Истинная акантолитическая пузырчатка (или пузырчатка обыкновенная — Pemphigus vulgaris) — хроническое везикулобуллезное заболевание с поражением кожи и слизистых оболочек из группы более 20 аутоиммунных пузырных (буллезные) дерматозов — подгрупп Pemphigus и Bullous pemphigoid [1]. Аутоиммунные буллезные дерматозы встречаются у менее 1% пациентов с дерматопатологией, однако являются наиболее опасными для жизни заболеваниями. W. Lever [2] первым предложил не объединять указанные подгруппы буллезных дерматозов; позднее было установлено, что в многослойном плоском эпителии при заболеваниях из подгруппы Pemphigoid аутоантитела направлены против компонентов гемидесмосом, тогда как патологические процессы Рemphigus характеризуются наличием аутоантител к белкам десмосом [3].

В зависимости от уровня расщепления эпидермиса и формирования пузырей Pemphigus делят на две основные формы: глубокие, к которым относят P. vulgaris (и ее вариант P. vegetans — пузырчатку вегетирующую) и поверхностные, например P. foliaceus (пузырчатку листовидную). Имеется также несколько более редких форм, в том числе пузырчатка себорейная (или эритематозная) и др. [4].

Наиболее распространенной формой истинной акантолитической пузырчатки является P. vulgaris с патогномоничными акантолитическими клетками в свежих пузырях; эта форма включает вариант с преимущественным поражением слизистых оболочек (доминирующая мукозная P. vulgaris) и смешанный мукозно-эпидермальный вариант.

Патогенез пузырчатки. Аутоантитела направлены против трансмембранных гликопротеинов — десмоглеина-1 (Dsg1) и/или десмоглеина-3 (Dsg3), которые являются членами семейства молекул клеточной адгезии, а именно кальцийзависимыми гомодимерными кадгеринами; в норме они образуют трансадгезионный интерфейс между цитоплазматическими выростами и латеральными плазмолеммами эпителиоцитов. На ультраструктурном уровне десмоглеины формируют центральную осмиофильную зону в специализированных межклеточных контактах типа десмосом и в macula adherens промежуточных контактов.

Мукозная доминантная форма P. vulgaris характеризуется пузырями на слизистых оболочках и аутоантителами против Dsg3; при этом у пациентов с сочетанными поражениями слизистых оболочек и кожи циркулируют аутоантитела к обоим десмоглеинам –1 и 3.

Существует оригинальная гипотеза [5], объясняющая преимущественное поражение кожных покровов или слизистых оболочек при различных формах Pemphigus. Согласно этой гипотезе, Dsg1 и Dsg3 могут взаимозаменять (или компенсировать) друг друга и предотвращать акантолиз при таргетировании аутоантителами любой из молекул десмоглеинов. Так, Dsg1 экспрессируется во всей толще эпидермиса, однако более интенсивно в верхних слоях, тогда как Dsg3 тяготеет к базальному и отчасти шиповатому слоям. Поэтому аутоантитела к Dsg1 индуцируют расслоения в поверхностных слоях эпидермиса, поскольку в этой зоне содержания Dsg3 недостаточно для компенсации заблокированного Dsg1. В результате при P. foliaceus (листовидной пузырчатке) поражается только кожа.

В слизистых оболочках полости рта и гениталий Dsg3 экспрессируется во всех слоях многослойного плоского эпителия, при этом Dsg1 — только в поверхностных. Аутоантитела к Dsg3 обусловливают поражение глубоких слоев слизистой оболочки, поскольку в этой зоне Dsg1 практически отсутствует и не компенсирует блокировку Dsg3. Результат — доминирующий мукозный вариант P. vulgaris, при котором кожа остается непораженной, так как Dsg1 локализуется глубоко в эпидермисе и компенсирует заблокированный аутоантителами Dsg3.

В тех случаях, когда оба десмоглеина (Dsg1 и Dsg3) таргетированы аутоантителами, компенсационный механизм не работает. По мере диффузии IgG это приводит к супрабазальной дезинтеграции многослойного эпителия, поскольку организация десмосом нарушается как в коже, так и в слизистых оболочках. В результате манифестирует сочетанная форма поражения и слизистых оболочек с эпителием кожного типа, и самих кожных покровов [5].

Эта элегантная теория взаимодействия аутоантител с десмоглеинами вполне самодостаточна и применима к большинству случаев пузырчатки, тем не менее имеются наблюдения почти с 20 различными аутоантителами, которые не укладываются в эту теорию, но коррелируют с клиническими особенностями дерматоза [1].

Кроме того, механизм IgG-индукции акантолиза остается предметом дискуссий, предложено три теории: 1) пространственная (стерическая) блокировка, 2) нарушение молекулярных сигнальных каскадов в клетках и 3) препятствие сборки десмосом в сочетании с их диссоциацией. Первая теория заключается в том, что возможна прямая интерференция IgG с аминоконцевым внеклеточным доменом десмоглеинов, что может приводить к полному расщеплению десмосом. Вторая теория сосредоточена на роли сложных взаимодействий между протеинкиназой p38 (p38MAPK), RhoA, протеинкиназой C, рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), плакоглобином и c-Myc [6]. Третья теория IgG-индукции акантолиза предполагает два пути: первый — IgG приводит к редукции несвязанного Dsg3 путем эндоцитоза и уменьшению сборки десмосом, второй — IgG блокирует уже встроенный в десмосому Dsg3, что приводит к разрушению сформированных десмосом и возможной интернализации Dsg3 в эндосомы.

Таким образом, в основе патогенеза Pemphigus — ослабление специализированных межклеточных контактов в многослойном эпителии кожного типа как производного эктодермы, который является основой эпидермиса и выстилает слизистые оболочки полости рта и гениталий.

Диагностика пузырчатки. Доказана важность как можно более ранней диагностики и лечения пузырчатки, при этом хороший ответ на лечение признан лучшим прогнозом для пациента [7, 8]. Кроме того, для определения прогноза и выбора лечения заболевания важна дифференциальная диагностика между различными формами дерматоза.

Диагноз подтверждают с помощью гистологического (тотального) и цитологического (отпечаток свежего пузыря) исследования. Кроме того, все формы Pemphigus характеризуются наличием эпидермальных и циркулирующих антител к поверхностным антигенам эпителиоцитов. Методом прямой иммунофлюоресценции (ИФЛ) в очагах поражения и прилегающем к ним эпидермисе выявляют локализованные в межклеточных пространствах IgG, а также IgM и IgA с или без С3-компонента комплемента [9].

Роль количественного содержания аутоантител как предикторов течения болезни неоднозначна. Например, более высокий уровень аутоантител против Dsg1 (100 ед/мл) прямо коррелировал с плохим прогнозом при однофакторном статистическом анализе; однако после корректировки с учетом возраста пациентов достоверность показателей была резко снижена [10].

По данным ретроспективного анализа гистопатологических данных и ИФЛ биоптатов кожи 81 пациента с аутоиммунными пузырными дерматозами [11], сделан вывод о том, что метод прямой ИФЛ высокоинформативен при сомнительных клинических и гистопатологических данных в случаях Р. vulgaris и P. herpetiformis, но низкоинформативен при P. vegetans, P. foliaceus и P. erythematosus. Кроме того, количественные показатели титра аутоантител не коррелируют с тяжестью клинического течения пузырчатки, ответом на терапию и прогнозом заболевания [12]. Поэтому большинство исследователей и дерматологов в оценке результатов лечения по-прежнему используют только клинический осмотр [1].

Для повышения его эффективности предложена неинвазивная диагностика с помощью отражательной конфокальной микроскопии и оптической когерентной томографии, в том числе на визуально не пораженных участках кожи на расстоянии от везикул 1—2 и 2—3 см [13]. Первый метод позволяет выявлять субэпидермальные и интраэпидермальные пузыри за счет высокого разрешения у 75 и 50% пациентов с Pemphigoid и Pemphigus соответственно; второй метод — за счет глубины проникновения во всех случаях. При этом в 62,5% случаев Pemphigus отражательная конфокальная микроскопия помогает выявлять акантолитические клетки [13]. По-видимому, эти методы будут способствовать более точной диагностике пузырчатки, однако проблемы патогенеза и таргетной терапии по-прежнему не решены.

Цель исследования — изучить ультраструктуру эпидермоцитов в биоптатах кожи с учетом современных данных о патоморфогенезе истинной акантолитической пузырчатке.

Дерматологический осмотр кожных покровов и слизистых оболочек полости рта, носа и гениталий у 9 пациентов (2 мужчины и 7 женщин в возрасте от 31 года до 56 лет) с P. vulgaris и 1 женщина с P. foliaceus в возрасте 45 лет. У всех пациентов имелись многочисленные пузыри и эрозивные поражения преимущественно на лице, спине и коже рук, у 4 пациентов выявлены эрозии в полости рта и у 2 женщин — во влагалище. Биопсии кожи были взяты при наличии положительного симптома Никольского под лидокаиновой анестезией из пограничной зоны поражения у 4 пациентов с мукозно-эпидермальной, или смешанной формой P. vulgaris и у 1 пациентки с P. foliaceus, не получавших системные кортикостероиды, с целью дифференциальной диагностики и при наличии информированного согласия пациентов.

