Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Галстян Г.М.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия ,

Полеводова О.А.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия ,

Берковский А.Л.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия ,

Сергеева Е.В.

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва, Россия ,

Тромбоэластография: сравнение полибрена и гепариназы для инактивации гепарина

Авторы:

Галстян Г.М., Полеводова О.А., Берковский А.Л., Сергеева Е.В.

Подробнее об авторах

Журнал: Анестезиология и реаниматология. 2018;(5): 60‑69

Просмотров: 1185

Загрузок: 27

Как цитировать:

Галстян Г.М., Полеводова О.А., Берковский А.Л., Сергеева Е.В. Тромбоэластография: сравнение полибрена и гепариназы для инактивации гепарина. Анестезиология и реаниматология. 2018;(5):60‑69.
Galstyan GM, Polevodova OA, Berkovskiy AL, Sergeeva EV. Thromboelastography: a comparison of polybrene and heparinase for the inactivation of heparin. Russian Journal of Anaesthesiology and Reanimatology. 2018;(5):60‑69. (In Russ.).
https://doi.org/10.17116/anaesthesiology201805160

?>

Гепарин — это сульфатированный полисахарид, играющий в организме важную роль в таких физиологических процессах, как свертывание крови, транспорт липидов, воспаление, иммунный ответ, дифференциация и рост клеток. Гепарин также используется как антикоагулянт для профилактики и лечения тромботических осложнений, сердечно-сосудистых заболеваний, при проведении экстракорпоральных методов лечения, искусственном кровообращении и прочее. Терапевтическая концентрация гепарина колеблется от 0,2—1,2 ед/мл в послеоперационном периоде и до 2—18 ед/мл при кардиохирургических операциях [1], поэтому определение активности гепарина в образцах крови имеет большое практическое значение. Известны различные методы определения активности гепарина в крови.

Активность гепарина в крови может быть определена с помощью коагуляционных методов. Определение основано на ингибировании свободного фактора свертывания крови Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавлением реактивов, содержащих фосфолипиды с адсорбированными на них фактором V, протромбином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС12.. Эти методы можно выполнять только в лабораторных условиях с помощью коагулометров [2].

Гепарин в крови можно определять опосредованно с помощью хромогенных субстратов. Для этого используют способность гепарина усиливать комплексообразование фактора Ха или тромбина с антитромбином, подавляя образующиеся протеазы, после чего определяют их остаточную активность [2]. Однако этот метод требует специального лабораторного оборудования и не может быть выполнен у постели больного [3, 4].

Быстрым методом определения гепарина в крови является тромбоэластография (ТЭГ) [4—8]. В отличие от лабораторных методов определения гепарина ТЭГ, во-первых, позволяет исследовать цельную кровь, т. е. нет необходимости в центрифугировании, во-вторых — может осуществляться у постели больного. ТЭГ проводят для контроля антикоагулянтной терапии гепарином при использовании экстракорпорального контура [5] и аппарата искусственного кровообращения у детей [9]. У взрослых пациентов ТЭГ необходимо проводить при лечении кровотечений, обусловленных применением гепарина, после аортокоронарного шунтирования [8], для контроля инактивации гепарина и выявления «синдрома рикошета» при кардиохирургических операциях с использованием аппарата искусственного кровообращения [7, 10], для контроля терапии нефракционированным и низкомолекулярным гепарином [6].

Для определения активности гепарина в образцах крови ТЭГ выполняют с цельной или стабилизированной цитратом кровью, а полученные результаты сравнивают с данными ТЭГ, выполненной с теми же образцами крови, но в кюветах, покрытых гепариназой [8, 9]. Однако ТЭГ с гепариназой требует использования дорогостоящих кювет, что ограничивает ее применение.

Цель исследования — разработать модификацию ТЭГ для определения активности гепарина в образцах крови с помощью полибрена.

Материал и методы

Для выполнения поставленной цели на первом этапе исследования создан реактив для ТЭГ, содержащий полибрен, который способен нейтрализовать гепарин; на втором этапе разработанный реактив апробирован в различных клинических условиях. Результаты сравнивали с полученными при выполнении метода ТЭГ с гепариназой.

На первом этапе на тромбоэластографе TEG 5000 («Haemoscope Corporation», США) проводили ТЭГ с раствором полибрена в различных концентрациях (0,25, 0,5, 0,75 и 1 мг/мл) и образцами крови, содержащей гепарин. Поскольку работы выполняли с цельной цитратной кровью, для активации свертывания использовали 0,2 М раствор хлорида кальция. Это позволяло при выполнении ТЭГ вносить в кювету 340 мкл цитратной крови и 20 мкл полибрен-кальциевого реактива, т. е. вносимый в кювету объем (360 мкл) соответствовал таковому при выполнении ТЭГ с гепариназой и таким образом, с одной стороны, исключался эффект гемодилюции, а с другой, — упрощалась техника выполнения ТЭГ.

Оценивали следующие параметры: R (Reaction Time) — время (мин) от начала свертывания до образования первых волокон фибрина; K — время (мин) изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления; угол α — скорость свертывания крови, характеризующая процесс полимеризации фибрина; МА — максимальная амплитуда кривой. Следует отметить, что МА характеризует плотность образовавшегося сгустка, зависит от функции и количества тромбоцитов, от функции и концентрации фибриногена, содержания XIII фактора свертывания крови.

Параметры, полученные при выполнении ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом, сравнивали с аналогичными параметрами, полученными при выполнении ТЭГ с гепариназой. Для этого в кювету с гепариназой тромбоэластографа вносили 340 мкл цельной цитратной крови, добавляли 20 мкл 0,2 М раствора хлорида кальция. Исследовали абсолютную разницу между параметрами ТЭГ с нативной цитратной цельной кровью и аналогичными параметрами после добавления гепариназы или полибрен-кальциевого реактива.

Кроме того, для оценки действия гепариназы на параметры ТЭГ использовали не только разницу показателей нативной ТЭГ и ТЭГ с гепариназой, но и отношение периода R к R с гепариназой, если отношение Rнативная/Rгепариназа составляет >1,1, то это свидетельствует о наличии в пробе крови гепарина [8]. В работе использовали отношения Rнативная/Rгепариназа и Rнативная/Rполибрен.

На втором этапе исследованы 74 образца крови 56 больных, получавших в качестве лечения нефракционированный гепарин в виде непрерывной внутривенной инфузии с различной скоростью (от 12 000 до 30 000 ед/сут). Кровь больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette («Sarstedt», Германия) с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови). ТЭГ выполняли на двух тромбоэластографах TEG 5000 («Haemoscope Corporation», США). Использовали три канала тромбоэластографа. В кювету 1-го канала вносили 20 мкл 0,2 М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. В кювету с гепариназой 2-го канала вносили 20 мкл 0,2 М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. В кювету 3-го канала вносили 20 мкл полибрен-кальциевого реактива, содержащего 0,2 М раствор кальция хлорида и полибрен в концентрации 0,5 мг/мл. После чего проводили ТЭГ и сравнивали изменения показателей в пробах с гепариназой и полибреном (2-й и 3-й каналы ТЭГ) и с цитратной кровью (1-й канал).

Статистический анализ. Для анализа данных использованы методы описательной статистики. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica (версия 6.0). Принадлежность оцениваемого вариационного ряда к нормальному распределению определяли при помощи критериев Колмогорова—Смирнова с поправкой Лильефорса при количестве исследуемых переменных n>50 и Шапиро—Уилка при n<50, уровень значимости установлен как p<0,05. Непараметрические параметры представлены в виде медианы и межквартильного интервала Me (Q1; Q3).

Результаты

При наличии в крови гепарина добавление к пробе крови, кроме кальция хлорида полибрена или гепариназы, приводило к укорочению R, К и увеличению угла α и МА по сравнению с ТЭГ, выполненной с образцами цельной цитратной крови и добавлением только 0,2 М раствора кальция хлорида. Использование гепариназы и полибрен-кальциевого реактива в отсутствие в крови гепарина существенно не влияло на результаты ТЭГ. При сравнении результатов ТЭГ 30 образцов крови с различными концентрациями полибрена (0,25, 0,5, 0,75 и 1 мг/мл) наиболее близкие параметры R, K, угол α и МА к аналогичным параметрам ТЭГ с гепариназой получены с полибрен-кальциевым реактивом, содержащим 0,25—0,5 мг/мл полибрена (рис. 1).

Рис. 1. ТЭГ больной Б., получавшей непрерывную инфузию гепарина 800 ед/ч. а — ТЭГ с нативной цельной цитратной кровью, в связи с выраженной гипокоагуляцией удлинены периоды R и K, угол α не определяется, МА снижена; б — ТЭГ с гепариназой, укорочение периода R; в — ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом, содержащим 0,25 мг/мл полибрена.

Все дальнейшие исследования проводили с реактивом, содержащим 0,5 мг/мл полибрена и 0,2 М раствор хлорида кальция в качестве растворителя. Для валидации разработанного полибрен-кальциевого реактива сравнили изменения основных параметров при выполнении ТЭГ с полибреном и в стандартных гепариназных кюветах у 56 онкогематологических больных, получающих гепарин в различных дозах. Оба реактива приводили к уменьшению параметров R и К и увеличению МА по сравнению с нативной пробой, содержащей гепарин, причем не было статистически значимых различий параметров R, К и МА в ТЭГ с гепариназой и полибреном (см. таблицу).

Таблица. Параметры ТЭГ нативной, с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом Примечание. Данные представлены в виде медианы и межквартильного интервала Me (Q1; Q3). ТЭГ — тромбоэластография; R — время от начала свертывания до образования первых волокон фибрина; K — время изменения амплитуды свертывания; угол α — скорость свертывания крови; МА — максимальная амплитуда кривой.

При сравнении изменений параметров ТЭГ (R, K, угол α, МА) в тестах с цитратной кровью после добавления гепариназы или полибрен-кальциевого реактива по сравнению с нативной ТЭГ с цельной кровью выявлена сильная корреляция между изменениями основных величин при нейтрализации гепарина гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом (рис. 2).

Рис. 2. Корреляционный анализ изменений параметров ТЭГ в тестах с полибрен-кальциевым реактивом и гепариназой у больных, получающих гепарин. Установлена сильная корреляция между изменениями основных величин при нейтрализации гепарина гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом.
Выявлена также сильная корреляция (r=0,866; p<0,001) при сравнении отношений Rнативная/Rгепариназа и Rнативная/Rполибрен (рис. 3).
Рис. 3. Корреляция между коэффициентами Rнативная/Rгепариназа и Rнативная/Rполибрен.

Таким образом, при анализе изменений параметров ТЭГ (R, К, угла α и МА) в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом по сравнению с цитратной кровью без нейтрализации гепарина установлены схожие изменения этих показателей. Следовательно, ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом позволяет определить активность гепарина в пробах крови так же, как и ТЭГ с гепариназой.

Клинические примеры использования полибрена для определения активности гепарина в различных ситуациях

Клинический пример 1. Больной Г., 27 лет, получал гепарин в виде непрерывной внутривенной инфузии в дозе 800 ед/ч. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) составляло 40 с, тромбиновое время — 44 с. Выполнены ТЭГ с нативной цельной цитратной кровью, ТЭГ с гепариназой и с полибрен-кальциевым реактивом (рис. 4).

Рис. 4. Результаты ТЭГ с нативной цельной цитратной кровью, гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом. а — ТЭГ с цельной цитратной кровью, отмечена выраженная гипокоагуляция: удлинение периодов R и K, угол α не определяется, МА снижена; б — ТЭГ с гепариназой: R, K, угол α и МА нормализовались; в — ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом: нормализация параметров, что свидетельствует о присутствии в пробе крови нефракционированного гепарина.
При сравнении результатов ТЭГ нативной цитратной крови с полибрен-кальциевым реактивом и с гепариназой отмечено укорочение времени R, К, увеличение угла α и максимальной амплитуды, что свидетельствует о наличии в образце крови гепарина.

Клинический пример 2. Больному Л., 71 года, во время проведения коронарографии и баллонной ангиопластики коронарной артерии выполнено болюсное введение 5000 МЕ гепарина. После внутривенного введения гепарина АЧТВ не определялось. На ТЭГ с нативной цитратной кровью отмечено резкое удлинение показателя R, вместе с тем К угол α и МА не определялись, сгусток крови не образовывался (рис. 5, а).

Рис. 5. ТЭГ больного, получившего болюсную дозу нефракционированного гепарина внутривенно. а — ТЭГ с нативной цитратной кровью: сгусток крови не образуется; б — ТЭГ с гепариназой: недостаточное количество гепариназы для инактивации антикоагулянта, выраженная гипокоагуляция, угол α не определяется; в — ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом: образовался сгусток крови.
В пробе с гепариназой отмечено укорочение периода R (см. рис. 5, б), однако нормокоагуляция не достигнута из-за наличия в крови большой дозы гепарина. Количество гепариназы в кювете оказалось недостаточным для инактивации антикоагулянта. В пробах с полибрен-кальциевым реактивом (см. рис. 5, в) отмечены образование сгустка, нейтрализация действия гепарина, укорочение периодов R, К, увеличение угла α и МА, что свидетельствует о наличии в образцах крови гепарина.

Обсуждение

Преимуществом мониторинга гепаринотерапии с помощью ТЭГ является использование цельной крови, не требующей центрифугирования. Это означает, что метод можно выполнять у постели больного, в отличие от коагулологических методов, для выполнения которых нужна плазма, полученная в результате центрифугирования крови, и требуется специальное оборудование.

Настоящая работа — это не первая попытка, ставящая целью заменить в методе ТЭГ гепариназу другим реактивом, нейтрализующим гепарин [11, 12]. Одним из факторов, ограничивающих широкое применение гепариназы, является ее стоимость. В частности, реактив для ТЭГ, созданный на основе протамина, оказался в 100 раз дешевле гепариназы [12].

Гепариназа — это фермент, продуцируемый Flavobacterium heparinum, который нейтрализует гепарин путем энзиматического расщепления альфа-гликозидных связей в месте связывания с антитромбином III. Уменьшение R, K и увеличение угла α и МА на ТЭГ свидетельствуют о наличии в пробе гепарина [8, 13, 14]. Гепариназа нейтрализует как минимум 10 мг/мл гепарина в пробе [11].

ТЭГ с гепариназой слабо коррелирует с активированным временем свертывания и АЧТВ [5]. ТЭГ лучше определяет активность гепарина в образцах крови, чем такие стандартные тесты, как АЧТВ, тромбиновое время, протромбиновое время. Только определение анти-Ха активности является более чувствительным методом, чем ТЭГ, при определении активности гепарина в образцах крови [14].

Для определения активности гепарина в образцах крови мы выбрали полибрен или гексадиметрина бромид (рис. 6).

Рис. 6. 1,5-диметил-1,5-диазаундекаметилен полиметобромид, синоним — полибрен.
Полибрен — антагонист гепарина, который нейтрализует молекулы полианионного гепарина через кислотно-основное взаимодействие. Полибрен издавна использовали в лабораторных методах для определения активности гепарина в пробах крови. Для этого кровь центрифугировали, получали плазму, которую разливали в несколько пробирок. В первую пробирку добавляли тромбин, если образовывался плотный сгусток, значит, гепарин в пробе крови отсутствовал, если сгусток не образовывался, то в остальные пробирки добавляли полибрен в возрастающих концентрациях и определяли, при какой концентрации образовывался плотный сгусток. По этой концентрации определяли концентрацию гепарина в образце крови [15, 16]. Более того, разработаны даже автоматические анализаторы, в которых использовали полибрен для определения концентрации гепарина в крови [17].

В 60-е годы прошлого века полибрен начали применять не только как лабораторный реактив, но и как лечебный препарат в клинической практике для нейтрализации гепарина [18]. В методе ТЭГ полибрен как реактив до настоящего времени не использовали. Нами разработан отечественный полибрен-кальциевый реактив, позволяющий определять с помощью ТЭГ активность гепарина в пробах крови, который также значительно дешевле гепариназы. В отличие от гепариназы, которая подвергает гепарин энзиматическому расщеплению [19, 20], полибрен, являясь синтетическим положительно заряженным полимером (катионом), нейтрализует гепарин через кислотно-основное взаимодействие, так как гепарин является сильной органической кислотой (анионом) [21]. Нейтрализующий эффект полибрена длится несколько часов [22]. Имеется прямая корреляция между количеством гепарина в крови и количеством полибрена, способного нейтрализовать его действие. Полибрен позволяет измерять гепарин в дозах от 0,6 ед/мл плазмы в организме. Известно, 0,04 мг полибрена нейтрализует гепарин в дозе, удлиняющей время свертывания в 2—6 раз, 0,08 мг — в дозе, удлиняющей время свертывания в 8 раз [23].

Наличие кальция в реактиве, содержащем полибрен, упрощает процесс выполнения ТЭГ. На примере больного, получившего болюсно внутривенно большую дозу гепарина (см. рис. 5), показано, что при передозировке антикоагулянта полибрен-кальциевый реактив инактивирует нефракционированный гепарин, даже когда недостаточно гепариназы и не определяются клоттинговые тесты (например, тест АЧТВ). Тест с полибреном не повторяет полностью тест с гепариназой и между ними могут быть различия. Полибрен реализует свое взаимодействие с гепарином через анионо-катионную связь [21], в то же время гепариназа вызывает расщепление гепарина путем энзиматического воздействия [24].

При корреляционном анализе изменений параметров тромбоэластограммы (R, К угла α и МА) в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом по сравнению с цитратной кровью без нейтрализации гепарина установлены схожие изменения этих показателей. Это означает, что ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом позволяет выявить гепарин в пробах крови с высокой точностью при относительной простоте исследования. Таким образом, индукция образования сгустка в цельной цитратной крови методом ТЭГ с добавлением полибрен-кальциевого реактива, содержащего 0,2 М раствора кальция хлорида и полибрен в концентрации 0,25—0,5 мг/мл, позволяет определять активность гепарина.

Заключение

Модифицированный метод тромбоэластографии с помощью полибрен-кальциевого реактива позволяет определять активность гепарина в образцах крови. При сравнении результатов тромбоэластографии, выполненной с полибреном и нативной цельной цитратной кровью, отмечаются укорочение периодов R и K, увеличение угла α и М.А. Изменения, получаемые при добавлении полибрен-кальциевого реактива, коррелируют с таковыми, получаемыми при выполнении тромбоэластографии в пробирках с гепариназой. Применение полибрен-кальциевого реактива позволяет значительно удешевить метод определения активности гепарина с помощью ТЭГ, сделав его доступным для применения на территории России.

Ограничения исследования

ТЭГ с полибреном предназначена для определения активности гепарина в образцах крови, однако не ясно, можно ли его использовать для подбора дозы гепарина при проведении гепаринотерапии, а также не исследованы чувствительность и специфичность метода для низкомолекулярного гепарина. Метод не позволяет выявлять наличие в крови прямых пероральных антикоагулянтов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Для корреспонденции: Галстян Геннадий Мартинович, доктор мед. наук, зав. отд. реанимации и интенсивной терапии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва. E-mail: gengalst@gmail.com

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail