития котиледонов (в 61% плацент), патологической незрелости ворсин в основном с преобладанием промежуточных дифференцированных ворсин (в 46% плацент) и массивного отложения перивиллезного фибриноида (в 73% плацент). Полученные различия с группой сравнения были достоверны (p<0,05). При этом не получено достоверных различий по таким признакам, как изменения Тенни—Паркера, дистальная гипоплазия, децидуальная васкулопатия и васкулопатия сосудов стволовых ворсин (см. табл. 1).

Отдельно проводили балльную оценку активности лимфоплазмоцитарного децидуита, который отмечался более чем в 80% плацент женщин, беременность которых наступила в результате ЭКО-СМ. Под термином «лимфоплазмоцитарный децидуит» принято понимать присутствие в базальной или париетальной децидуальной ткани повышенного количества лимфоцитов, макрофагов и плазматических клеток [8]. При этом если наличие макрофагов и лимфоцитов является вариантом нормы (без указания количества), то присутствие в децидуальных инфильтратах плазматических клеток всегда расценивается как патология [9]. Для определения качественного состава клеточного инфильтрата децидуальной ткани и детекции плазматических клеток применяли иммунопероксидазный метод с использованием мышиных первичных антител к CD138 (клон MI15). В нашем исследовании CD138 выявляли в виде коричневого цитоплазматического окрашивания клеток. Группа ЭКО-СМ характеризовалась выраженным лимфоплазмоцитарным децидуитом, активность которого в 2 раза превышала значение контрольной группы (1,23±0,4 балла против 0,5±0,3 балла) (рисунок).

Была также проведена оценка выраженности воспалительных инфильтратов в плацентарной площадке, на границе эндометриального и миометриального сегментов, а также изучена степень ремоделирования спиральных артерий. Под термином «плацентарная площадка» принято понимать участок в матке (децидуальная пластинка и миометрий), расположенный непосредственно под местом имплантации плодного яйца, а затем и формирования плаценты [10]. В состав плацентарного ложа, помимо тканей децидуальной оболочки, содержащей эндометриальные сосуды, пучки миоцитов эндометрия, входят фрагменты якорных ворсин, вневорсинчатый цитотрофобласт, многоядерные гигантские клетки. Интерстиций плацентарного ложа состоит из фибробластов, их длинных отростков, экстрацеллюлярного матрикса и постоянного фибриноидного компонента. Вместе с коллагеном I и III типа они образуют каркас для остальных компонентов плацентарного ложа. Спиральные артерии плацентарной площадки (суммарно 100—150 штук) вовлекаются в процесс гестационного ремоделирования, при этом до 90% миометральных сегментов этих артерий в норме подвергаются полной трансформации. С помощью выделяемых вневорсинчатым трофобластом протеаз происходит лизис эластомышечных элементов спиральных и радиальных артерий матки с полным замещением фибриноидом всех элементов стенки (в том числе эндотелия) этих сосудов, что способствует постоянному увеличению притока материнской артериальной крови к ворсинам плаценты [11]. Цитотрофобластическая инвазия в эндометриальные и миометральные сегменты спиральных артерий матки имеет волнообразный характер (первая волна на 6-й неделе, вторая — на 16–18-й неделе гестации). Этот процесс обеспечивает полную автономию маточно-плацентарного кровотока от вазопрессорных влияний матери и адекватное кровоснабжение плода.

При изучении биопсийного материала плацентарных площадок в группе ЭКО-СМ были описаны следующие изменения: ремоделирование спиральных артерий более чем в 40% было неполным, а в 30% спиральных артерий гестационные изменения отсутствовали. В группе сравнения более 90% спиральных артерий характеризовались полной гестационной перестройкой (табл. 2).

Также отмечалась очаговая лимфогистиоцитарная инфильтрация периваскулярных областей. Повышенное количество клеток хронического воспаления вокруг сосудов плацентарной площадки ассоциировано с формированием материнской мальперфузии за счет неполной гестационной перестройки спиральных артерий.

Для определения напряженности иммунологических процессов и детекции развертывания реакции отторжения трансплантата провели иммуногистохимическое исследование плацент и плацентарного ложа c антителами к HLA-DR — одного из антигенов MHC класса II, участвующих в презентации потенциально чужеродных антигенов, который при иммунофенотипировании может быть использован в качестве маркера активированных клеток и индикации реакции отторжения трансплантата. HLA-DR экспрессируется антигенпрезентирующими клетками, такими как дендритные клетки, макрофаги, В-лимфоциты, а также активированные Т-лимфоциты и клетки эндотелия. Было выявлено достоверное (p<0,05) увеличение количества HLA-DR-положительных клеток в плацентарном ложе (дендритные клетки и макрофаги материнского происхождения) в группе ЭКО-СМ по сравнению с контролем, что подтверждает длительную иммунизацию тканей матери антигенами аллогенного плода (см. табл. 2). Морфологически дендритные клетки имеют неправильную форму, просветленное ядро и выраженное цитоплазматическое окрашивание антителами к HLA-DR, локализуются в областях, где наиболее тесно контактируют ткани матери и плода, в области якорных ворсин в децидуальной ткани и местах инвазии вневорсинчатого трофобласта в ткань плацентарного ложа.