Биоптаты фиксировали в охлажденном 4% параформальдегиде, приготовленном на фосфатном буфере Миллонига (рН 7,4) в течение 2 сут, постфиксировали в 1% тетроксиде осмия и после обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и ацетоне заливали в смесь эпона и аралдита. Полутонкие срезы окрашивали 1% азуром II и изучали с помощью микроскопа Axio Scope. A1 с фотокамерой AxioCam MRc5 («С. Zeiss»); ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM 100-S при ускоряющем напряжении 60 кВт.

При гистопатологическом исследовании полутонких срезов биоптатов кожи с положительным симптомом Никольского при Р. vulgaris смешанной формы (рис. 1, а)

В отличие от наблюдений Р. vulgaris при Р. foliaceus (см. рис. 1, б) дезинтеграция эпидермоцитов с расщеплением эпидермиса выявлена на уровне шиповатого слоя, при этом расширения межклеточных пространств имелись между кератиноцитами всех слоев эпидермиса, за исключением рогового. При обеих формах пузырчатки полутонкие срезы позволяли визуализировать «остистость» плазмолемм эпидермоцитов из перифокальных акантолизу очагов, что свидетельствовало о расширении межклеточных пространств с одновременной атрофией эпителиоцитов. Кроме того, обращали на себя внимание эпидермоциты с повышенной плотностью цитоплазматического матрикса, по-видимому, трансформируемые в патогномоничные для пузырчатки акантолитические клетки. Их удалось обнаружить в полости формирующегося пузыря в одном наблюдении (см. рис. 1, в).

При электронно-микроскопическом исследовании ультратонких срезов все биоптаты кожи характеризовались весьма расширенными межклеточными пространствами в эпидермисе, уменьшением числа десмосом, отсутствием их регулярности и гипоплазией в базальном и шиповатом слоях. Большинство десмосом выглядели частичными, т. е. были полностью «оторваны» от одной из соседних клеток (рис. 2, а).

Расширение межклеточных пространств особенно выражено в перифокальных к очагам акантолиза участках. Десмосомы в них полуразрушены, плазмолеммы эпидермоцитов растянуты до предела. Несмотря на то что при двух формах дерматоза акантолиз развивался в разных слоях эпидермиса, и при Р. vulgaris (см. рис. 2, а), и при P. foliaceus (см. рис. 2, б) редукция специализированных межклеточных контактов имела место на уровне базального слоя.

Во всех биоптатах выявлялись базальные и шиповатые эпидермоциты, свойственные акантолизу, с мелкими десмосомами, с опустошением цитоплазмы и редукцией тонофиламентов, необходимых для формирования десмосом (рис. 3, а).

В большинстве эпителиоцитов базального и шиповатого слоев отмечены ультраструктурные признаки снижения биосинтетической активности: почти в половине ядер редукция или рексис ядрышка, в цитоплазме вакуолизация и уменьшение числа митохондрий и профилей цитоплазматической сети, что обусловливало парциальное опустошение цитоплазмы, преимущественно перинуклеарное (см. рис. 3, б). Кроме того, обращало на себя внимание резкое уменьшение количества тонофиламентов, а при сохранении — их коагуляция и фрагментация и недостаточное участие в создании специализированных межклеточных контактов (см. рис. 3, в).

С помощью электронной микроскопии изучены ультраструктурные особенности ранних стадий акантолиза эпидермиса пациентов с мукозно-эпидермальной формой пузырчатки. Можно предположить, что начальным структурным маркером патоморфогенеза Р. vulgaris является расширение межклеточных пространств между интактными десмосомами в базальном слое, вслед за ним или синхронно — редукция, или недовоспроизводство тонофиламентов, участвующих в формировании десмосомной бляшки. При P. foliaceus ультраструктурные изменения эпидермоцитов аналогичны, изменены клетки трех нижних слоев, однако акантолиз развивается в шиповатом слое.

Pemphigus vulgaris — хроническое аутоиммунное интраэпителиальное пузырное (буллезное) заболевание с поражением кожи и слизистых оболочек, характеризующееся циркуляцией IgG-аутоантител к десмосомным кадгеринам Dsg3 и Dsg1. Однако патогенез пузырной трансформации, индуцируемой аутоантителами, остается предметом дискуссий. Предполагают, что прямое стерическое ингибирование адгезивных функций десмоглеинов приводит к акантолизу кератиноцитов путем расщепления десмосом. Альтернативная гипотеза предполагает, что акантолиз есть результат сложных внутриклеточных сигнальных путей, запускаемых присоединением пемфигусных IgG к десмоглеинам.

Исследования 70-х годов прошлого века и более недавние работы [14] в качестве самых первых изменений эпидермиса при пузырчатке указывали на расширение межклеточных пространств и растяжение десмосом без их видимой деструкции. Расширение межклеточных пространств как самое раннее событие акантолиза при пузырчатке согласуется с гипотезой, что аутоантитела разрушают трансадгезию путем стерического препятствия недесмосомальному Dsg3 [15]. Однако во всех ультраструктурных исследованиях не наблюдалось никаких ранних изменений в прикреплении десмосомных бляшек друг к другу. Также не обнаружена дезинтеграция десмосом на две части, что можно было ожидать в случае стерического затруднения адгезии десмоглеина в десмосомах. В отличие от этого, на наш взгляд, при пузырчатке дезинтеграция десмосом происходит за десмосомной бляшкой после того, как отсоединились кератиновые тонофиламенты.

Прогресс в области молекулярной биологии позволил идентифицировать все компоненты межклеточных контактов и обосновать десмоглеиновую концепцию патогенеза, однако это не привело к ожидаемым успехам в лечении, и при пузырчатке по-прежнему назначают системные кортикостероиды. Рекомендуют режимы лечения, включающие стероидные адъюванты, что позволяет снизить дозировку кортикостероидов. В большинстве случаев препараты применяют в течение 5—10 лет; однако имеются пациенты, которым необходимы как более короткие, так и более длинные курсы лечения. Сравнительно новым препаратом для лечения пузырчатки стал применяемый в гематологии ритуксимаб — химерное «человек—мышь» моноклональное антитело к CD20-антигену В-клеток (CD20 – мембранный белок, участвующий в их активации и пролиферации) [8]. Побочные эффекты при применении ритуксимаба могут быть значительными, но это сокращает общую продолжительность терапии.

В связи с относительной редкостью случаев Pemphigus рандомизированные контролируемые исследования немногочисленны, поэтому оценка эффективности того или иного лечения (типа препаратов и режимов их применения) затруднена. При этом своевременная диагностика и как можно более раннее начало лечения (до того, как заболевание становится слишком тяжелым, с большой площадью поражения) связаны с улучшенным прогнозом.

Первоначальное расширение межклеточных пространств в эпидермисе и документируемое электронно-микроскопически отсутствие полудесмосом при позитивном симптоме Никольского свидетельствует против стерической теории акантолизиса при пузырчатке. Расщепления в цитоплазме эпидермоцитов, а не в самих десмосомных бляшках могут отражать ведущую роль запускаемого наружной сигнализацией внутриклеточного каскада, приводящего к ослаблению связей между компонентами бляшки и цитоскелетом. Сведения о манифестации пузырчатки с расширения межклеточных пространств в эпидермисе, таким образом, возвращают к первым работам об этой патологии, когда высказывалось мнение, что Pemphigus не является исключительно «десмосомной» болезнью [16]. Это согласуется и с нашими ультраструктурными и радиоавтографическими исследованиями пузырчатки, по ряду структурно-функциональных особенностей эпидермоцитов трактуемыми с позиций патоморфологии как тяжелый первично-дистрофический процесс [17, 18]. По-видимому, необходима индукция внутриклеточной регенерации, вероятно, с помощью разрабатываемой генной терапии [19]. Дистрофически-атрофический фенотип свойствен и другим тканям, например эндометрию при привычном невынашивании беременности [20].

Наши давние представления об атрофии эпидермиса при пузырчатке, доказанные с помощью радиоавтографии in vitro [17, 18], перекликаются с «теорией усадки базальных клеток» [21], поддерживаемой также в работе [16]: «все больше доказательств в поддержку гипотезы о том, что причина акантолиза при пузырчатке – дезинтеграция и «сморщивание» базальных эпидермоцитов».

Редукция количества и размеров десмосом при P. vulgaris и P. foliaceus начинается в нижних слоях эпидермиса и распространяется в его верхние слои. Электронная микроскопия позволяет предположить нарушенную сборку десмосом, согласуется с компенсацией Dsg3 десмосом в нижних слоях при P. foliaceus. При этом уменьшение числа белоксинтезирующих органелл с недовоспроизводством элементов цитоскелета, участвующих в формировании десмосом, должно учитываться в концепции патогенеза истинной акантолитической пузырчатки.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: С.Г.Л., С.В.А.

Сбор и обработка материала: О.Б.Н., И.О.М., Т.Б.Р., В.В.О.

Статистическая обработка: Т.Б.Р.

Написание текста: С.В.А.

Редактирование: С.Г.Л.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Айдагулова Светлана Владимировна (Svetlana Aidagulova Researcher ID: H-4573-2013) — д-р биол. наук, проф., зав. лаб. клеточной биологии и фундаментальных основ репродукции Центральной научно-исследовательской лаборатории; e-mail: s.aydagulova@gmail.com; https://orcid.org/ 0000-0001-7124-1969