Апоптоз представляет собой генетически запрограммированный механизм клеточной смерти, незаменимый в индивидуальном развитии и поддержании тканевого гомеостаза у многоклеточных организмов. Среди сложных механизмов активации апоптоза выделяют два основных: внешний и митохондриальный. Первый из них активируется при взаимодействии мембранных «рецепторов смерти» с определенными проапоптотическими лигандами. Активация митохондриального пути связана с выходом из межмембранного пространства митохондрий цитохрома С [1, 2]. Способность раковых клеток избегать запрограммированной гибели является важным механизмом опухолевой прогрессии, который резко увеличивает жизнеспособность опухолевых клеток и ведет к значительному повышению вероятности метастазирования [3]. Так, при изучении колоректального рака (КРР) получены данные о срыве механизмов апоптоза при развитии как первичной опухоли, так и ее метастазов [4, 5], а также о роли некоторых антиапоптотических белков в регуляции миграции и инвазии клеток колоректального рака in vitro [6].

Значительную роль в процессе апоптоза играют белки-каспазы, представляющие собой цистеиновые протеазы. Синтез каспаз происходит практически во всех клетках в виде проферментов, активация которых имеет место при апоптозе. У млекопитающих в семейство каспаз входят 14 белков. Из них в апоптозе участвуют, по одним данным, 13, по другим — 9. В настоящее время общепринята концепция о каспазном каскаде, согласно которой при апоптозе происходит сначала активация одной из инициаторных каспаз (8, 9, 10), которая впоследствии активирует эффекторные прокаспазы (3, 6, 7). Затем активированные эффекторные каспазы ингибируют биосинтез белков и активируют ДНКазу [1, 7, 8].

Многие ключевые этапы активации апоптоза связаны с белком р53. Так, данный белок активирует транскрипцию генов проапоптотических факторов и тормозит транскрипцию генов антиапоптотических факторов, стимулирует «рецепторы смерти», опосредованно стимулирует выход цитохрома С из митохондрий, может вызывать апоптоз за счет взаимодействия с проапоптотическими белками [1, 2]. Однако известно, что в тканях опухолей человека часто возникают мутации гена р53, что приводит к синтезу мутантного белка р53, который не только не обладает проапоптотическими свойствами, но и может способствовать опухолевому развитию [7, 9]. По результатам одного из исследований, выполненного на биопсийном материале, при КРР частота развития мутаций в гене р53 в первичной опухоли достигала 37%, в метастазах в лимфатических узлах — 34%, в метастазах в печени — 41% [10].

Модификация активности р53 сопровождается снятием р53-зависимой супрессии гена, кодирующего ингибитор апоптоза сурвивин [2]. Данный белок входит в состав семейства белков-ингибиторов апоптоза и имеет две основные функции: ингибитора апоптоза и регулятора митоза. Ингибирование апоптоза происходит за счет прямого или опосредованного подавления активности каспаз (3, 7, 9). Благодаря своим функциям сурвивин принимает участие в таких процессах, как эмбриональное развитие, гемопоэз, сперматогенез, регенерация клеток печени и эпителия желудочно-кишечного тракта. Тем не менее в дифференцированных тканях взрослых людей он выявляется на очень низком уровне либо не выявляется. В высокой степени данный белок экспрессируют эмбриональные ткани, а также большинство опухолей человека [11—13].

При лечении КРР используют цитотоксические химиотерапевтические схемы (FOLFOX, FOLFIRI и др.), а также их сочетание с таргетными противоопухолевыми препаратами. Одним из таргетных препаратов, применяемых в лечении КРР, является бевацизумаб, представляющий собой моноклональные антитела к фактору роста эндотелия сосудов, А (анти-VEGF). В нашей предыдущей работе выявлено, что эффективность цитотоксических препаратов при лечении метастазов КРР в печени связана с тем, что они активируют апоптоз опухолевых клеток, достоверно увеличивая экспрессию активатора апоптоза Bax и снижая содержание ингибитора апоптоза Bcl-2, а добавление таргетного анти-VEGF-препарата приводит к усилению апоптоза за счет увеличения экспрессии индуктора апоптоза PML [14]. По данным исследований, выполненных на культурах клеток КРР с применением проточной цитометрии, а также определением экспрессии каспазы 3 методом западного блоттинга, было показано, что добавление бевацизумаба к стандартным цитотоксическим схемам терапии приводит к активации апоптоза [15, 16].

Тем не менее влияние различных режимов лекарственной терапии на процесс апоптоза и уровень экспрессии проапоптотических и антиапоптотических факторов при метастатическом КРР остается малоизученным. В связи с этим мы провели исследование экспрессии участвующих в апоптозе каспаз 3 и 7, р53 и сурвивина в метастазах колоректальных аденокарцином в печени в группах пациентов, получавших предоперационную терапию по цитотоксическим схемам, а также при сочетании данных схем с таргетным анти-VEGF-препаратом.

Исследование проведено на операционном материале метастазов КРР в печени, полученном от 122 пациентов, оперированных в РНЦХ им. акад. Б.В. Петровского в период с 2008 по 2014 г. Из них 51 пациент (22 мужчины, 29 женщин; возраст от 27 до 78 лет, медиана возраста 57 лет) получал предоперационную химиотерапию в качестве первой линии в режиме FOLFOX6 (оксалиплатин, лейковорин, 5-фторурацил) либо FOLFIRI (иринотекан, лейковорин, 5-фторурацил). 18 пациентов (10 мужчин, 8 женщин; возраст от 47 до 73 лет, медиана возраста 59,5 года) получали сочетанную предоперационную терапию по схемам FOLFOX6 + бевацизумаб, FOLOFIRI + бевацизумаб. В группу сравнения вошли 50 пациентов с метастазами в печени (29 мужчин, 21 женщина; возраст от 47 до 76 лет, медиана возраста 60 лет), которым химиотерапия не проводилась.

Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,4), осуществляли проводку на гистопроцессоре и заливали в парафин. Для гистологического и ИГХ-исследования изготавливали срезы толщиной 3—4 мкм. Депарафинирование и ИГХ-исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica») c первичными антителами к каспазе 3 («Abcam», клон 3CSP03; разведение 1:100), каспазе 7 («Abcam», клон 7−1-11; разведение 1:100), р53 («Dako», клон DO-7; разведение 1:300) и сурвивину («Dako»; клон 12С4; разведение 1:150).

Препараты исследовали с помощью световой микроскопии. Экспрессия p53 и сурвивина локализовалась в ядрах опухолевых клеток и оценивалась как выраженная (++) при окрашивании более 50% ядер опухолевых клеток, слабая (+) при окрашивании 10—50% ядер, отрицательная (–) при окраске менее 10% ядер и полном отсутствии окраски. Экспрессия каспаз 3 и 7 определялась в цитоплазме опухолевых клеток и оценивалась следующим образом: (+++) — выраженная, (++) — умеренная, (+) — слабая, (–) — отсутствие. Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Результаты исследования проанализированы с использованием программы Statistica 8.0. Сравнительный анализ выполнен методом Пирсона χ², точным методом Фишера. Статистическую значимость принимали при p<0,05.

По результатам ИГХ-исследования выявлено повышение экспрессии маркера апоптоза каспазы 3 у пациентов, получавших цитотоксическую терапию в сочетании с таргетным анти-VEGF-препаратом. В группе пациентов, получавших предоперационную терапию бевацизумабом, экспрессия каспазы 3 наблюдалась в 15 (83,5%) случаях, из них у 7 (39%) пациентов низкая степень экспрессии, у 5 (28%) умеренная, и у 3 (16,5%) высокая степень экспрессии (табл. 1). В группе пациентов, леченных только цитотоксическими препаратами, экспрессия каспазы 3 выявлена в 13 (26%) случаях, причем у 10 (20%) больных отмечена низкая экспрессия, у 2 (4%) — умеренная и у 1 (2%) — высокая. В группе сравнения положительная иммунопероксидазная реакция при исследовании каспазы 3 выявлена у 18 (36%) человек, из которых 17 (34%) случаев с низким и 1 (2%) с умеренным содержанием белка. Случаев с высокой степенью экспрессии в контрольной группе отмечено не было.

Таким образом, экспрессия каспазы 3 достоверно чаще выявлялась у пациентов, получавших сочетанную терапию цитотоксическими препаратами и бевацизумабом (см. рисунок, а), как по сравнению с группой пациентов, леченных только по цитотоксическим схемам, так и с теми, кто не получал предоперационную противоопухолевую терапию (р 0,00004 и 0,0008 соответственно), причем и у мужчин (р 0,008 и 0,03 соответственно), и у женщин (р 0,02 и 0,014 соответственно). Частота встречаемости умеренной и высокой степени экспрессии каспазы 3 также достоверно выше в группе пациентов, леченных анти-VEGF-препаратом, по сравнению с контрольной группой (р=0,004), но не с группой пациентов, получавших только цитотоксические препараты (р=0,11), хотя и в данном случае отмечена схожая тенденция. Статистически достоверных различий в экспрессии каспазы 3 между группой пациентов, леченных цитотоксическими препаратами, и контрольной группой не выявлено (р=0,29; у мужчин р=0,55, у женщин р=0,53).

Изучение экспрессии каспазы 7 не выявило достоверных различий между тремя группами. Так, в группе пациентов, не получавших предоперационную противоопухолевую терапию, экспрессия каспазы 7 наблюдалась у 18 (36%) пациентов; в группе леченных только цитотоксическими препаратами — у 21 (41%) пациента; в группе получавших сочетанную терапию экспрессия каспазы 7 выявлена у 9 (50%) (см. табл. 1, рисунок, б, в). Следовательно, прослеживается определенная тенденция к увеличению частоты экспрессии каспазы 7 в зависимости от наличия и характера противоопухолевой терапии, однако считать полученные данные статистически достоверными нельзя (р>0,05). При этом следует отметить, что ни в одном случае не было выявлено выраженной (+++) экспрессии каспазы 7, а в группе пациентов, леченных анти-VEGF-препаратом, все случаи наличия экспрессии данного белка отличались слабой степенью экспрессии.

При исследовании экспрессии р53 также не было выявлено статистически достоверных различий между группами. В группе не получавших противоопухолевую терапию экспрессия данного белка наблюдалась у 39 (78%) пациентов; в группе получавших цитотоксическую терапию — у 45 (88%) пациентов; в группе леченных с добавлением анти-VEGF-препарата наличие экспрессии р53 наблюдалось у 17 (94,4%) (табл. 2, рисунок, е). Таким образом, также отмечено увеличение доли пациентов с экспрессией данного белка в зависимости от наличия и характера противоопухолевой терапии, но полученные данные не являются статистически достоверными (р>0,05).

Исследование сурвивина в группе пациентов, получавших цитотоксическую предоперационную терапию, выявило отсутствие экспрессии у 10 (19%; 2 мужчины, 8 женщин) пациентов, у 35 (69%; 15 мужчин, 20 женщин) имелась слабая экспрессия сурвивина; в 6 (12%; 5 мужчин, 1 женщина) случаях наблюдалась выраженная экспрессия (см. табл. 2, рисунок, г, д). В группе пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию, не наблюдалось случаев отсутствия экспрессии сурвивина; у 12 (67%; 7 мужчин, 5 женщин) пациентов выявлена слабая экспрессия, в 6 (33%; 3 мужчины, 3 женщины) — выраженная экспрессия. В группе сравнения сурвивин не выявлялся у 2 (4%) человек, причем в обоих случаях у мужчин; у 36 (72%; 19 мужчин, 17 женщин) больных имелась слабая экспрессия; у 12 (24%; 8 мужчин, 4 женщины) — выраженная. Таким образом, выявлено достоверно более частое отсутствие экспрессии данного белка у женщин в группе пациентов, получавших цитотоксическую терапию, по сравнению с контрольной группой (р=0,015). При этом статистически достоверного различия экспрессии сурвивина у мужчин в данных группах не выявлено. Сравнение группы пациентов, леченных цитотоксическими препаратами, с группой получавших сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию выявило схожие изменения, но различия не достигли статистической значимости (р=0,16 для женщин, р=1 для мужчин). Однако обнаружено, что в группе, получавшей цитотоксическую терапию, частота слабой экспрессии сурвивина у женщин выше, чем в группе, получавших сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию (результаты близки к достоверным; р=0,052). Статистически достоверных различий между группой пациентов, получавших сочетанную терапию, и контрольной группой не выявлено ни у мужчин, ни у женщин.

