Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) характеризуются развитием хронического рецидивирующего воспаления и включают две нозологические формы: болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК). Этиология и патогенез этой группы заболеваний все еще остаются неясными. В случаях, когда провести дифференциальный диагноз между БК и ЯК не представляется возможным, ставят диагноз неопределенного или неклассифицируемого колита (НК) у больного с ВЗК. Полагают, что причиной ВЗК является патологическая реакция иммунной системы в ответ на воздействие микроорганизмов на слизистую оболочку кишечника у генетически предрасположенных лиц [1]. В патогенезе ВЗК обсуждаются значение нейроэндокринно-иммунных взаимодействий и нарушения регуляторной деятельности диффузной эндокринной системы кишечника, в частности была показана роль соматостатина как одного из нейропептидов с противовоспалительным действием [2—4].

Цель исследования — изучение экспрессии рецепторов к соматостатину (РС) в клетках слизистой оболочки подвздошной кишки при БК и НК по сравнению с неизмененной слизистой оболочкой. В исследование не были включены больные с диагнозом ЯК в связи с особенностями взятия материала для морфологического исследования из наиболее пораженных дистальных отделов толстой кишки у пациентов с ЯК.

Изучены биоптаты подвздошной кишки 42 больных, из них у 16 была клинико-морфологически подтвержденная БК, а у 14 провести дифференциальный диагноз между БК и ЯК на момент исследования не представлялось возможным, в результате чего был поставлен диагноз НК. В качестве группы сравнения исследованы биоптаты 12 пациентов без ВЗК с неизмененной слизистой оболочкой подвздошной кишки (данным пациентам была проведена колоноскопия для исключения воспалительного процесса или опухоли). Возраст больных колебался от 22 до 55 лет (средний — 38±6 года). Ни один из пациентов до проведения эндоскопического исследования не проходил лечение по поводу ВЗК. В каждом наблюдении исследовали в среднем три биоптата из наиболее пораженных участков подвздошной кишки.

После рутинного гистологического исследования биоптатов проводили ИГХ-реакцию с использованием аппарата для автоматического окрашивания Bond («Leica Biosystems», Германия) и моноклональных кроличьих антител к РС 2-го типа (Somatostatin receptor type 2, клон EPR3507, разведение 1:200, «Epitomics», США). Также проведено ИГХ-исследование серийных срезов илеобиоптатов с антителами к хромогранину, А (NCL-CHROM-430, клон 5H7, разведение 1:200, «Leica Biosystems», Германия) для оценки изменений нейроэндокринной системы подвздошной кишки и антителами к CD3 (NCL-L-CD3−565, клон LN10, разведение 1:500, «Leica Biosystems», Германия) — маркеру, специфичному для всех субпопуляций Т-лимфоцитов.

Среди отсканированных на слайд-сканере Aperio AT2 («Leica Biosystems», Германия) препаратов отбирали слайд-сканы для последующего количественного подсчета РС-2 позитивно окрашенных клеток. Полученные цифровые изображения также позволили провести сопоставление изображений и выполнить измерения размера клеток и структур слизистой оболочки с помощью программы Aperio Imagescope («Leica Biosystems», Германия). Среднее количество областей, выбранных для подсчета позитивно окрашенных клеток, обнаруживаемых среди клеток эпителия ворсин в каждом из биоптатов, составило 10. Помимо общего числа РС-2-позитивных клеток, проводили подсчет клеток в зависимости от особенностей окрашивания. Пересчет полученных результатов проводили на 100 эпителиальных клеток, покрывающих поверхность ворсин слизистой оболочки.

Полученные данные обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0. Для статистического анализа применяли непараметрические методы. Статистическую достоверность полученных результатов определяли с помощью двустороннего критерия Манна—Уитни. Средние значения представляли в виде медианы (М) и интерквартильного размаха (ИК). Различия считали достоверными при p<0,05. Полученные с использованием этого метода данные представляли в виде диаграмм размаха, на которых показаны медиана, границы 1-го и 3-го квартилей и 9-й и 91-й процентили.

Результаты проведенного исследования показали, что клетки, позитивно окрашенные антителами к РС 2-го типа, локализовались преимущественно на поверхности ворсин, а также в криптах (рис. 1). Кроме того, позитивно окрашенные клетки выявлены в собственной пластинке слизистой оболочки среди клеток инфильтрата, при этом они располагались в основном одиночно или образуя небольшие скопления (рис. 2). Отмечалось позитивное окрашивание центров лимфоидных фолликулов в виде сети и ганглиозных клеток подслизистого слоя, если они обнаруживались в биоптате (рис. 3, 4).

