Гепарин — это сульфатированный полисахарид, играющий в организме важную роль в таких физиологических процессах, как свертывание крови, транспорт липидов, воспаление, иммунный ответ, дифференциация и рост клеток. Гепарин также используется как антикоагулянт для профилактики и лечения тромботических осложнений, сердечно-сосудистых заболеваний, при проведении экстракорпоральных методов лечения, искусственном кровообращении и прочее. Терапевтическая концентрация гепарина колеблется от 0,2—1,2 ед/мл в послеоперационном периоде и до 2—18 ед/мл при кардиохирургических операциях [1], поэтому определение активности гепарина в образцах крови имеет большое практическое значение. Известны различные методы определения активности гепарина в крови.

Активность гепарина в крови может быть определена с помощью коагуляционных методов. Определение основано на ингибировании свободного фактора свертывания крови Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавлением реактивов, содержащих фосфолипиды с адсорбированными на них фактором V, протромбином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС1_2.. Эти методы можно выполнять только в лабораторных условиях с помощью коагулометров [2].

Гепарин в крови можно определять опосредованно с помощью хромогенных субстратов. Для этого используют способность гепарина усиливать комплексообразование фактора Ха или тромбина с антитромбином, подавляя образующиеся протеазы, после чего определяют их остаточную активность [2]. Однако этот метод требует специального лабораторного оборудования и не может быть выполнен у постели больного [3, 4].

Быстрым методом определения гепарина в крови является тромбоэластография (ТЭГ) [4—8]. В отличие от лабораторных методов определения гепарина ТЭГ, во-первых, позволяет исследовать цельную кровь, т. е. нет необходимости в центрифугировании, во-вторых — может осуществляться у постели больного. ТЭГ проводят для контроля антикоагулянтной терапии гепарином при использовании экстракорпорального контура [5] и аппарата искусственного кровообращения у детей [9]. У взрослых пациентов ТЭГ необходимо проводить при лечении кровотечений, обусловленных применением гепарина, после аортокоронарного шунтирования [8], для контроля инактивации гепарина и выявления «синдрома рикошета» при кардиохирургических операциях с использованием аппарата искусственного кровообращения [7, 10], для контроля терапии нефракционированным и низкомолекулярным гепарином [6].

Для определения активности гепарина в образцах крови ТЭГ выполняют с цельной или стабилизированной цитратом кровью, а полученные результаты сравнивают с данными ТЭГ, выполненной с теми же образцами крови, но в кюветах, покрытых гепариназой [8, 9]. Однако ТЭГ с гепариназой требует использования дорогостоящих кювет, что ограничивает ее применение.

Цель исследования — разработать модификацию ТЭГ для определения активности гепарина в образцах крови с помощью полибрена.

Для выполнения поставленной цели на первом этапе исследования создан реактив для ТЭГ, содержащий полибрен, который способен нейтрализовать гепарин; на втором этапе разработанный реактив апробирован в различных клинических условиях. Результаты сравнивали с полученными при выполнении метода ТЭГ с гепариназой.

На первом этапе на тромбоэластографе TEG 5000 («Haemoscope Corporation», США) проводили ТЭГ с раствором полибрена в различных концентрациях (0,25, 0,5, 0,75 и 1 мг/мл) и образцами крови, содержащей гепарин. Поскольку работы выполняли с цельной цитратной кровью, для активации свертывания использовали 0,2 М раствор хлорида кальция. Это позволяло при выполнении ТЭГ вносить в кювету 340 мкл цитратной крови и 20 мкл полибрен-кальциевого реактива, т. е. вносимый в кювету объем (360 мкл) соответствовал таковому при выполнении ТЭГ с гепариназой и таким образом, с одной стороны, исключался эффект гемодилюции, а с другой, — упрощалась техника выполнения ТЭГ.

Оценивали следующие параметры: R (Reaction Time) — время (мин) от начала свертывания до образования первых волокон фибрина; K — время (мин) изменения амплитуды свертывания, его нарастания или замедления; угол α — скорость свертывания крови, характеризующая процесс полимеризации фибрина; МА — максимальная амплитуда кривой. Следует отметить, что МА характеризует плотность образовавшегося сгустка, зависит от функции и количества тромбоцитов, от функции и концентрации фибриногена, содержания XIII фактора свертывания крови.

Параметры, полученные при выполнении ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом, сравнивали с аналогичными параметрами, полученными при выполнении ТЭГ с гепариназой. Для этого в кювету с гепариназой тромбоэластографа вносили 340 мкл цельной цитратной крови, добавляли 20 мкл 0,2 М раствора хлорида кальция. Исследовали абсолютную разницу между параметрами ТЭГ с нативной цитратной цельной кровью и аналогичными параметрами после добавления гепариназы или полибрен-кальциевого реактива.

Кроме того, для оценки действия гепариназы на параметры ТЭГ использовали не только разницу показателей нативной ТЭГ и ТЭГ с гепариназой, но и отношение периода R к R с гепариназой, если отношение R_{нативная}/R_{гепариназа} составляет >1,1, то это свидетельствует о наличии в пробе крови гепарина [8]. В работе использовали отношения R_{нативная}/R_{гепариназа} и R_{нативная}/R_{полибрен}.

На втором этапе исследованы 74 образца крови 56 больных, получавших в качестве лечения нефракционированный гепарин в виде непрерывной внутривенной инфузии с различной скоростью (от 12 000 до 30 000 ед/сут). Кровь больных получали путем венепункции одной из периферических вен и собирали в пробирки S-Monovette («Sarstedt», Германия) с 3,2% раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 (1 часть раствора цитрата, 9 частей крови). ТЭГ выполняли на двух тромбоэластографах TEG 5000 («Haemoscope Corporation», США). Использовали три канала тромбоэластографа. В кювету 1-го канала вносили 20 мкл 0,2 М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. В кювету с гепариназой 2-го канала вносили 20 мкл 0,2 М раствора кальция хлорида, затем 340 мкл цельной цитратной крови. В кювету 3-го канала вносили 20 мкл полибрен-кальциевого реактива, содержащего 0,2 М раствор кальция хлорида и полибрен в концентрации 0,5 мг/мл. После чего проводили ТЭГ и сравнивали изменения показателей в пробах с гепариназой и полибреном (2-й и 3-й каналы ТЭГ) и с цитратной кровью (1-й канал).

Статистический анализ. Для анализа данных использованы методы описательной статистики. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica (версия 6.0). Принадлежность оцениваемого вариационного ряда к нормальному распределению определяли при помощи критериев Колмогорова—Смирнова с поправкой Лильефорса при количестве исследуемых переменных n>50 и Шапиро—Уилка при n<50, уровень значимости установлен как p<0,05. Непараметрические параметры представлены в виде медианы и межквартильного интервала Me (Q₁; Q₃).

При наличии в крови гепарина добавление к пробе крови, кроме кальция хлорида полибрена или гепариназы, приводило к укорочению R, К и увеличению угла α и МА по сравнению с ТЭГ, выполненной с образцами цельной цитратной крови и добавлением только 0,2 М раствора кальция хлорида. Использование гепариназы и полибрен-кальциевого реактива в отсутствие в крови гепарина существенно не влияло на результаты ТЭГ. При сравнении результатов ТