Актуальность проблемы хронической HBV- и HCV-инфекции обусловлена широкой распространенностью хронических заболеваний печени, ассоциированных с HBV и HCV, высоким уровнем заболеваемости среди лиц молодого возраста, частым развитием неблагоприятных исходов с инвалидизацией и значительной летальностью на определенных этапах их естественного течения [1-3]. В настоящее время патологические состояния, вызываемые HBV и HCV, рассматриваются как единый поступательный процесс - от развития острого гепатита (ОГ) через формирование хронического гепатита (ХГ) к трансформации в цирроз печени (ЦП) и гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК) [4]. Объединяющими факторами для ХГ, ЦП и ГЦК являются вирусы гепатита B и С, а также хроническое воспаление печени, в основе которого лежат повреждение, регенерация и прогрессирующий фиброгенез [5, 6]. Вместе с тем для каждой нозологической формы заболевания характерно преобладание одного из перечисленных процессов: для ХГ - преобладание повреждения и регенерации, для ЦП наряду с сохраняющимся повреждением и непрерывной регенерацией - процессов несбалансированного фиброгенеза [5, 6], а для ГЦК при сохраняющемся повреждении и несбалансированном фиброгенезе - характерна патологическая пролиферация. Различный патогенез хронической HBV- и HCV-инфекции с разными механизмами повреждения печени обусловливает особенности клинического течения и морфологической картины [7-10], а также различную частоту развития неблагоприятных исходов. Вместе с тем особенности иммунного клеточно-опосредованного повреждения гепатоцитов, обусловленные разным функциональным состоянием внутрипеченочных лимфоцитов, в различной степени подверженных гибели путем апоптоза при разных вариантах течения и исходах хронической HBV- и HCV-инфекции, являются основой сходных морфологических изменений и часто несоответствующих им клинических проявлений.

Цель исследования - выявление особенностей иммунного клеточно-опосредованного повреждения гепатоцитов при различных вариантах естественного течения и исходах хронической HBV- и HCV-инфекции.

Задачи исследования: на основании определения уровня экспрессии проапоптозных (Fas, FasL) и противоапоптозного (bcl-2) факторов на поверхности внутридольковых лимфоцитов определить степень потенциальной готовности внутридольковых лимфоцитов к апоптозу в сопоставлении с морфологическими изменениями и клиническими проявлениями при различных вариантах естественного течения и исходах хронической HBV- и HCV-инфекции.

Проведен анализ клинических, морфологических и иммуногистохимических (ИГХ) данных у 29 больных ХГС, у 29 - ХГВ, у 5 умерших от декомпенсированного ЦПС и ЦПВ соответственно, а также у 5 больных, умерших от ГЦКС и ГЦКВ соответственно. Формирование исследованных групп осуществлялось методом слепой выборки. Определяли уровень цитолитического синдрома, или среднее содержание АлАт в сыворотке крови.

Для морфологического исследования образцы ткани печени фиксировали 10% нейтральным формалином, проводили через спирты восходящей крепости по общепринятой методике и заливали в парафин. Приготовленные из парафиновых блоков срезы ткани толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону. Полуколичественно определяли индекс гистологической активности (ИГА) и стадию заболевания по степени выраженности фиброза (по Knodell) [11]. ИГХ-исследования проводили в срезах толщиной 4 мкм, приготовленных из залитого в парафин материала. Определяли относительное содержание Fas-, FasL- и bcl-2-позитивных лимфоцитов внутри печеночных долек. Использовали мышиные моноклональные антитела к Fas (в разведении 1:40), к FasL (в разведении 1:40), к bcl-2 (в разведении 1:200) производства «Novocastra Laboratories Ltd.» (Великобритания), а также полимерная ИГХ-система EnVision («DAKO», США) согласно рекомендациям изготовителей. Подсчет Fas-, FasL- и bcl-2-позитивных лимфоцитов проводили в 6 полях зрения (по 3 поля из центролобулярных отделов и по 3 поля из парабазальных отделов разных печеночных долек) при увеличении в 400 раз. Проведен расчет отношения FasL/Fas/bcl-2, обозначаемый как индекс потенциальной готовности внутрипеченочных лимфоцитов к апоптозу [6] и отражающий их функциональное состояние. Высокое значение этого интегрального показателя предполагает наличие необходимых условий для запуска процесса апоптоза и высокую вероятность его начала. Низкий показатель индекса потенциальной готовности к апоптозу характеризует низкую вероятность запуска процесса апоптоза. В качестве контроля при проведении ИГХ-исследований использовали образцы ткани печени 5 больных, умерших от различных заболеваний. Критерием формирования контрольной группы являлось отсутствие клинико-биохимических, серологических и морфологических признаков поражения печени. Достоверность различий между сравниваемыми параметрами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Корреляционные зависимости определяли непараметрическим критерием Спирмена. При обработке материала использовали пакет компьютерных программ Statistica 5.5.

Проведенный сравнительный анализ выраженности и характера клеточной инфильтрации в паренхиме печени, функциональной активности внутридольковых лимфоцитов при хронической HBV- и HCV-инфекции в зависимости от морфологической активности ХГ показал значительные различия в направленности и выраженности изменений указанных показателей в зависимости от этиологии и стадии патологического процесса, что, несомненно, свидетельствует о различных патогенетических механизмах их естественного течения.

У больных ХГС уровень абсолютного содержания лимфоцитов внутри печеночных долек в зависимости от гистологической активности гепатита достоверно превышал таковой у пациентов с ХГВ и имел тенденцию к возрастанию по мере увеличения тяжести процесса. Увеличение гистологической активности ХГВ и ХГС закономерно характеризовалось возросшим уровнем абсолютного содержания внутрипеченочных лимфоцитов (r=0,7 при ХГВ и r=0,63 при ХГС), сменившим состояние внутрипеченочной «лимфопении», отмечаемой при ХГВ и ХГС с минимальной гистологической активностью гепатита. Наибольшее содержание внутридольковых лимфоцитов наблюдалось при высокой гистологической активности ХГ (табл. 1)

Выраженность цитолитического синдрома у больных ХГС в отличие от больных ХГВ (r=0,7) не зависела от уровня абсолютного содержания внутридольковых лимфоцитов (табл. 2)

Причиной несоответствия клинической картины и морфологических изменений при ХГС может явиться различное функциональное состояние внутридольковых лимфоцитов.

Оценка механизмов регуляции апоптоза внутрипеченочных лимфоцитов при ХГС и ХГВ по экспрессии на поверхности внутридольковых лимфоцитов проапоптозных Fas (CD95), FasL и противоапоптозного bcl-2 факторов выявила существенные разнонаправленные тенденции. Количественная характеристика выраженности экспрессии Fas, FasL и bcl-2 и их зависимости от характера патологического процесса показала, что в группе больных ХГВ лимфоциты, экспрессирующие Fas, определялись достоверно чаще, чем в контроле, и уровень экспрессии был очень высоким (24,34±3,36 и 6,93±3,03% соответственно; р<0,05). Еще более высокий уровень содержания в паренхиме печени лимфоцитов, экспрессирующих Fas, наблюдался в группе больных ХГС (30,27±3,37%; р<0,05). В то же время содержание FasL-позитивных лимфоцитов оказалось более высоким в нормальной печени, чем в печени больных ХГВ (9,75±0,79% против 5,85±1,21% при ХГВ; p>0,05), а у больных ХГС наблюдалась гиперэкспрессия этого антигена (46,78±3,52%). Экспрессия лимфоцитами bcl-2 оказалась одинаковой в группах больных ХГВ, ХГС и в контроле (18,09±3,01, 19,50±3,79 и 24,34±3,42% соответственно; p>0,05).

Разнонаправленные показатели экспрессии проапоптозных и антиапоптозного факторов на поверхности внутридольковых лимфоцитов демонстрируют различные регуляторные механизмы повреждения гепатоцитов на различных этапах естественного течения хронической HBV- и HCV-инфекции в зависимости от этиологии. На этапе ХГ высокий уровень экспрессии Fas и FasL при низком уровне экспрессии bcl-2 на поверхности внутридольковых лимфоцитов у больных ХГС с умеренной и высокой гистологической активностью ХГ обусловливает высокий показатель потенциальной готовности лимфоцитов к апоптозу, предполагающий их низкую функциональную активность. Умеренно высокий уровень экспрессии Fas, низкий уровень экспрессии FasL и bcl-2 на поверхности лимфоцитов в паренхиме печени больных ХГВ с умеренной и высокой гистологической активностью характеризуют достоверно более низкий, чем у больных ХГС, показатель потенциальной готовности лимфоцитов к апоптозу, свидетельствующий об их значительной функциональной активности (0,16±0,05 при ХГВ против 0,25±0,08 при ХГС; p>0,05). Таким образом, низкая потенциальная готовность внутридольковых лимфоцитов к апоптозу у больных ХГВ по сравнению с больными ХГС приводит к более высокому уровню повреждения гепатоцитов при ХГВ, выражающемуся в достоверно более высоком уровне цитолитического синдрома при одинаковой гистологической активности гепатита (965,2±269,0 ед/л у больных ХГВ против 248,4±95,0 ед/л у больных ХГС; p<0,05; рис. 1)

В условиях сохраняющейся умеренной или высокой гистологической активности процесса у больных декомпенсированным ЦП и сходной морфологической картины независимо от этиологии показана различная степень нарушения регуляторных механизмов клеточно-опосредованного повреждения. Сопоставление уровня экспрессии проапоптозного Fas-рецептора на поверхности внутридольковых лимфоцитов у больных ХГ и ЦП, ассоциированных с HBV и HCV, при одинаковой гистологической активности гепатита, соответствующей умеренному и выраженному повреждению, показало достоверно более высокий уровень его содержания (p<0,05) на поверхности внутрипеченочных лимфоцитов у больных ХГ. У больных ХГС и ЦПС наблюдался достоверно более высокий (p<0,05) уровень экспрессии Fas на поверхности внутридольковых лимфоцитов по сравнению с больными ХГВ и ЦПВ. Больные ЦПС и ЦПВ демонстрировали одинаковый уровень экспрессии FasL внутридольковыми лимфоцитами (p>0,05) при достоверном преобладании содержания FasL-позитивных лимфоцитов внутри печеночных долек у больных ХГС по сравнению с больными ХГВ (p<0,05). Вместе с тем у больных с хронической HBV-инфекцией экспрессия FasL на внутридольковых лимфоцитах была более выражена при ЦП. Одинаковый уровень содержания противоапоптозного фактора bcl-2 на поверхности внутридольковых лимфоцитов у больных ХГС и ХГВ, достоверно более низкий по сравнению с контрольными показателями (p<0,05), на этапе ЦП оказался в зависимости от этиологии патологического процесса разным и у больных ЦПС был значительно выше, чем у больных ЦПВ (p<0,05).

У больных ЦПВ высокая готовность внутридольковых лимфоцитов к апоптозу влечет за собой снижение их функциональной активности и клеточно-опосредованного повреждения, что приводит к уменьшению выраженности цитолитического синдрома (по сравнению с больными ХГВ) при сохраняющейся умеренной или высокой гистологической активности. Низкая потенциальная готовность внутридольковых лимфоцитов к апоптозу у больных ЦПС, которая должна была бы привести к возрастанию клеточно-опосредованного повреждения и нарастанию выраженности цитолитического синдрома, ввиду достоверно низкого уровня абсолютного содержания лимфоцитов внутри печеночных долек, не приводит к нарастанию цитолиза (рис. 2)

Ткань печени при ГЦК, при состоявшейся цирротической трансформации органа, являющейся закономерным исходом ЦП при естественном течении хронической HBV- и HCV-инфекции, имеет типичные макроскопические и микроскопические морфологические изменения, характерные для ЦП.

Экспрессия Fas на поверхности внутридольковых лимфоцитов в паренхиме печени была достоверно выше у больных ГЦКВ, чем у больных ГЦКС (47,3±17,63 и 14,79±7,48% соответственно; p>0,05). В строме опухоли содержание Fas-позитивных лимфоцитов было значительно ниже и достоверно не отличалось в зависимости от этиологии (p>0,05). Аналогичная тенденция выявлена при анализе экспрессии FasL на поверхности внутридольковых лимфоцитов. Отмечена гиперэкспрессия FasL на поверхности внутридольковых лимфоцитов у больных ГЦКВ (39,44±17,6% в ткани печени против 7,98±2,45% в опухолевой ткани; p>0,05). У больных ГЦКС наблюдался достоверно более низкий уровень таких лимфоцитов в строме опухоли (p<0,05). Содержание внутридольковых лимфоцитов, экспрессирующих bcl-2, в паренхиме печени у больных ГЦКС было достоверно выше, чем у больных ГЦКВ (p<0,05), в опухолевой ткани экспрессия этого антигена на поверхности внутридольковых лимфоцитов у больных ГЦКВ выявлялась редко и так же, как у больных ГЦКС, была достоверно ниже, чем в интактной печени.

У больных ГЦКВ высокая готовность внутридольковых лимфоцитов к апоптозу влечет за собой снижение их функциональной активности, но, учитывая значительно более высокий уровень относительного содержания CD8-позитивных лимфоцитов в паренхиме [12], не приводит к снижению выраженности клеточно-опосредованного повреждения, проявляющегося в сохранении цитолитической активности (среднее содержание АлАт в сыворотке крови 109,4±20,3 ед/л). Больные ГЦКС со значительно более низким показателем потенциальной готовности лимфоцитов к апоптозу (p<0,05), но значительно меньшим относительным содержанием лимфоцитов в паренхиме печени характеризовались меньшей степенью повреждения гепатоцитов, проявляющейся в значительно менее выраженном уровне цитолитического синдрома (среднее содержание АлАт в сыворотке крови 37,67±9,02 ед/л). Потенциальная готовность тканевых лимфоцитов, расположенных в опухолевой ткани, к апоптозу, учитывая крайне низкий уровень экспрессии bcl-2 на их поверхности, по всей видимости, является высокой, что может объяснить несостоятельность клеточной противоопухолевой защиты и прогрессирование опухолевого роста (см. рис. 2).

Естественное течение хронической HCV- и HBV-инфекции, обусловленное персистенцией гепатотропного вируса, осуществляется посредством постоянного повреждения гепатоцитов преимущественно клеточно-опосредованным путем. Каждый из его этапов характеризуется различной морфологической картиной, определяемой различными патогенетическими механизмами, общим и важнейшим из которых является клеточное иммунное воспаление с сохраняющимся клеточно-опосредованным повреждением гепатоцитов. На этапе ХГ в паренхиме печени наблюдается наибольшее содержание внутридольковых лимфоцитов, в том числе CD8-позитивных [12], принимающих непосредственное участие в иммуноопосредованном повреждении гепатоцитов. Возрастание внутридольковой клеточной лимфоцитарной инфильтрации при увеличении гистологической активности гепатита на этапе ХГ сопровождается повышением показателей цитолитического синдрома, свидетельствующего о нарастании повреждения гепатоцитов. Несоответствие схожих морфологических изменений, отражаемых индексом гистологической активности, различному уровню цитолитического синдрома у больных ХГВ и ХГС обусловлено различным функциональным состоянием внутридольковых лимфоцитов в паренхиме печени. Они экспрессируют про- и противоапоптозные факторы, соотношение которых отражает потенциальную готовность самих внутридольковых лимфоцитов к апоптозу. Следовательно, регуляция клеточно-опосредованного повреждения гепатоцитов осуществляется в том числе и посредством изменения функциональной активности элементов клеточного звена иммунитета. Сопоставимая гистологическая активность, определяемая в том числе и по степени выраженности внутридольковой лимфоцитарной инфильтрации, при ЦП и ГЦК не приводит к развитию той степени выраженности цитолитического синдрома, которая характерна для ХГ, что обусловлено состоянием внутридольковых лимфоцитов, имеющих более высокую степень готовности к апоптозу и низкую функциональную активность и соответственно меньшую степень вероятности клеточно-опосредованного повреждения гепатоцитов. Таким образом, несоответствие морфологической картины истинной выраженности повреждения гепатоцитов обусловлено функциональными особенностями внутридольковых лимфоцитов на разных этапах течения хронической HCV- и HBV-инфекции.