При иммуногистохимическом исследовании с антителами к панцитокератинам (Pan-CK) выявлены гигантские многоядерные клетки (ГМК) трофобласта, при этом отмечалось увеличение количества ГМК в группе ЭКО-СМ (104,56±4,21 против 65,67±14,45). ГМК трофобласта рядом авторов расцениваются как тупик цитотрофобластической инвазии [12]. Вероятно, увеличение количества ГМК в группе ЭКО-СМ является отражением сложности процессов инвазии полностью аллогенным трофобластом, который встречает более агрессивный иммунный ответ со стороны материнского организма. Таким образом, беременность аллогенным плодом приводит к развитию патологии плацентарного ложа, заключающейся в дефектах ремоделирования спиральных артерий, очагах хронического воспаления в периваскулярных областях, увеличении количества ГМК вневорсинчатого трофобласта.

Данное исследование установило достоверное увеличение активности базального децидуита в плаценте и иммуновоспалительных процессов в плацентарных площадках в группе ЭКО-СМ по сравнению с группой сравнения, что согласуется с данными литературы [1—3]. Иммунные взаимодействия, реализующиеся еще с этапа внедрения бластоцисты, формируют иммунологическую толерантность в системе мать—плод. В результате первой волны цитотрофобластической инвазии клетки, аллогенные по отношению к материнскому организму, внедряются в ткани матки. В результате материнский организм продуцирует антиотцовские антитела, которые фиксируются на плаценте. Они обладают иммунотропным действием, блокируя эфферентное звено иммунного ответа на местном уровне, что делает плаценту иммунологически привилегированной тканью [13]. При этом инвазия во время второй волны аллогенного трофобласта в маточно-плацентарный сегмент спиральных артерий также может быть нарушена вследствие выраженной иммунной реакции материнского организма. Однако, несмотря на схожесть данных процессов с реакциями отторжения трансплантата, беременность с донорской яйцеклеткой пролонгируется и сохраняется до момента родов. Трофобласт, несущий только чужеродные антигены, возможно, активирует иные механизмы установления толерантности, что клинически проявляется повышенным риском развития осложнений беременности. Местами наиболее тесного контакта материнских и плодных тканей являются базальная децидуальная ткань, синцитиокапиллярный барьер ворсин и инвазивный трофобласт плацентарного ложа. Наличие в этих точках лимфогистиоцитарной инфильтрации подтверждает факт напряженности иммунных процессов [14]. Активность и продолжительность иммунных реакций в местах контакта подтверждаются увеличением количества HLA-DR-положительных клеток.

Структурные особенности плацент и плацентарных площадок женщин, беременность которых наступила в результате ЭКО-СМ, характеризуются выраженной иммунной альтерацией последа, проявляющейся высокой частотой развития иммунных реакций в местах наиболее тесного контакта материнских и плодовых тканей: массивными отложениями перивиллезного фибриноида, наличием базального децидуита и иммуновоспалительных инфильтратов в плацентарных площадках. Иммунный патогенез данных процессов подтверждается иммуногистохимическими исследованиями, показывающими увеличение количества HLA-DR-положительных клеток. Особенности инвазии аллогенного трофобласта приводят к значительной патологии плацентарного ложа, заключающейся в дефектах ремоделирования спиральных артерий, развитии очагов хронического воспаления в периваскулярных областях, увеличении количества гигантских многоядерных клеток трофобласта. Можно предположить, что иммунная напряженность в плацентах после программы суррогатного материнства является следствием нарушения иммунной толерантности в системе мать—плод, вызванного аллогеностью донорской яйцеклетки.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Е.Е.Р., Е.А.К., Н.С.Т.

Сбор и обработка материала — С.Н. Б., Е.Е. Р.

Статистическая обработка — Н.В.Ж.

Написание текста — Е.Е.Р.

Редактирование — Е.А.К., Н.С.Т.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Коган Е.А. — https://orcid.org/0000-0002-1107-3753

Руденко Е.Е. — https://orcid.org/0000-0002-0000-1439; e-mail: redikor2@yandex.ru

Демура Т.А. — https://orcid.org/0000000269466146

Жарков Н.В. — https://orcid.org/0000-0001-7183-0456

Трифонова Н.С. — https://orcid.org/0000-0002-2891-3421

Баянова С. — https://orcid.org/0000-0002-6959-1537