Желатиназы, А и В являются матриксными металлопротеиназами (ММП) — ММП 2, ММП 9, которые относятся к семейству цинковых кальций-зависимых металлопротеиназ. Функции этих ферментов связаны с метаболизмом белков соединительнотканного матрикса (СТМ) [1—4]. Желатиназы выполняют как деструктивные, так и регуляторные функции. Они гидролизуют коллаген IV типа — основу базальных мембран, а ММП 2 способна гидролизовать фибриллярные коллагены I и III типов. При этом происходит не только деструкция мембраны, но и высвобождение из нее эндотелиальных клеток, способных мигрировать и принимать участие в ангиогенезе, процессе, который наряду с деструкцией играет основную роль в прогрессии опухолей [4]. Желатиназы гидролизуют и другие компоненты СТМ, такие как эластин, аггрекан, адгезивные молекулы — ламинин, фибронектин, витронектин и др., а также модифицируют свойства и высвобождают из СТМ ряд биологически активных молекул, таких как факторы роста, цитокины и др., которые отвечают за регуляцию сигнальных путей, контролирующих процессы инвазии и ангиогенеза [4, 5]. ММП 9 считают основным «включателем» высвобождения из СТМ эндотелиального фактора роста (VEGF), который является основным индуктором ангиогенеза [4]. ММП 2 относится к конститутивным ферментам и может экспрессироваться в тканях независимо от индуцирующих агентов. ММП 9 является индуцируемым ферментом, экспрессия которого в нормальных тканях находится на очень низком уровне или отсутствует. Экспрессия его в ткани находится под контролем сигнальных путей и зависит от целого ряда агентов, индуцирующих экспрессию ММП, в частности онкогенов. Кроме того, экспрессия ММП в прилегающей к опухоли ткани стимулируется индуктором экспрессии ММП (EMMPRIN), находящимся на поверхности опухолевых клеток [6]. Активность ММП 2 и ММП 9 на посттрансляционном уровне зависит от наличия их тканевых активаторов и ингибиторов (ТИМП). Активатором ММП 9 является плазмин, который образуется в результате активации плазминогена с помощью уАП. Зимогены этих ММП могут обладать частичной активностью в результате их ступенчатой активации с участием активных форм ММП [2, 4, 5]. Основным игибитором ММП 2 и ММП 9 является ТИМП 2, который наряду с ММП 14 принимает участие в активации про-ММП 2.

Итак, ММП 2 и ММП 9 в результате ограниченного протеолиза высвобождают ряд биологически активных молекул, которые участвуют в регуляции сигнальных путей и способствуют экспрессии ММП как в опухоли, так и в нормальной ткани. В ряде случаев наблюдается высокая экспрессия ММП не только в опухоли, но и в строме и СТМ, причем на достаточно высоком уровне, иногда превосходящем опухолевую ткань [7, 8]. Это приводит к генерализации онкологического процесса.

Настоящее исследование посвящено изучению особенностей экспрессии важнейших ферментов инвазии, деструкции и ангиогенеза — желатиназ (ММП 2 и ММП 9) и их эндогенных регуляторов (ТИМП 2 и уАП) при плоскоклеточной карциноме шейки матки (ПКШМ) в теле матки, которое отличается по морфологическому строению от шейки матки. Рак шейки матки занимает второе место после рака молочной железы по частоте заболеваемости и смертности у женщин. Этиологическими факторами возникновения рака шейки матки служат вирусы папиллом (HPV) высокого риска, среди которых вирусы HPV16 и HPV18 являются наиболее распространенными и агрессивными [9]. Основные работы по исследованию экспрессии ММП проведены на клетках и клеточных линиях [10, 11]. В случае ПКШМ установлена корреляция экспрессии ММП 2 и ММП 9 в тканях опухоли и плазме крови со стадией заболевания, степенью дифференцировки, васкуляризацией и метастазированием в лимфатические узлы [12], а также получены данные об увеличении экспрессии этих ферментов и ТИМП-2 [13]. Данные, касающиеся экспрессии ММП и ингибиторов в морфологически нормальной ткани, окружающей опухоль, единичны. Есть работа, указывающая на то, что при ПКШМ стромальные клетки могут увеличивать прогрессию опухоли с помощью ММП 2 [7, 14]. По предварительным данным, полученным нами, наблюдается достаточно высокий уровень экспрессии ММП как в опухолевой, так и в нормальной, прилегающей к опухоли ткани [14].

Цель настоящего исследования — выяснение особенностей экспрессии ММП 2, ММП 9, их тканевого ингибитора ТИМП 2 и активатора про-ММП 9 уАП (через плазмин) в теле матки при ПКШМ. Эти сравнительные исследования позволяют оценить потенциал важнейших факторов инвазии, уровень их экспрессии и деструктивной активности в опухолевой и нормальной ткани матки, отличающейся по структуре от ткани шейки матки и находящейся вне зоны рака шейки матки. Подобные исследования ставят вопрос о дистанционной передаче сигналов в развитии процессов инвазии и метастазирования опухолей, например по эпителиально-мезенхимальному типу, с участием Hedgehog (Hh)-сигналинга и его роли в активации ММП.

В работе использован операционный материал, полученный после экстирпации матки у пациенток с диагнозом ПКШМ, получавших лечение в Московском научно-исследовательском онкологическом институте (МНИОИ) им. П.А. Герцена в 2010—2013 гг. Материал получен в патолого-анатомическом отделении МНИОИ им. П.А. Герцена. Согласие на использование материала для научных исследований получено от всех пациенток. Исследования проводили в соответствии с принципами, обозначенными в Хельсинкской декларации. В работе использовали образцы ПШКМ и прилегающей к опухоли морфологически нормальной ткани и тканевые «ленты», взятые на протяжении от стенки влагалища до дна полости матки, которые были разделены на фрагменты, заморожены немедленно и хранились в жидком азоте. Все случаи классифицированы по TNM клинической классификации опухолей в соответствии с требованиями Международного союза по борьбе с раком (UICC). Ткани были гистологически идентифицированы в патолого-анатомическом отделении МНИОИ им. П.А. Герцена. Все образцы карцином экспрессировали ген Е7 HPV16.

Иммуногистохимическую (ИГХ) реакцию проводили по стандартному методу [16] с некоторыми модификациями. Послеоперационный материал фиксировали 10% раствором нейтрального формалина в течение 24 ч, затем обезвоживали и пропитывали парафином в автоматизированном режиме в аппарате STP120. Срезы толщиной 4 мкм готовили на высокоадгезивных стеклах. Депарафинирование проводили по стандартной технологии. Восстановление антигенной активности проводили при температуре 97 °C в течение 20 мин в цитратном буфере (рН 6,0) или в стандартном ЭДТА-буфере, содержащем трис-HCl (рН 8,0), для соответствующих антител. Использовали моноклональные антитела к ММР 2, MMP 9 и TИМП-2 фирмы «LabVision» в готовом разведении. ИГХ-реакции проводили в автоматизированном режиме в иммуногистостейнере Avtosteiner («Dako», Дания). В качестве детекционной системы использовали систему Envision («Dako», Дания), в качестве хромогена — 3,3’-диаминобензидин. Затем срезы докрашивали гематоксилином. Микроскопирование проводили на микроскопе Leica Q 550 («Leica Microsystems», Германия). Учитывая выраженность реакции и ее локализацию, интенсивность реакции оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция, 2 — умеренная реакция, 3 — сильная реакция.

Исследование экспрессии генов ММП 2, ММП 9, уАП и ТИМП 2 проводили методом полуколичественной ОT-ПЦР. Выделение РНК проводили с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, Z 3100). Нормировку результатов осуществляли по уровню экспрессии генов домашнего хозяйства GAPDH (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы) и HPRT (гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы). В работе были использованы следующие праймеры (см. таблицу).

Для подбора специфических праймеров использованы данные GeneBank Nucleotide Sequence Database. Для оценки структуры праймеров применяли компьютерную программу Oligo 4.1 Primer Analysis Software. Продукты ОТ-ПЦР разделяли в 1,5% агарозном геле, содержащем бромид этидия 0,5 мкг/мл.

Методом зимографии определяли активность и спектр ММП 2 и ММП 9. Зимографию с сополимеризованным желатином проводили по модифицированному методу, описанному в работе [16]. Концентрация верхнего (концентрирующего) геля составляла 4%, нижнего (разделяющего) — 7,5%, концентрация желатина — 1,5 мг/мл. Пробы наносили из расчeта 50 мкг белка на лунку. Электрофоретический анализ проводили при температуре 9 °C в течение 1,5 ч. Гель промывали (3 раза по 30 мин) в буферном растворе, содержащем 50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 5 мМ СаСl₂, 2,5% тритон Х-100, после чего инкубировали в течение 20 ч при температуре 37 °C в этом же буферном растворе, но с пониженной до 1% концентрацией тритона Х-100. После инкубации гель фиксировали в смеси изопропанол : уксусная кислота : вода (5:2:13), окрашивали в течение 30 мин 0,1% Кумасси R 250 и отмывали в растворе изопропанол: уксусная кислота: вода (2:1:17). Денситометрический анализ зимограммы проводили с использованием программы ImageJ.

Активность уАП определяли по гидролизу Z-Gly-Gly-Arg-MCA [18]. Реакцию проводили в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 7,8. Опытная проба объемом 500 мкл содержала 20 мкг белка лизата, 20 мкл раствора субстрата (в конечной концентрации 4.10^-5 М). Гидролиз проводили при 37 °С в течение 5—20 мин, реакцию останавливали добавлением 0,05 М Na-ацетатного буфера рН 4,0. Флюоресценцию образовавшегося продукта гидролиза метилкумариламина (МСА) измеряли при длинах волн: 370 нМ (возбуждение) и 460 нМ (излучение). Активность выражали в пкМ продукта, высвобожденного за 1 мин в расчете на 1 мг белка.

Исследование спектра и активности ММП 2 и ММП 9 методом зимографии проводили на 8 тканевых «лентах», полученных при экстирпации матки при ПКШМ, образцы от стенки влагалища до дна полости матки были разделили на фрагменты длиной около 1 см и содержали от 4 до 6 фрагментов.

На рис. 1 представлены

Исследование экспрессии генов ММП 2, ММП 9, их тканевого ингибитора ТИМП 2 и активатора уАП также проводили на тканевых «лентах». На рис. 2 представлены

Исследование экспрессии уАП — активатора ММП 9 проведено на 6 тканевых «лентах». Полученные данные свидетельствуют о том, что активность фермента находилась на достаточно высоком уровне во всех образцах как опухолевой, так и нормальной ткани до дна полости матки (рис. 3).

Исследование уровня экспрессии ММП 2, ММП 9 и их тканевого ингибитора ТИМП-2 проведено ИГХ-методом на образцах ПКШМ и морфологически нормальных тканей, залитых в парафин. На рис. 4 представлены

ИГХ-исследование экспрессии ММП 2 (см. рис. 4) показало наличие яркой положительной реакции (2—3 балла) в клетках опухоли (см. рис. 4, образцы 1—3). В строме опухоли и морфологически нормальной ткани положительная реакция была достаточно выражена (см. рис. 4, фрагмент 4 с отсутствием опухоли). Для экспрессии ММП 9 характерно наличие выраженной позитивной реакции (2—3 балла) и в клетках опухоли и строме, при этом более выраженная интенсивность реакции отмечена в опухоли по сравнению со стромой. Во фрагментах образцов, где опухоль отсутствовала, наблюдалось окрашивание меньшей интенсивности, чем в опухоли (см. рис. 4, фрагмент 4). ТИМП 2 иммуногистохимически был выявлен не во всех образцах как в опухоли, так и в строме. Распределение выявленной на образцах, залитых в парафин, ИГХ-экспрессии ММП 2, ММП 9 в целом совпадает с данными, касающимися экспрессии генов и ферментативной активности, полученными на замороженном материале тканевых «лент». Исключение составляют данные по экспрессии ТИМП 2, которые в случае ИГХ-исследований на образцах, залитых в парафин, также согласуются с результатами по генной экспрессии. Однако, как правило, по данным, полученным ранее, в тканевых «лентах» [17] обнаруживали слабое присутствие или отсутствие ТИМП 2, а данные ОТ-ПЦР свидетельствовали о выраженном наличии ТИМП 2 в тех же образцах. Это расхождение в результатах только за счет чувствительности методов в настоящее время объяснить достоверно не представляется возможным. Подобные расхождения отмечают и другие авторы [18].

Полученные данные по экспрессии ММП 2 и ММП 9 в теле матки при ПКШМ в основном согласуются с результатами наших ранних исследований экспрессии этих ферментов в фибробластах, трансформированных Е7-онкогеном HPV16 [19], а также на коммерческих клеточных линиях ПКШМ [20] и на клиническом материале [20]. Полученные в этих работах результаты свидетельствуют о том, что основной вклад в инвазивный (деструктивный) потенциал ПКШМ вносят высокая экспрессия ММП 9 и активность ММП 2, изменяющаяся в меньшей степени, но находящаяся на достаточно высоком уровне. Экспрессия ТИМП 2, исследованная с помощью ИГХ-метода, была на низком уровне или отсутствовала. ТИМП 2 выполняет двойную функцию. Он не только ингибирует ММП, но и принимает участие в активации зимогена про-ММП 2. В морфологически нормальной ткани, прилегающей к опухоли, также обнаружена экспрессия ММП 2 и ММП 9, которая вносит дополнительный вклад в инвазивный потенциал опухоли. Данные по экспрессии ММП 2 и ММП 9 в тканях, имеющиеся в литературе, достаточно противоречивы. Некоторые исследователи показали отсутствие корреляции в развитии инвазивного процесса и метастазов с экспрессией ММП 2 и ТИМП 2. Другие авторы обнаружили высокую экспрессию ММП 9 и ММП 2 в тканях карцином шейки матки разной степени дифференцировки [12, 13, 18].

Экспрессия желатиназ ММП 2, ММП 9 и регуляторов их активности направлена на увеличение деструктивного (инвазивный) потенциала опухоли и может происходить (индуцироваться) в нормальной ткани тела матки, морфологически отличающейся от ткани шейки матки, по-видимому, с участием сигналинга по эпителиально-мезенхимальному типу взаимодействия. Индуцируемая в теле матки ММП 9 может служить маркером инвазивного потенциала. Экспрессия ММП 2 и ММП 9 как факторов инвазии в различных случаях ПКШМ может существенно различаться и иметь прогностическое значение, поэтому важно определять уровень ММП не только в опухоли, но и в окружающей опухоль нормальной ткани. Нарушение регуляции экспрессии этих ферментов происходит не только на генном, но и на посттрансляционном уровне, а их повышенная экспрессия направлена на развитие инвазивного потенциала. Данные указывают на различные функции ММП 2 и ММП 9 в тканях. Они важны для понимания роли желатиназ ММП 2, ММП 9 в процессе канцерогенеза, могут иметь прогностическое значение и влиять на терапевтическую стратегию в отношении пациента.

Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013—2020 гг.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Сбор и обработка материала — О.С.Т., Т.А.Г. Е.В.К., Л.Э.З.

Статистическая обработка данных — О.С.Т., Т.А.Г., Е.В.К.

Написание текста — Н.И.С., О.С.Т., Л.Э.З.

Редактирование — Н.И.С., Л.Э.З., Ю.Ю.А.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Сведения об авторах

Соловьева Нина Ивановна — e-mail: Nina.Solovyeva@ibmc.msk.ru; https://orcid.org//0000-0002-6254-8528