Подсчет всех клеток, позитивно окрашенных антителами к РС 2-го типа на 100 эпителиоцитов слизистой оболочки, покрывающих поверхность ворсин, продемонстрировал, что при БК число таких клеток колебалось от 3 до 29 (М=11, ИК=8). При Н.К. их количество составило от 2 до 19 (М=5, ИК=3), а в группе сравнения — от 2 до 29 (М=8, ИК=5,5) (рис. 5). Следовательно, медиана числа клеток с РС 2-го типа уменьшалась в ряду БК—норма—Н.К. При статистическом сравнении полученных данных различия в группах оказались достоверными (р<0,05). Большинство проведенных ранее исследований было направлено на анализ клеток, продуцирующих соматостатин, а не экспрессирующих РС [2, 4]. В этих работах было выявлено, что при ВЗК, особенно у больных с ЯК, значительно уменьшается число соматостатинсодержащих клеток преимущественно в дистальных отделах ободочной кишки. Подобных различий между БК и неизмененной слизистой оболочкой обнаружено не было [2].

При более детальном изучении препаратов, полученных в результате ИГХ-исследования, отмечены различия в форме и размерах позитивно окрашенных клеток, а также характере экспрессии РС 2-го типа.

В первую очередь обращала на себя внимание разная форма позитивно окрашенных клеток, большинство из которых имело цилиндрическую или кубическую форму (диаметр этих клеток равен в среднем 12±4 мкм). Второй тип представлен клетками вытянутой неправильной или треугольной формы (средний диаметр 20±5 мкм). Третий тип клеток отличался округлой формой и средним диаметром 4±2 мкм.

Выделено три варианта экспрессии РС 2-го типа: преимущественно мембранная, цитоплазматическая и смешанная, мембранно-цитоплазматическая. Для первого варианта характерны подчеркнутый контур мембраны клетки и отсутствие окрашивания цитоплазмы, при втором — интенсивность экспрессии настолько выражена, что вся клетка вместе с ее мембраной приобретает равномерную и однородную интенсивную коричневую окраску. Третий отличался окрашиванием цитоплазмы с подчеркнуто интенсивно окрашенной мембраной клетки (см. рис. 1).

Подсчет позитивно окрашенных клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа показал, что медиана этого показателя при БК составила 1 (М=1, ИК=0,5), при НК — 3 (М=3, ИК=2,5), а в группе сравнения — 2 (М=2, ИК=2) (рис. 6). Следовательно, медиана числа клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа уменьшалась в ряду НК—норма—БК (р<0,05), при этом общее число клеток, позитивно окрашенных с антителами к РС 2-го типа, при НК оказалось наименьшим, а при БК — наибольшим. Согласно проведенному исследованию с антителами к хромогранину, А (универсальный маркер нейроэндокринных клеток), при ВЗК число таких клеток также было наибольшим при НК (М=15, ИК=6) и превышало данный показатель при БК (М=13, ИК=5) (р<0,05).

Для того чтобы показать, что клетки с мембранной экспрессией РС 2-го типа являются нейроэндокринными, проведено сравнение их локализации с клетками, окрашенными антителами к хромогранину, А с помощью отсканированных изображений серийных срезов тех же биоптатов. На полученных цифровых изображениях локализация клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа совпала с нейроэндокринными клетками, положительно окрашенными антителами к хромогранину А. Однако количество клеток с мембранной экспрессией РС 2-го типа оказалось значительно меньшим, чем общее число всех хромогранин А-позитивных клеток. Полученные результаты объясняются тем, что хромогранин, А является универсальным маркером для нейроэндокринных клеток, которые участвуют в синтезе не только соматостатина, но и других нейропептидов.

При втором варианте окрашивания обнаружено, что количество клеток с цитоплазматической экспрессией РС 2-го типа при БК составило от 1 до 3 (М=1, ИК=2), минимальное и максимальное количество подобным образом окрашенных клеток при НК — от 1 до 7 (М=3, ИК=2). В неизмененной слизистой оболочке количество этих клеток составило от 1 до 3 (М=2, ИК=1), таким образом, данный показатель оказался максимальным при НК, меньше — в неизмененной слизистой оболочке и еще меньше — при БК (р<0,05) (рис. 7). Клетки с таким окрашиванием по своей форме преимущественно мелкие и округлые, со средним диаметром 4±2 мкм. Учитывая особенности морфологии позитивно окрашенных клеток по цитоплазматическому типу и их наибольшее число при НК, можно предположить, что они представляют собой иммунные клетки, в частности лимфоциты. Для подтверждения данной гипотезы проведено сравнение цифровых изображений серийных срезов препаратов, окрашенных с использованием антител к РС 2-го типа, с препаратами, окрашенными с применением антител к CD3 для выявления интраэпителиальных Т-лимфоцитов. При этом наблюдалось совпадение окрашенных клеток по локализации. В дополнение к этому наибольшее число CD3⁺-клеток также наблюдалось при НК по сравнению с Б.К. Таким образом, цитоплазматически окрашенные, расположенные среди эпителия темные мелкие клетки скорее всего представляют собой Т-лимфоциты, мигрирующие из стромы к поверхности подвздошной кишки. Учитывая особенности влияния соматостатина на иммунные клетки в виде торможения их пролиферации и синтеза ими провоспалительных цитокинов [5], можно предположить, что экспрессия РС 2-го типа лимфоцитами играет роль в подавлении воспалительного процесса. При Б.К. нарушается нейрогуморально-иммунная регуляция воспаления, о чем свидетельствует уменьшение экспрессии РС 2-го типа на мембране иммунных клеток-эффекторов. Как следствие снижается противовоспалительный эффект соматостатина, повышается пролиферация лимфоцитов и продукция ими провоспалительных медиаторов, которая поддерживает воспалительный процесс.

Большинство клеток отличалось смешанной, мембранно-цитоплазматической, экспрессией РС 2-го типа. При Б.К. подобное окрашивание наблюдалось среди клеток в количестве от 1 до 12 (М=5, ИК=4), при НК оно составило от 1 до 11 (М=2, ИК=3). В неизмененной слизистой оболочке число этих клеток колебалось от 1 до 5 (М=3, ИК=2). Таким образом, количество позитивно окрашенных таким образом клеток максимально при БК, меньше в неизмененной слизистой оболочке и еще меньше при НК (рис. 8). Такое распределение характерно и для всех клеток, экспрессировавших РС 2-го типа. По своей форме большинство клеток со смешанной экспрессией РС 2-го типа представляло собой кубические или цилиндрические, мало отличающиеся от окружающих энтероцитов, однако среди них встречались клетки треугольной или неправильной формы. В результате сравнения отсканированных цифровых изображений серийных срезов обнаружено, что некоторые клетки с мембранно-цитоплазматической экспрессией РС 2-го типа совпали по локализации и форме с хромогранин-А-позитивными клетками. Это указывает на возможность окрашивания нейроэндокринных клеток не только по мембранному, но и по смешанному варианту. Согласно механизму интернализации [7], эти нейроэндокринные клетки являются, по-видимому, клетками, в которых РС уже связались со своим агонистом соматостатином. Большее число клеток с таким окрашиванием наблюдается при БК, тогда как количество мембранно-окрашенных клеток (нейроэндокринные клетки, РС которых не связаны с соматостатином) при БК наименьшее. Полученные результаты ставят под сомнение целесообразность лечения пациентов с БК аналогами соматостатина [8], так как количество клеток, которые смогут прореагировать с его агонистами, при этом заболевании наименьшее.

Большое число клеток с мебранно-цитоплазматическим окрашиванием при реакции с антителами к РС 2-го типа не совпало по локализации и форме с хромогранин-А-позитивными нейроэндокринными клетками. Такие клетки отличались правильной призматической формой, такой же, как и соседние энтероциты. По-видимому, они и являются энтероцитами с РС 2-го типа. Действия соматостатина многогранны и, помимо действия как противовоспалительного нейромедиатора на клетки иммунной и нейроэндокринной систем, он также способен тормозить пролиферацию клеток, в том числе и энтероцитов, подавлять регенерацию поверхностного эпителия, способствовать его дифференцировке и созреванию [9, 10].

Таким образом, в слизистой оболочке подвздошной кишки общее число клеток, экспрессирующих РС 2-го типа, уменьшается в ряду БК — неизмененная слизистая оболочка — Н.К. Выявлено три варианта экспрессии РС 2-го типа — преимущественно мембранная, цитоплазматическая и смешанная, мембранно-цитоплазматическая. Число клеток с мембранным окрашиванием уменьшается в ряду НК — неизмененная слизистая оболочка — БК; с цитоплазматическим и мембранно-цитоплазматическим — в ряду БК — неизмененная слизистая оболочка — НК. По-видимому, клетки с мембранным типом экспрессии РС 2-го типа являются нейроэндокринными, с цитоплазматическим — интраэпителиальными Т-лимфоцитами, с мембранно-цитоплазматическим — как нейроэндокринными, так и эпителиальными. Проведенное исследование подтверждает, что патогенез ВЗК связан с нарушением нейроэндокринно-иммунного взаимодействия. Анализировать нарушения нейроэндокринной и иммунной систем необходимо не изолированно друг от друга, а комплексно. Начальные изменения нейропептидной регуляции скорее всего представляют собой защитный механизм в ответ на повреждение. Однако дальнейшие изменения могут способствовать возникновению и поддержанию хронического воспалительного процесса.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: А.С.Т., Х.М.А., О.В.З.

Сбор и обработка материала: Л.С.С., Т.М.Б.

Статистическая обработка данных: Л.С.С.

Написание текста: Т.М.Б., Х.М.А.

Редактирование: О.В.З.

Конфликт интересов отсутствует.