Введение

В основе патофизиологических механизмов развития ожоговой болезни лежат системный воспалительный ответ, нарушения свертываемости крови и микроциркуляции, повышение сосудистой проницаемости, гипоксия, способствующие развитию полиорганной недостаточности (ПОН) [1]. В структуре ПОН особое место занимает поражение желудочно-кишечного тракта. Согласно данным ретроспективного анализа, проведенного Q.L. He и соавт. [2], почти у 50% обследованных тяжелообожженных пациентов выявлена дисфункция желудочно-кишечного тракта, а возникновение язв Курлинга и кровотечений независимо коррелирует с 90-дневной смертностью. Повреждение интестинального барьера играет жизненно важную роль в патофизиологических изменениях после тяжелой ожоговой травмы, поскольку повышение проницаемости кишечника ведет к транслокации бактерий, их эндотоксинов, что потенцирует системный воспалительный ответ и способствует развитию ПОН и сепсиса [3]. К факторам, оказывающим влияние на целостность кишечной стенки при ожоговой болезни, относятся стресс, ишемия/гипоксия и ишемически-реперфузионное повреждение, развитие системного воспалительного ответа, дисбиоз кишечной микробиоты [4].

В настоящее время среди биоиндикаторов повреждения кишечной стенки при различных патологических состояниях выделяют кишечный белок, связывающий жирные кислоты (intestinal fatty acid-binding protein — I-FABP), обладающий высокой чувствительностью и тканевой специфичностью [5—7]. Этот белок массой 15 кД участвует в буферной системе клетки, транспорте длинноцепочечных жирных кислот, составляет 2% белка энтероцитов и при их деструкции попадает в циркулирующую кровь [8].

Данные литературы, касающиеся использования данного биомаркера при ожоговой болезни, немногочисленны и свидетельствуют о перспективности его применения в лабораторной диагностике повреждения интестинального барьера у обожженных [9—11]. Однако другие авторы не подтверждают диагностическую ценность I-FABP [12].

Цель исследования — изучить изменения уровня кишечного белка, связывающего жирные кислоты, в остром периоде ожоговой болезни и оценить возможности этого биомаркера как предиктора летального исхода.

Материал и методы

Исследование носило характер пилотного обсервационного проспективного когортного одноцентрового нерандомизированного, проведено на базе отделения реанимации и интенсивной терапии ожогового центра Университетской клиники ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава России (директор — д.м.н. И.Ю. Арефьев) в соответствии со стандартами Хельсинкской декларации (2013), одобрено локальным этическим комитетом Приволжского исследовательского медицинского университета (протокол №17 от 11.10.19). От каждого пациента получено письменное добровольное согласие на участие в исследовании. Если пациент по каким-либо причинам не мог собственноручно подписать данный документ, то он заверялся двумя подписями сотрудников Университетской клиники.

В обследование вовлечены 38 пациентов (женщин — 6, мужчин — 32) в возрасте 42,5±14,5 года с ожоговой травмой, сопровождавшейся развитием ожогового шока. Площадь ожога составила 50,7±17,2% поверхности тела. У 7 пациентов зафиксирован летальный исход: 4 из них умерли на 3—15-е сутки, 3 — на 37—49-е сутки с момента получения травмы.

С целью оценки различий в изменениях концентрации исследуемого биомаркера в зависимости от варианта исхода ожоговой болезни обследованные пациенты разделены на две группы: с благоприятным исходом (1-я группа) и летальным исходом (2-я группа).

Критерии включения в исследование: подписанное информированное добровольное согласие на участие в исследовании, возраст старше 18 лет, площадь ожоговой травмы более 20% или глубокие ожоги более 10%.

Критерии невключения в исследование: прогностический ожоговый индекс (площадь глубоких ожогов + половина поверхностных ожогов + возраст в годах) менее 80 баллов, свидетельствующий о низком относительном риске неблагоприятного исхода [13], а также наличие любой сопутствующей тяжелой соматической патологии.

Забор крови для исследований осуществляли в 1-е, на 2-е, 3-и, 6±2-е, 9±2-е и 11±2-е сутки после получения термической травмы.

В группу контроля вошли 30 условно здоровых добровольцев, сопоставимых по возрасту и полу.

Содержание I-FABP исследовали методом энзим-связанного иммуносорбентного анализа на иммуноферментном анализаторе Infinite 50 (Tecan Austria GmbH, Австрия) с использованием наборов реагентов фирмы Cloud-Clone CORP (КНР).

Оценку активности свободнорадикального окисления в плазме крови (СРОпл.) и эритроцитах (СРОэр.) выполняли методом индуцированной биохемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (Россия) [14]. Определение диеновых конъюгатов (ДК) и оснований Шиффа в плазме крови осуществляли по методу Б.С. Хышиктуева и соавт. [15]. Содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой с использованием наборов реагентов ТБК-АГАТ (ООО «Агат-Мед», Россия) на спектрофотометре ПЭ-5400 (ООО «Экохим», Россия). В гемолизате отмытых эритроцитов оценивали активность антиоксидантных ферментов — супероксиддисмутазы (СОД) [16], каталазы [17].

Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 13.3 (StatSoft, Inc., США). Проверка нормальности распределения данных выполнена с помощью критерия Шапиро—Уилка. Поскольку распределения полученных результатов отличались от нормального, рассчитаны медиана и границы межквартильного диапазона, представляющие собой 25-й и 75-й процентили. Данные представлены в виде Me [Q25; Q75]. Статистическая значимость различий значений определена с использованием непараметрического U-критерия Манна—Уитни. Для выявления взаимосвязей между переменными использованы коэффициент гамма-корреляции (γ) и коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r). Методом логистической регрессии определяли показатель отношения шансов (OR) и вероятность (P₊) летального исхода. Для проверки статистической значимости различий в сравниваемых группах применяли критерий Пирсона (χ²).

Для расчета прогностической значимости I-FABP проводили ROC-анализ. Анализировали следующие параметры: AUC (area under curve) — площадь под кривой, характеризующая ценность показателя: 0,9—1,0 — отличная, 0,8—0,9 — очень хорошая, 0,7—0,8 — хорошая, 0,6—0,7 — средняя, 0,6 и меньше — неудовлетворительная. Характеристиками информативности кишечной фракции белка, связывающего жирные кислоты, служили чувствительность, специфичность и диагностическая эффективность метода. Нулевую гипотезу о наличии различий в группах и статистической значимости полученных результатов принимали при p<0,05.

Результаты и обсуждение

В результате исследований обнаружено значительное увеличение концентрации I-FABP в плазме крови обожженных больных (табл. 1). Повышенный уровень кишечной фракции белка, связывающего жирные кислоты, отмечался с первых суток обследования и на протяжении всего острого периода ожоговой болезни.

Таблица 1. Изменения концентрации I-FABP и показателей прооксидантного и антиоксидантного баланса в динамике острого периода ожоговой болезни

Примечание. * — статистическая значимость различий по сравнению со значениями у лиц группы контроля (p<0,05). СРОпл. — свободнорадикальное окисление в плазме крови; СРОэр. — свободнорадикальное окисление в эритроцитах; МДА — малоновый диальдегид; ДК — диеновые конъюгаты; СОД — супероксиддисмутаза.

Учитывая известный факт развития окислительного стресса на фоне гипоксии в результате термической травмы, а также зависимость стабильности клеточной мембраны от активности свободнорадикальных процессов [18], мы провели оценку активности свободнорадикальных процессов с целью выяснения роли дисбаланса между прооксидантами и антиоксидантами в повреждении интестинального барьера у обожженных. Уже в 1-е сутки у обследованных пациентов выявлено усиление липопероксидации на фоне снижения активности антиоксидантной системы защиты (см. табл. 1). Отмечено повышение интенсивности свободнорадикальных процессов по данным биохемилюминесценции в плазме и эритроцитах, увеличение концентрации продуктов липопероксидации — диеновых конъюгатов, МДА и оснований Шиффа, а также снижение активности СОД — ключевого антиоксидантного фермента, ограничивающего образование активных форм кислорода из супероксидного анион-радикала и тем самым контролирующего активность перекисного окисления липидов. Следует отметить отсутствие статистически значимых изменений активности каталазы в динамике острого периода ожоговой болезни, что предполагает нарушение утилизации перекиси водорода. Дисбаланс между прооксидантами и антиоксидантами сохранялся на всем протяжении исследования. Выявленные нарушения являются неотъемлемым компонентом патофизиологии тяжелообожженных больных, оказывающим влияние на различные звенья гомеостаза. Повреждение тканей при тяжелой термической травме способствует увеличению образования свободных радикалов и дефициту антиоксидантной защиты, развитию гипоксии, системного воспалительного ответа, эндотелиальной дисфункции, гемокоагуляционным и микроциркуляторным нарушениям, полиорганной недостаточности, в том числе кишечной дисфункции [19].

Степень повреждения мембран энтероцитов в 1-е сутки исследования ассоциировалась с активностью процессов липопероксидации: увеличение концентрации I-FABP сопряжено с возрастанием интенсивности свободнорадикальных процессов в эритроцитах (r=0,82, p=0,04) и увеличением концентрации оснований Шиффа в плазме крови (r=0,45, p=0,02). На 9-е сутки исследований выявлена корреляционная связь уровня кишечной фракции белка, связывающего жирные кислоты, с концентрацией диеновых конъюгатов (r=0,5, p=0,03) и активностью каталазы (r= –0,53, p=0,03), что свидетельствуют о роли дисбаланса между прооксидантами и антиоксидантами в повреждении мембран энтероцитов, сохраняющегося на всем протяжении исследования.

Один из механизмов деструктивного действия гипоксии на интестинальный барьер тяжелообожженных больных может быть следующим: образующиеся при ишемии/гипоксии свободные радикалы вступают в реакцию с полиненасыщенными жирными кислотами фосфолипидной мембраны энтероцита, вызывая ее повреждение. Кроме того, активация свободнорадикального окисления может стимулировать высвобождение медиаторов воспаления и индуцировать апоптоз, что приводит к разрушению эпителиоцитов. Свободные радикалы также индуцируют деполимеризацию и перестройку F-актина цитоскелета энтероцитов [20].

При сравнении концентрации I-FABP у выживших пациентов (1-я группа) и больных с летальным исходом (2-я группа) максимальные различия в значениях исследуемого показателя наблюдались в период со 2-х по 6-е сутки после ожога: у пациентов 2-й группы выявлено увеличение содержания исследуемого биомаркера в 4—37 раз (табл. 2).

Таблица 2. Изменения концентрации I-FABP у тяжелообожженных в зависимости от исхода ожоговой болезни

Примечание. * — статистическая значимость различий между показателями у пациентов 1-й и 2-й групп (p<0,05).

При детальном анализе динамики уровня I-FABP обращают на себя внимание значения этого белка у 3 пациентов с прогрессированием в течение периода наблюдений до крайне высоких уровней среди всех обследованных больных (4502,7 пг/мл, 3895 пг/мл и 1699,3 пг/мл) (рисунок).

Динамика изменений концентрации I-FABP у тяжелообожженных больных с летальным исходом на фоне раннего сепсиса.

Максимальные значения кишечной фракции белка, связывающего жирные кислоты, на фоне самых высоких значений интенсивности свободнорадикальных процессов в плазме крови (35,74—53,72 усл. ед.) зафиксированы у одного пациента с токсическим парезом кишечника (пациента Д.), развившимся на 4-е сутки после травмы, и с летальным исходом на 15-е сутки; у двух пациентов (пациента Гл. и пациента Гв.) снижение перистальтической активности кишечника с последующим развитием токсического пареза наблюдалось за сутки до летального исхода (на 5-е сутки после получения ожога). У всех этих больных зафиксировано развитие раннего бактериального сепсиса.

Корреляционный анализ показал среднюю степень зависимости концентрации I-FABP от наличия сепсиса на 3-и сутки исследования (γ=0,57, p=0,02) и очень высокую — на 9-е сутки (γ=0,91, p=0,01). Таким образом, повышение уровня исследуемого биомаркера может быть ассоциировано с развитием сепсиса, что согласуется с данными литературы [21, 22]. Наблюдавшиеся у этих пациентов замедление и/или прекращение перистальтики кишечника могли провоцировать изменение кишечной микробиоты и бактериальную транслокацию. При нарушении целостности кишечник выступает как источник эндогенной интоксикации и «мотор» развития сепсиса, системного воспалительного ответа, полиорганной недостаточности, сопровождающихся глубокими расстройствами гомеостаза, которые могут быть тесно связаны с тяжестью состояния и риском летального исхода у тяжелообожженных [23, 24].

Путем ROC-анализа установлено, что увеличение концентрации I-FABP свыше 143,6 пг/мл характеризовалось хорошей специфичностью (71,4%), чувствительностью (81,5%) и диагностической эффективностью (79%) в отношении вероятности летального исхода у тяжелообожженных. Проведенный ROC-анализ продемонстрировал приемлемую для практического использования клиническую информативность концентрации I-FABP: площадь под кривой (AUC) с 95% ДИ составила 0,783±0,137.

Результаты анализа данных, выполненного методом логистической регрессии, показали ассоциацию высоких значений исследуемого маркера с летальным исходом, вероятность реализации которого была 95% (табл. 3), шансы летального исхода у пациентов с уровнем I-FABP >143,6 пг/мл были выше в 20 раз, чем у больных с концентрацией этого белка менее 143,6 пг/мл.

Таблица 3. Отношение шансов и вероятность летального исхода при увеличении концентрации I-FABP свыше 143,6 пг/мл

Примечание. OR — отношение шансов; Р₊ — вероятность летального исхода; В_i — коэффициент регрессии независимого фактора риска i; В₀ — свободный член в уравнении регрессии; χ² — критерий Пирсона; p — уровень статистической значимости уравнения регрессии.

Нами впервые получены сведения, касающиеся прогностической значимости содержания кишечного белка, связывающего жирные кислоты, при ожоговой болезни. Считаем, что полученные результаты определения концентрации I-FABP в сыворотке крови тяжелообожженных больных могут показать перспективность использования данного биомаркера в качестве предиктора летального исхода.

Результаты исследования также свидетельствуют о том, что уровень I-FABP может служить диагностическим признаком и неинвазивным маркером повреждения кишечной стенки у тяжелообожженных больных. Своевременная лабораторная диагностика состояния интестинального барьера при тяжелой термической травме позволит оценить вероятность осложнений ожоговой болезни, включающих развитие бактериальной транслокации, сепсис, дисфункцию кишечника, летальный исход. Для оценки функционального резерва кишечника и уточнения прогноза дальнейшего течения заболевания целесообразно оценивать концентрацию кишечного белка, связывающего жирные кислоты, при динамическом наблюдении. Учитывая выявленную нами взаимосвязь между активностью свободнорадикальных процессов и уровнем I-FABP в сыворотке крови, интестинальный барьер можно рассматривать в качестве таргетной мишени при разработке патогенетически обоснованных лечебных и профилактических мер с использованием антиоксидантных препаратов.

Настоящее исследование имеет ряд ограничений, связанных с дизайном исследования (одноцентровое, пилотное, нерандомизированное), неоднородным составом выборки. Вместе с тем полученные нами результаты и имеющиеся в литературе сведения о возможной диагностической и прогностической ценности белка, связывающего жирные кислоты, у пациентов, получающих лечение в условиях отделения интенсивной терапии и/или реанимации [25], свидетельствуют о необходимости дальнейших исследований значения данного биомаркера.

Выводы

1. Острый период ожоговой болезни сопровождается увеличением в крови концентрации кишечного белка, связывающего жирные кислоты, что свидетельствует о повреждении целостности интестинального барьера.

2. Повреждение мембран энтероцитов связано с нарушениями баланса между прооксидантами и антиоксидантами.

3. Наибольшие значения концентрации кишечного белка, связывающего жирные кислоты, отмечаются на фоне развития раннего сепсиса.

4. Концентрация I-FABP >143,6 пг/мл у тяжелообожженных пациентов имеет прогностическую ценность в качестве предиктора летального исхода в остром периоде ожоговой болезни.

Исследование проведено в рамках государственного задания по теме «Разработка технологий применения гипербарической оксигенации в разные периоды ожоговой болезни на основе изучения механизмов влияния гипероксии на прооксидантные и антиоксидантные системы организма, состояние сосудистого эндотелия и гуморальной активности».

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — О.В. Костина, В.И. Загреков

Сбор и обработка материала — А.С. Пушкин, О.В. Костина, В.И. Ашкинази, Н.В. Диденко, М.В. Преснякова

Статистическая обработка данных — О.В. Костина, Е.А. Галова, Н.В. Диденко, В.И. Ашкинази

Написание текста — О.В. Костина

Редактирование — Е.А. Галова, В.И. Загреков

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.