Галстян Г.М.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия ,

Налбандян С.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия

Двирнык В.Н.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия

Бронякина С.Ю.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия

Камельских Д.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия

Дроков М.Ю.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, 125167, Москва, Россия

Ложное определение количества тромбоцитов крови при внутрисосудистом гемолизе

Журнал: Анестезиология и реаниматология. 2019;(4): 61-67

Просмотров : 478

Загрузок : 6

Как цитировать

Галстян Г. М., Налбандян С. А., Двирнык В. Н., Бронякина С. Ю., Камельских Д. В., Дроков М. Ю. Ложное определение количества тромбоцитов крови при внутрисосудистом гемолизе. Анестезиология и реаниматология. 2019;(4):61-67. https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201904161

Авторы:

Галстян Г.М.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия ,

Все авторы (6)

Внутрисосудистый гемолиз диагностируют при выявлении анемии, повышенной плазменной концентрации свободного гемоглобина более 0,15 г/л [1], шистоцитоза (более 0,5—1%) и ретикулоцитоза [2], а также при уменьшении плазменной концентрации гаптоглобина (равной или менее 0,25 г/л), повышении концентраций билирубина и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) [3]. Причины развития внутрисосудистого гемолиза у больных в критических состояниях могут быть различными: использование экстракорпоральной мембранной оксигенации (ЭКМО), аппаратов искусственного кровообращения, заместительной почечной терапии, устройств механической поддержки левого желудочка, ожоги, HELLP синдром, тромботическая микроангиопатия (ТМА), пароксизмальная ночная гемоглобинурия и прочее [4—9]. При внутрисосудистом гемолизе происходит механическое разрушение эритроцитов, в результате чего образуются их обломки и фрагменты, которые циркулируют в крови и могут влиять на результаты автоматического подсчета форменных элементов крови, в частности, тромбоцитов.

В литературе приведено описание клинического наблюдения, в котором у 57-летнего больного с термическими ожогами выявлен тромбоцитоз 1121⋅109/л, в то время как при визуальном подсчете тромбоцитов в мазке крови их количество составило 173⋅109/л [10].

Авторы объясняют выявленную ошибку подсчета тромбоцитов тем, что гематологический анализатор расценил как тромбоциты фрагменты эритроцитов, образовавшиеся вследствие термической травмы и гемолиза [10].

В другом исследовании на примере 40 больных, в крови которых выявлялись фрагментированные эритроциты, показано, что наличие фрагментированных эритроцитов является основной ошибкой при автоматическом подсчете тромбоцитов крови. Отмечена сильная корреляция между количеством фрагментированных эритроцитов, выявленных с помощью проточной флуоцитометрии или при визуальном подсчете, и избыточным количеством клеток крови, определяемых автоматическим анализатором как тромбоциты [11]. Как недооценка, так и переоценка количества тромбоцитов крови у больных в критических состояниях могут иметь существенные клинические последствия, прежде всего у больных, получающих антикоагулянты (при проведении экстракорпоральных методов лечения — ЭКМО, заместительной почечной терапии и т. д.).

Цель исследования — на основании собственных клинических наблюдений и экспериментальных данных представить возможные ошибки определения количества тромбоцитов крови у больных с внутрисосудистым гемолизом.

Материал и методы

Исследование состояло из двух частей. В первой части приведено клиническое наблюдение 2 больных с внутрисосудистым гемолизом, у которых выявлено несоответствие количества тромбоцитов крови при определении с помощью гематологического анализатора и путем визуального подсчета.

Во второй части иследования in vitro двумя методами воспроизведен внутрисосудистый гемолиз и установлена связь между выраженностью гемолиза и количеством клеток, определяемых гематологическим анализатором как тромбоциты.

Наличие внутрисосудистого гемолиза подтверждали при выявлении анемии в отсутствие признаков кровотечения, уменьшении сывороточной концентрации гаптоглобина менее 0,25 г/л, повышении сывороточной активности ЛДГ более 378 МЕ/л, повышении плазменной концентрации свободного гемоглобина более 0,15 г/л, концентрации шистоцитов крови более 1%.

Кровь для исследования набирали из артериального катетера, установленного в бедренную артерию. Концентрацию форменных элементов и гемоглобина крови определяли на автоматическом анализаторе Sysmex XP-300 («Sysmex Corporation», Япония). Одновременно с автоматическим подсчетом форменных элементов крови проводили определение количества тромбоцитов визуальным методом (микроскопия) [12]. Количество шистоцитов считали в мазках крови, согласно рекомендациям Международного совета по стандартизации в гематологии по идентификации шистоцитов [13]. Определение концентрации свободного гемоглобина плазмы производили на анализаторе гемоглобина крови HemoСue Plasma Low Hb («HemoCue AB», Швеция).

В экспериментальной части работы воспроизводили гемолиз в различных условиях. Термический гемолиз получали путем нагревания 5 мл эритроцитной взвеси, помещенной в пробирки S-Monovette («Sarstedt AG&Co.», Германия) с 3,2% цитратом натрия в термостате при температуре 50 оС в течение 60 мин. Подсчет форменных элементов крови проводили на Sysmex XP-300 («Sysmex Corporation», Япония) до и после индукции гемолиза. Термический гемолиз проведен в 11 пробах эритроцитной взвеси.

Механический гемолиз проведен вручную в 10 пробах эритроцитной взвеси путем нагнетания и аспирации эритроцитной взвеси с помощью шприцев через колонку «Depletion tubing set (DTS) 261−01» от аппарата CliniMACS Plus («Miltenyi Biotec GmbH», Германия), содержащую металлические шарики, в течение 10 мин. Эритроциты разрушались вследствие создаваемого разряжения и действия металлических шариков, которыми наполнена система. Наличие гемолиза подтверждалось обнаружением повышения концентрации свободного гемоглобина во взвеси.

Статистический анализ. Результаты представлены в виде диаграммы рассеяния, на которой отдельно горизонтальными линиями указаны медианы (Ме). Для оценки различий между двумя независимыми выборками использован U-критерий Манна—Уитни. В случае двух зависимых выборок использован критерий Уилкоксона. Порог статистической значимости р принят равным 0,05. Для построения оптимальной регрессионной модели использована процедура «подгонки кривых», в качестве приемлемой модели отбирали модель с наибольшим коэффициентом детерминации. Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала Ме (25-й перцентиль; 75-й перцентиль).

Результаты

Клиническое наблюдение 1

Больная Г., 64 лет, диагноз — острый промиелоцитарный лейкоз, поступила в отделение реанимации и интенсивной терапии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России в связи с острой дыхательной недостаточностью, вызванной двусторонней субтотальной пневмонией, возникшей в период миелотоксической панцитопении после химиотерапии (концентрации лейкоцитов крови 0,1⋅109/л, тромбоцитов 36⋅109/л, гемоглобина 67 г/л). Больная в первые же сутки переведена на искусственную вентиляцию легких, а затем в связи с сохраняющейся гипоксемией (индекс оксигенации РаО2/FiO2составил 61) начато проведение вено-венозной ЭКМО. При проведении ЭКМО осуществляли непрерывную инфузию (200—500 ед/ч) нефракционированного гепарина, сохраняя активированное частичное тромбопластиновое время в пределах 60—80 сек, концентрацию тромбоцитов крови поддерживали путем трансфузий концентратов тромбоцитов не ниже 80⋅109/л. Подсчет тромбоцитов крови проводили на гематологическом анализаторе 4 раза в сутки. Отрицательное давление в бедренной канюле было от –150 до –160 мм рт.ст., градиент давления до и после оксигенатора составил 40—60 мм рт.ст., скорость кровотока — 3,7—5 л/мин, плазменная концентрация свободного гемоглобина плазмы — 1,1 г/л.

На 7-е сутки проведения ЭКМО отмечены вибрация насоса, увеличение потребности в трансфузиях эритроцитов, повышение плазменной концентрации свободного гемоглобина до 4,7 г/л. Причиной гемолиза могла быть высокая скорость кровотока через оксигенатор (5 л/мин, 4000 об/мин). У больной сохранялся миелотоксический агранулоцитоз, но при этом количество тромбоцитов крови не только стабилизировалось, но стало даже увеличиваться без трансфузий, достигнув 166⋅109/л, а затем в течение дня — до 296⋅109/л, что было возможно, учитывая время, прошедшее после химиотерапии, и ожидаемое восстановление тромбоцитопоэза. Однако при этом у больной значительно усилился геморрагический синдром: появились петехиальные кровоизлияния на коже и слизистых, кровотечения из мест установки сосудистых канюль, носовое кровотечение. Это послужило основанием для визуального пересчета количества тромбоцитов крови. При микроскопии выявлено значительное количество фрагментированных эритроцитов, расцениваемых анализатором как тромбоциты, а истинное количество тромбоцитов крови составило 11⋅109/л (рис. 1).

Рис. 1. Фрагментированные эритроциты (указаны стрелками) в крови у больной Г. Окраска по Паппенгейму. ×1000.

После трансфузии концентрата тромбоцитов геморрагический синдром купирован. В дальнейшем при проведении трансфузионной терапии ориентировались только на количество тромбоцитов, определенных при микроскопии, поскольку сохранялась разница между результатами их автоматического и визуального подсчета. При нарастании гемолиза (концентрация свободного гемоглобина плазмы увеличилась до 7 г/л) количество тромбоцитов крови, по данным автоматического гематологического анализатора, было 378⋅109/л, а при микроскопии — 17⋅109/л.

Клиническое наблюдение 2

У больной З., 27 лет, в марте 2013 г. установлен Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз, начата химиотерапия по протоколу «ОЛЛ-2009» [14].

20 ноября 2017 г. выполнена трансплантация аллогенного костного мозга. Спустя 100 дней достигнут 100% донорский химеризм. Больная выписана из стационара для проведения амбулаторного лечения.

27 февраля 2018 г. больная госпитализирована в связи с появлением галлюцинаций, анемии (концентрация гемоглобина крови 52 г/л), петехиальной сыпи на коже в отсутствие признаков кровотечения, олигурии, азотемии (концентрация креатинина сыворотки 300 мкмоль/л) (рис. 2, а).

Рис. 2. Внешний вид больной с геморрагиями на коже и гемолизированная плазма в пробирке. а — петехиальные кровоизлияния и гематомы на коже; б — гемолиз в пробирке.
На электрокардиограмме выявлено острое повреждение миокарда, выполнена коронарография, при которой обнаружена тромботическая окклюзия правой коронарной артерии, произведены механическая реканализация, баллонная ангиопластика и стентирование правой коронарной артерии.

Прямая проба Кумбса при этом была отрицательной, шистоциты в крови — 4,1%, сывороточная концентрация ЛДГ — 7997 МЕ/л (референсные значения 378 МЕ/л). В плазме крови: концентрация свободного гемоглобина 2 г/л (норма до 0,07 г/л), активность металлопротеиназы ADAMTS 13 — 50%, уровень D-димера — 7975 нг/мл, активированное частично тромбопластиновое время — 29 сек, протромбиновый индекс — 91%, уровень фибриногена — 2,2 г/л. При исследовании на двух гематологических анализаторах (Sysmex XP-300 и Sysmex КX-21N) количество тромбоцитов крови составило 155⋅109/л и 113⋅109/л (см. рис. 2, б).

На основании клинико-лабораторных данных установлена трансплант-ассоциированная ТМА, протекающая с внутрисосудистым гемолизом, анемией, тромбоцитопенией, острой почечной недостаточностью, нарушением сознания, острым инфарктом миокарда. В то же время обращало на себя внимание несоответствие между выраженностью кожного геморрагического синдрома (см. рис. 2, а) и количеством тромбоцитов крови (рис. 3)

Рис. 3. Результаты подсчета количества тромбоцитов крови на двух гематологических анализаторах и количество тромбоцитов при микроскопии.
в отсутствие значительных отклонений в коагулограмме. Произведен визуальный подсчет тромбоцитов крови. Определены многочисленные фрагментированные эритроциты и шистоциты (до 4%), что подтвердило диагноз ТМА [15]. Концентрация тромбоцитов крови составила всего 13⋅109/л, т. е. анализаторы ошибочно подсчитывали в качестве тромбоцитов осколки эритроцитов (см. рис. 3). В дальнейшем количество тромбоцитов крови определяли у этой больной только с помощью визуального подсчета.

Экспериментальная часть

Термический гемолиз проведен в 11 пробах эритроцитной взвеси. Исходно в пробах эритроцитной взвеси определены минимальный свободный гемоглобин медиана 0,2 (0,1; 0,2) г/л и лишь единичные тромбоциты медиана 2 (0; 5)⋅109/л.

После инкубации в термостате при 50 оС в течение 1 ч в пробах регистрировали гемолиз: концентрация свободного гемоглобина составила 1,4 (1,2; 3,2) г/л. Гематологический анализатор в результате гемолиза во всех пробах ошибочно выявлял клетки, которые расценивались как тромбоциты: 486 (389; 850)·109/л.

Причем этих клеток было тем больше, чем более выражен гемолиз в пробе (рис. 4, а).

Рис. 4. Связь между выраженностью гемолиза и количеством клеток крови, определяемых как тромбоциты гематологическим анализатором. а — количество клеток, определяемых как тромбоциты, при различных концентрациях свободного гемоглобина в пробе; б — корреляция между определяемым гематологическим анализатором количеством «тромбоцитов» и свободным гемоглобином в пробе.
Имелась кубическая зависимость между концентрацией свободного гемоглобина в эритроцитной взвеси и ошибочно определяемой гематологическим анализатором концентрацией тромбоцитов в ней (см. рис. 4, б).

При механическом гемолизе также после появления свободного гемоглобина в пробах стали определяться «тромбоциты», которых не было до воздействия: свободный гемоглобин увеличился с 0,2 (0,1; 0,2) г/л до 14,6 (9,7; 18,7) г/л (р<0,001), а концентрация тромбоцитов, определяемая гематологическим анализатором, увеличилась с 0 (0; 2,8)·109/л до 60,9 (42; 72)·109/л (р<0,001).

Обсуждение

В первом клиническом наблюдении внутрисосудистый гемолиз возник при проведении ЭКМО — аппаратного метода замещения функции газообмена и/или кровообращения у пациентов, находящихся в критическом состоянии [16, 17]. Гемолиз при проведении ЭКМО является серьезным осложнением. Повышение концентрации свободного гемоглобина плазмы при ЭКМО является независимым предиктором смертности (отношение шансов 3,4; 95% доверительный интервал от 1,3 до 8,8, р=0,011) [7]. Современные аппараты ЭКМО позволяют уменьшить гемолиз, обусловленный травмой эритроцитов насосом. На гемолиз не влияет продолжительность проведения ЭКМО [6], но наиболее выраженный гемолиз отмечен в первые 5 мин экстракорпорального кровообращения [18]. Причиной механического гемолиза при проведении ЭКМО является не столько механическое повреждение эритроцитов насосом, сколько генерируемое им отрицательное давление [1, 19], приводящее к возникновению феномена кавитации, при котором образуются микропузырьки вакуума внутри эритроцитов, приводящие к их разрыву [1, 20].

Кавитация возникает, если кровь подвергается избыточному отрицательному давлению, превышающему –650 мм рт.ст., и при скорости насоса более 3000 об/мин [19]. Меньшее отрицательное давление и скорость насоса обычно не вызывают кавитации и гемолиза [1]. Среди других причин гемолиза при ЭКМО называют аспирацию крови через канюли малого диаметра, способствующую кавитации [21]. Еще одной причиной является работа насоса. В проспективном рандомизированном исследовании показано, что вид насоса (центрифужный или роликовый) не играет существенной роли в возникновении гемолиза [6], но даже в отсутствие клинически значимого гемолиза необходимо учитывать, что действие насоса приводит к субгемолитической механической травме эритроцитов [22]. Гемолиз может явиться одним из проявлений тромбообразования, которое может возникнуть в любом участке экстракорпорального контура [23, 24]. В представленном наблюдении косвенным проявлениями тромбоза в головке насоса явились появление шума при его работе, ощущаемая вибрация и гемолиз [21, 25]. Внутрисосудистый гемолиз встречается с частотой от 1,7 [21] до 5,7% [26] у взрослых и в 10,4% случаев у детей [26]. Современные аппараты ЭКМО позволяют значительно снизить риск возникновения этой патологии [1]. В первом наблюдении большая скорость кровотока, необходимая для поддержания оксигенации крови, и, вероятно, частичный тромбоз, о котором косвенно свидетельствовали появившиеся шум и вибрация, способствовали развитию гемолиза.

Во втором наблюдении внутрисосудистый гемолиз был признаком ТМА. Группа ТМА включает в себя различные заболевания: тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП), атипичный гемолитико-уремический синдром (ГУС), типичный ГУС, пневмококковый ГУС, трансплант-ассоциированную ТМА (ТА-ТМА), а также ряд вторичных ТМА, ассоциированных с различными заболеваниями. Все эти заболевания отличаются патогенезом. Это может быть активация системы комплемента при ГУС [5, 27], дефицит металлопротеиназы ADAMTS 13 при ТТП [5], действие нейраминидазы, выделяемой пневмококком при пневмококковом ГУС [28], выделение шига-токсина при типичном ГУС [5] и т. д. Несмотря на разный патогенез, заболевания из группы ТМА имеют сходные клинические проявления: микроангиопатическая гемолитическая анемия, проявляющаяся внутрисосудистым гемолизом, тромбоцитопения потребления и ишемические повреждения органов [5]. В настоящем наблюдении инфекция спровоцировала развитие у больной трансплант-ассоциированной ТМА.

Общим в обоих клинических наблюдениях явились ошибки в определении количества тромбоцитов крови с помощью гематологического анализатора. Одним из признаков внутрисосудистого гемолиза как при ТМА, так и при ЭКМО, является появление фрагментированных эритроцитов [29]. Наличие в крови фрагментированных эритроцитов, имеющих размер, сходный с тромбоцитами, может стать причиной ошибки при автоматическом подсчете тромбоцитов. Обнаружена корреляция между количеством фрагментированных эритроцитов и количеством тромбоцитов, ошибочно определяемых гематологическим анализатором (r=0,60; p<0,01) [11]. В экспериментах in vitro механический гемолиз, полученный с использованием гематологического гомогенизатора, приводил при автоматическом подсчете к увеличению показателя количества тромбоцитов до 393±101,3·109/л по сравнению с образцами крови, которые не подвергались гомогенизации (247±29,1·109/л; р=0,04), что авторы объясняют ошибочным распознаванием гематологическим анализатором обломков клеток и тканей как тромбоцитов [30]. Именно этим феноменом можно объяснить увеличение показателя количества тромбоцитов в экспериментах в настоящей работе. Мы специально использовали эритроцитную взвесь, в которой отсутствуют тромбоциты. После разрушения эритроцитов с помощью нагревания при автоматическом подсчете количество клеток, определяемых гематологическим анализатором как тромбоциты, увеличивалось пропорционально степени выраженности гемолиза, приводя к развитию феномена «псевдотромбоцитоза». Этот феномен объясняется увлечением количества осколков эритроцитов диаметром 2—5 мкм, распознаваемых как тромбоциты. Подобные ошибки в измерении количества тромбоцитов могут вызывать не только осколки эритроцитов, но и криоглобулины, криофибриноген, бактерии [31].

При механическом гемолизе в крови также увеличивалось количество клеток, распознаваемых гематологическим анализатором как тромбоциты, но их количество было значительно меньше, чем при термическом гемолизе, хотя выраженность механического гемолиза была больше. Это можно объяснить большими по размеру осколками фрагментированных эритроцитов при механическом разрушении, поэтому и распознаваемых как тромбоциты клеток было меньше.

Заключение

Таким образом, при наличии внутрисосудистого гемолиза подсчет тромбоцитов крови необходимо обязательно проводить визуальным методом, поскольку при подсчете с помощью гематологического анализатора фрагментированные эритроциты ошибочно распознаются как тромбоциты. Это может не только привести к нераспознаванию тромбоцитопении, но и быть ложно расценено как тромбоцитоз и повлиять на тактику лечения. Проблема подсчета количества тромбоцитов в условиях гемолиза может быть решена применением гематологических анализаторов, использующих для подсчета клеток технологию флуоресцентной проточной цитометрии, при которой вместо простой оценки размера клеток определяются содержимое РНК/ДНК, размер клетки и сложность внутреннего строения. Такой подход позволяет обеспечить высокоточные результаты и дифференциацию клеток и клеточных обломков.

Финансирование. Исследование не имело финансовой поддержки.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Г. М. Галстян

Сбор и обработка материала — С.А. Налбандян, С.Ю. Бронякина, Д.В. Камельских, Г. М. Галстян

Статистическая обработка — М.Ю. Дроков, Г. М. Галстян

Написание текста — Г.М. Галстян, С.А. Налбандян

Редактирование — Г. М. Галстян

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts interest.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail