Экспрессия компонентов системы активатора плазминогена в слизистой оболочке желудка при портальной гипертензионной гастропатии

Портальная гипертензионная гастропатия (ПГГ) развивается при портальной гипертензии (ПГ) и характеризуется изменениями слизистой оболочки желудка. ПГГ является серьезной клинической проблемой, так как может осложняться острыми или хроническими желудочными кровотечениями, приводящими в свою очередь к анемии. Острые кровотечения при ПГГ наблюдаются в 2—12% случаев [1—4], поэтому при выявлении источника кровотечения у пациентов с ПГ, следует помнить о портальной гастропатии, которая наряду с варикозно-расширенными венами может являться причиной геморрагии. Частота хронического кровотечения при ПГГ составляет от 3 до 26% [5].

Целостность и нормальное функционирование слизистой оболочки желудка (СОЖ) обеспечивается целым рядом защитных механизмов. Эндотелий, выстилающий микрососуды СОЖ, служит не только барьером, но и является биологически активной тканью, вовлеченной во множество синтетических и метаболических функций. Он обеспечивает транспорт кислорода и питательных веществ, продуцирует простагландины и лейкотриены, прокоагулянтные факторы, оксид азота, эндотелин, факторы роста, ангиопоэтин, коллагены, активаторы плазминогена и ингибитор активатора плазминогена 1-го типа. При воздействии каких-либо повреждающих факторов, в том числе гипоксии, запускается каскад механизмов, приводящий к экстравазации эритроцитов и плазмы, агрегации тромбоцитов и отложению фибрина, вслед за которыми развивается повреждение эпителиальных клеток [6].

Исследование, проведенное на группах пациентов с ПГГ и кровотечением из СОЖ и без него, показало, что содержание компонентов фибринолитической системы было нарушено у пациентов с кровотечениями, а именно отмечалось повышение продуктов деградации фибрина и снижение ингибитора плазмина α и плазминогена. Уменьшение содержания ингибитора плазмина α, подавляющего фибринолиз, может быть связано со снижением его продукции в печени, так как при циррозе печени отмечается пониженный синтез различных факторов коагуляции и фибринолиза. Уменьшение количества плазминогена объясняется его превращением в плазмин под действием активаторов плазминогена [7].

В СОЖ, так же как и во многих других тканях, ответ на повреждение включает в себя в том числе и индукцию компонентов системы активатора плазминогена. Эта система включает сериновые протеиназы — активатор плазминогена урокиназного типа (uPA) и активатор плазминогена тканевого типа (tPA), которые превращают плазминоген в плазмин, а также рецептор uPA (uPAR), связывающий uPA на поверхности клеток. Ранняя активация uPA и tPA приводит к подавлению гемостаза вследствие деградации фибрина, в то время как поздняя активация приводит к ремоделированию тканей. uPA участвует в деградации внеклеточного матрикса, стимуляции ангиогенеза, миграции и адгезии клеток. Действие активаторов плазминогена регулируется изменением экспрессии ингибиторов активатора плазминогена 1, 2 и 3-го типов (PAI-1, 2 и 3), основным из которых является PAI-1 [8—10]. Он стабилизирует сгустки фибрина, ингибируя uPA и tPA и обеспечивая, таким образом, гемостаз и минимизируя геморрагические повреждения [9]. Продукция PAI-1 индуцируется различными факторами роста, цитокинами, гормонами и другими стимулами [11]. Так, целый ряд авторов показали увеличение продукции мРНК и белков uPA, uPAR и PAI-1 в эпителиальных клетках СОЖ при наличии инфекции , повышенном уровне гастрина [8, 10, 11], а также избыточную экспрессию мРНК PAI-1 у пациентов, принимающих аспирин или нестероидные противовоспалительные препараты [9]. uPA и uPAR играют определенную роль в стимулируемой пролиферации эпителиальных клеток СОЖ, опосредованную через активацию эпидермального фактора роста и его рецептора [8].

uPA синтезируется не только эндотелиальными клетками сосудов, но и эпителиальными клетками, причем его продукция увеличивается под действием различных стимулов [12]. Основным источником PAI-1 при инициации формирования тромба являются тромбоциты, тем не менее он синтезируется и другими типами клеток — эндотелиальными и эпителиальными [12, 13]. В СОЖ PAI-1 продуцируется главными, обкладочными и эпителиальными клетками желудочных желез [8—10]. Нарушение функционирования, дефицит или гиперпродукция PAI-1 может вызывать либо кровотечения, либо тромбоз [14]. У экспериментальных мышей, у которых отсутствует PAI-1, отмечаются замедленное формирование тромба и ускоренный тромболизис после повреждения сосуда, что подтверждает его ключевую роль в регуляции внутрисосудистого обмена фибрина [15].

Известно, что плазмин играет значительную роль в развитии кровотечений при язвенной болезни. Показаны увеличение содержания uPA и PAI-1 в краях язв желудка и двенадцатиперстной кишки, а также усиленная фибринолитическая активность при кровотечениях из язвы, которая подавлялась с помощью повышения уровня PAI-1 в плазме крови [16].

Развивающаяся при ПГГ гипоксия может вызывать повреждение эндотелиальных клеток сосудов СОЖ и массивный выброс активаторов плазминогена, что приводит к усиленному фибринолизу под действием плазмина и в свою очередь к кровотечениям. Таким образом, кровоточивость СОЖ у пациентов с ПГГ может объясняться как нарушением продукции компонентов свертывающей системы крови в печени, так и усиленным фибринолизом [7].

Тем не менее в литературе не представлены данные, касающиеся изучения содержания активаторов плазминогена и ингибиторов активаторов плазминогена при ПГГ.

Целью настоящего исследования явилось изучение экспрессии uPA и PAI-1 в эндотелии сосудов и эпителиальных клетках СОЖ у пациентов с ПГГ и с ПГ без признаков ПГГ по сравнению с контрольной группой.

Материалом для исследования послужили биоптаты СОЖ, полученные при эндоскопическом исследовании. В исследование вошли 26 больных с ПГГ (17 мужчин, 9 женщин, средний возраст 54±8,6 года), проходивших лечение в ФГБНУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» в 2014 г. Из них у 13 пациентов (9 мужчин, 4 женщины, средний возраст 54,1±9,8 года) выявлена ПГГ легкой степени, у 13 пациентов (8 мужчин, 5 женщин, средний возраст 54±7,3 года) — ПГГ средней степени тяжести. В нашей выборке отсутствовали пациенты с тяжелой степенью ПГГ. Диагноз ПГГ ставился на основании эндоскопической картины, степень тяжести присваивалась в соответствии с трехкатегорийной классификационной системой ПГГ, согласно которой при легкой степени отмечается мозаичный рисунок слизистой оболочки, при средней степени — появление красных «скарлатиноподобных» элементов СОЖ, при тяжелой — увеличение количества точечных геморрагий, их слияние и появление черно-коричневых кровоизлияний на СОЖ.

В исследование также были включены 9 пациентов с циррозом печени и портальной гипертензией без признаков ПГГ (1 мужчина, 8 женщин, средний возраст 55,7±5,4 года). Контрольную группу составили биоптаты неизмененной СОЖ, полученные от 11 пациентов (8 мужчин, 3 женщины, средний возраст 55,2±14,8 года), проходивших обследование в связи с подозрением на гастрит.

Для иммуногистохимического (ИГХ) исследования материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине и заливали в парафин. Для морфологического исследования срезы толщиной 3—4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином.

Для ИГХ-исследования срезы толщиной 3—4 мкм монтировали на высокоадгезивные предметные стекла (Polysine Slides, «Gerhard Menzel GmbH»). Депарафинирование и ИГХ-исследование проводились по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica»). Выявление в биоптатах СОЖ проводили с помощью первичных антител к («Dako», поликлональные, разведение 1:200). Использовали также первичные антитела к urokinase (урокиназа, «Abcam», поликлональные, разведение 1:50), plasminogen activator inhibitor-I (PAI-1, ингибитор активатора плазминогена-1; «Abcam», поликлональные, разведение 1:200). В каждой серии препаратов использовали соответствующие положительные и отрицательные контроли. Срезы докрашивали гематоксилином. Препараты исследовали с помощью световой микроскопии.

При наличии инфицирования отмечалась локализация бактерий на поверхности слизистых поверхностных эпителиальных клеток и в глубине желудочных ямок. Иммунопероксидазную реакцию с антителами к оценивали как положительную при наличии окрашивания и отрицательную при отсутствии.

Экспрессию урокиназы и PAI-1 изучали в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и эпителиальных клетках слизистой оболочки. Интенсивность окрашивания при иммунопероксидазной реакции с антителами к урокиназе и PAI-1 оценивали полуколичественным методом следующим образом: – — отсутствие экспрессии, + — слабая, ++ — умеренная, +++ — выраженная интенсивность иммунопероксидазной реакции. Для анализа данных типы экспрессии урокиназы были объединены в 2 группы: сниженная и повышенная экспрессия; для PAI-1 применялось подразделение на группы с отсутствием и наличием экспрессии.

Для визуализации изображения использовали цифровую камеру («Leica»).

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета анализа Excel. Сравнительный анализ выполнен методом Пирсона χ, точным методом Фишера. Критерием достоверности был уровень <0,05.

В нашем исследовании экспрессия компонентов системы активатора плазминогена — активатора плазминогена урокиназного типа (uPA, урокиназа) и ингибитора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1) выявлялась в эндотелии кровеносных сосудов и эпителиальных клетках СОЖ. Для анализа данных типы экспрессии урокиназы были объединены в 2 группы: сниженная и повышенная экспрессия; для PAI-1 применялась градация на подгруппы с отсутствием и наличием экспрессии.

ИГХ-исследование биоптатов СОЖ у пациентов с ПГГ показало, что сниженная экспрессия активатора плазминогена урокиназного типа (урокиназы) в эндотелии сосудов отмечалась в 19% (5 человек) случаев, повышенная — в 81% (21 человек) случаев. В группе с легкой степенью гастропатии сниженное содержание урокиназы выявлено в 15% (см. рисунок, а), повышенное — в 85% наблюдений. В группе со средней степенью гастропатии пониженная экспрессия урокиназы в стенках сосудов обнаружена у 23%, повышенная — у 77% пациентов. У пациентов, имеющих ПГ без признаков ПГГ, отмечалась уменьшенная экспрессия урокиназы в 11% случаев, увеличенная в 89% (см. рисунок, б). В группе контроля уровень экспрессии урокиназы был низким в 9% случаев и высоким в 91% (табл. 1).

При сравнении экспрессии уровня урокиназы в эндотелии сосудов СОЖ в группах пациентов не выявлено достоверных различий при сопоставлении следующих групп: с гастропатией легкой степени и средней степени (=0,3), контролем и группой с гастропатией легкой степени и средней степени (суммарно) (=0,23), контролем и группой с гастропатией легкой степени (=0,32), контролем и группой с гастропатией средней степени (=0,19), контролем и группой с ПГ без ПГГ (=0,44), группой с ПГ без ПГГ и группой с гастропатией легкой степени (=0,39), группой с ПГ без ПГГ и группой с гастропатией средней степени (=0,25), группой с ПГ без ПГГ и группой с гастропатией легкой степени и средней степени (суммарно) (=0,3).

ИГХ-исследование экспрессии урокиназы в эпителиальных клетках СОЖ у пациентов с ПГГ показало, что сниженное содержание отмечалось в 31% (8 человек) случаев, повышенное — в 69% (18 человек) случаев. В группе с легкой степенью гастропатии сниженное содержание урокиназы выявлено в 38% (см. рисунок, а), повышенное — в 62% наблюдений. В группе со средней степенью гастропатии пониженная экспрессия данного маркера в эпителиальных клетках СОЖ обнаружена у 23%, повышенная — у 77% пациентов. У пациентов, имеющих ПГ без признаков ПГГ, отмечалось снижение уровня экспрессии урокиназы в 22% случаев, повышение в 78% (см. рисунок, б). В группе контроля экспрессия урокиназы была низкой в 9% и высокой в 91% наблюдений (см. табл. 1).

При сравнении экспрессии уровня урокиназы в эпителиальных клетках СОЖ в группах пациентов также не выявлено достоверных различий при сопоставлении всех групп пациентов с гастропатией легкой степени и средней степени (=0,34), нормой и группой с гастропатией легкой степени и средней степени (суммарно) (=0,49), нормой и группой с гастропатией легкой степени (=0,43), нормой и группой с гастропатией средней степени (=0,41), нормой и группой с ПГ без ПГГ (=0,4), группой с ПГ без ПГГ и группой с гастропатией легкой степени (=0,34), группой с ПГ без ПГГ и группой с гастропатией средней степени (=0,48), группой с ПГ без ПГГ и группой с гастропатией легкой степени и средней степени (суммарно) (=0,39).