Полученные данные о повышении степени экспрессии эффекторной каспазы 3 при применении комбинированной цитотоксической и анти-VEGF-предоперационной терапии свидетельствуют об активации апоптоза в клетках КРР за счет повышения содержания данного белка, что согласуется с результатами исследований, проведенных на культурах клеток [15, 16], где также отмечено повышение активности каспазы 3 с последующим развитием апоптоза. По мнению M. Selvakumaran и соавт., в данном случае имеет место апоптоз, вызванный гипоксией [16]. Выявленное нами увеличение частоты экспрессии каспазы 7 при проведении цитотоксической терапии, а также ее сочетании с таргетной анти-VEGF-терапией не достигло статистической значимости, что, возможно, обусловлено недостаточной выборкой пациентов в проведенном исследовании.

Применение стандартных цитотоксических химиотерапевтических схем приводило к достоверной активации апоптоза за счет снижения экспрессии антиапоптотического белка сурвивина (у женщин). Кроме того, есть основания ожидать достоверно более низкой степени экспрессии сурвивина у женщин в группе пациентов, леченных только цитотоксическими препаратами, по сравнению с группой пациентов, получавших сочетанную цитотоксическую и анти-VEGF-терапию при наличии более широкой выборки. Отличия в экспрессии данного маркера при разделении групп по полу выявлены и в работах других авторов [11], однако объяснений этому явлению пока не найдено.

Нами проведен анализ соотношения экспрессии проапоптотического белка каспазы 3 и подавляющего его активность антиапоптотического белка сурвивина, а также каспазы 7 и сурвивина. Для этого больные были разделены на 4 группы на основании иммуногистохимических особенностей реакции с антителами к каспазе 3 (или каспазе 7) и сурвивину: каспаза 3 (–)/сурвивин (–), каспаза 3 (–)/сурвивин (+), каспаза 3 (+)/сурвивин (–), каспаза 3 (+)/сурвивин (+) (табл. 3). Анализ соотношения экспрессии каспазы 7 и сурвивина статистически значимых различий между группами не показал.

Отсутствие эффекторной каспазы 3 при наличии экспрессии ингибитора апоптоза сурвивина показано у одинакового количества больных из группы, получавшей лечение по цитотоксическим схемам, и группы сравнения — по 30 человек (по 60%). При добавлении к терапии бевацизумаба число таких пациентов снизилось до 17%, а одновременная экспрессия обоих белков (каспаза 3 (+)/сурвивин (+)) наблюдалась в 83% случаев (15 человек, из них 8 мужчин, 7 женщин). В группе получавших только цитотоксическую терапию соотношение каспаза 3 (+)/сурвивин (+) выявлено в 23% (12 человек, из них 5 мужчин, 7 женщин) случаев; в контрольной группе — в 36% (18 человек, из них 11 мужчин, 7 женщин).

Таким образом, у пациентов, получавших комбинированную терапию, достоверно чаще наблюдалась одновременная экспрессия обоих белков как по сравнению с контрольной группой (р=0,0008), так и с группой пациентов, леченных только цитотоксическими препаратами (р=0,0001), причем и у мужчин, и у женщин. Полученные данные свидетельствуют о влиянии бевацизумаба на активацию апоптоза опухолевых клеток, сопряженного с экспрессией проапоптотической каспазы 3 и антиапоптотического белка сурвивина, что подтверждается значительным снижением доли пациентов с отсутствием каспазы 3 при наличии сурвивина.

Полученные в нашем исследовании данные позволяют говорить о том, что добавление бевацизумаба к стандартным цитотоксическим схемам предоперационной терапии метастатического КРР приводит к активации апоптоза за счет усиления экспрессии эффекторной каспазы 3, а также к снижению доли пациентов с отсутствием каспазы 3 при наличии экспрессии ее ингибитора сурвивина. По результатам исследования экспрессии сурвивина можно сделать вывод об активации апоптоза у женщин при использовании стандартных цитотоксических химиотерапевтических схем за счет снижения экспрессии данного антиапоптотического белка.

Работа выполнена в рамках проекта, поддержанного Российским фондом фундаментальных исследований, № 14−04−00844.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.М.П., О.Г.С.

Сбор и обработка материала: А.В.В., Е.М.П., М.И.С., Д.Н.Ф., О.Г.С.

Статистическая обработка: А.В.В.

Написание текста статьи: А.В.В., Е.М.П., М.И.С.

Редактирование: Е.М.П.

Конфликт интересов отсутствует.