В результате ИГХ-исследования экспрессии PAI-1 в эндотелии сосудов СОЖ у пациентов с ПГГ выявлено, что его экспрессия отмечалась только в группе контроля, отсутствие PAI-1 выявлено в 55% (6 человек) случаев, умеренная/выраженная экспрессия — в 45% (5 человек). Во всех остальных группах экспрессия PAI-1 в сосудах не отмечалась (табл. 2).

При сопоставлении результатов экспрессии PAI-1 между контрольной группой и группой пациентов с ПГГ выявлены достоверные различия (<0,001). При ПГГ экспрессии PAI-1 не выявлено в сосудах ни при легкой степени тяжести, ни при средней, в то время как в норме отмечалась экспрессия в 45% случаев.

Сравнение экспрессии данного маркера в группах пациентов показало, что его содержание в сосудах желудка достоверно выше в контрольной группе, чем в группе с ПГ без ПГГ (<0,001). Группы пациентов с гастропатией и с ПГ без ПГГ между собой не сравнивали, так как экспрессия в сосудах отсутствовала во всех случаях.

ИГХ-исследование экспрессии PAI-1 в эпителиальных клетках СОЖ у пациентов с ПГГ показало, что сниженная и повышенная экспрессия встречалась в одинаковом количестве случаев (по 50%, по 13 человек). В группе с легкой степенью гастропатии сниженное содержание PAI-1 выявлено в 54%, повышенное — в 46% наблюдений. В группе со средней степенью гастропатии, наоборот, пониженная экспрессия PAI-1 в эпителиальных клетках СОЖ обнаружена у 46% (см. рисунок, в), повышенная — у 54% пациентов. У пациентов, имеющих ПГ без признаков ПГГ, отмечалось снижение уровня экспрессии PAI-1 в 22% случаев, повышение в 78% (см. рисунок, г). В группе контроля экспрессия PAI-1 была низкой в 9% и высокой в 91% наблюдений (см. табл. 2).

Сравнение экспрессии PAI-1 в группах пациентов показало, что экспрессия в эпителиальных клетках СОЖ достоверно чаще отсутствовала в группе с ПГГ (суммарно в группах с легкой и средней степенью гастропатии), чем в норме (<0,05). При сопоставлении экспрессии данного маркера в подгруппах с легкой и средней степенью ПГГ с контрольной группой она также значительно чаще отсутствовала в каждой из групп, чем в контрольной группе (<0,05).

Сравнение содержания PAI-1 в эпителиальных клетках СОЖ в группе пациентов с ПГ без ПГГ и контрольной группы не выявило достоверных различий (=0,08), однако экспрессия PAI-1 была ниже при ПГ без ПГГ.

Не выявлено также статистически значимых различий между группой с ПГ без ПГГ и группами с гастропатией легкой и средней степени тяжести как при сравнении их суммарно, так и по отдельности (=0,08), но можно отметить, что при гастропатии содержание PAI-1 было ниже.

Достоверных различий между группами пациентов с гастропатией легкой и средней степени не обнаружено (=0,35).

Нами проведен анализ соотношения уровней экспрессии активатора плазминогена урокиназы и его ингибитора (PAI-1). Для оценки их соотношения в эндотелии сосудов СОЖ типы экспрессии были разделены на 3 группы: повышенная экспрессия uPA при отсутствии экспрессии PAI-1 (uPA↑/PAI-1–), пониженная экспрессия uPA при отсутствии экспрессии PAI-1 (uPA↓/PAI-1–) и повышенная экспрессия uPA при наличии экспрессии PAI-1 (uPA↑/PAI-1+), которая встречалась только в группе контроля (табл. 3). Случав пониженной экспрессия uPA при наличии экспрессии PAI-1 выявлено не было.

В контрольной группе отмечено повышенное содержание uPA в стенках сосудов СОЖ при наличии экспрессии PAI-1 примерно в половине наблюдений. У пациентов с ПГ без ПГГ, а также при развитии ПГГ выявлено исчезновение экспрессии PAI-1 при незначительном снижении uPA по сравнению с контролем (=0,001 и =0,04 соответственно). Преобладание активаторов плазминогена над ингибиторами активатора плазминогена приводит к усилению фибринолиза. Развивающаяся при ПГГ гипоксия может вызывать повреждение эндотелиальных клеток сосудов СОЖ и массивный выброс активаторов плазминогена, что приводит к усиленной деградации фибрина под действием плазмина и в свою очередь к кровотечениям [7]. Преобладание uPA над PAI-1 не только в группе ПГГ, но и у пациентов с ПГ без признаков ПГГ свидетельствует о том, что у них также присутствует риск развития желудочных кровотечений.

Для сопоставления содержания данных маркеров в эпителиальных клетках СОЖ типы их экспрессии были разделены на 4 группы: повышенная экспрессия uPA при отсутствии экспрессии PAI-1 (uPA↑/PAI-1–), пониженная экспрессия uPA при отсутствии экспрессии PAI-1 (uPA↓/PAI-1–), встречавшаяся только при ПГГ, повышенная экспрессия uPA при наличии экспрессии PAI-1 (uPA↑/PAI-1+) и пониженная экспрессия uPA при наличии экспрессии PAI-1 (uPA↓/PAI-1+) (табл. 4).

Сопоставление уровней экспрессии uPA и PAI-1 в эпителиальных клетках СОЖ показало, что в контрольной группе содержание обоих маркеров было высоким в большинстве наблюдений. При развитии ПГ без ПГГ отмечалось некоторое снижение их экспрессии, которое стало более значительным в группе пациентов с ПГГ, однако статистически достоверных различий выявлено не было (>0,05). При этом у большинства пациентов с ПГГ, у которых отсутствовала экспрессия PAI-1, отмечалось повышенное содержание uPA. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что, несмотря на сохраняющийся баланс в уровнях экспрессии активатора плазминогена и его ингибитора при развитии ПГГ, а также ПГ без ПГГ у большинства пациентов, есть ряд больных, у которых преобладание продукции эпителиальными клетками СОЖ активаторов плазминогена над ингибиторами активатора плазминогена может вносить свой вклад в развитие кровотечений.

Нам не удалось найти в литературе данных, касающихся экспрессии uPA и PAI-1 в эндотелии сосудов и эпителиальных клетках СОЖ при ПГГ. Однако известна усиленная фибринолитическая активность при кровотечениях из язвы желудка и двенадцатиперстной кишки [16]. Кроме того, проводится изучение продукции PAI-1 эпителиальными клетками при неопухолевых заболеваниях. Так, в исследованиях, проведенных при различных заболеваниях легких, например остром респираторном дистресс-синдроме, выявлено увеличение продукции PAI-1 эпителиальными клетками [12, 17].

В различных работах показано, что продукция uPA и PAI-1 увеличивается в эпителиальных клетках СОЖ при наличии инфекции [8, 10, 11]. В нашем исследовании таких корреляций не получено ни в одной из групп. Выявление ИГХ-методом показало наличие обсемененности СОЖ у 23% пациентов с ПГГ, у 18% пациентов из контрольной группы и отсутствие — в группе больных с ПГ без признаков ПГГ что, возможно, является случайностью и связано с небольшой выборкой.

Таким образом, в нашем исследовании при изучении экспрессии PAI-1 выявлено, что его содержание в эндотелии сосудов СОЖ статистически достоверно выше в контрольной группе, чем в группе пациентов с ПГГ и с ПГ без ПГГ. Сравнение экспрессии PAI-1 в эпителиальных клетках СОЖ в группах пациентов показало, что его экспрессия достоверно чаще отсутствовала в группе с ПГГ, чем в норме.

Анализ соотношения уровней экспрессии uPA и PAI-1 показал статистически значимое преобладание экспрессии активатора плазминогена урокиназного типа над его ингибитором в эндотелии сосудов СОЖ у пациентов с ПГГ и с ПГ без признаков ПГГ по сравнению с контролем. Преобладание uPA над PAI-1 приводит к усиленной деградации фибрина под действием плазмина и в свою очередь может играть определенную роль в развитии кровотечений из СОЖ.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования: Е.М.П., А.Г. Ш.

Сбор и обработка материала: Т.С.С., С.Б.Ж., Е.М.П.

Статистическая обработка материала: С.Б.Ж.

Написание статьи: Т.С.С., Е.М.П.

Редактирование: А.Г. Ш.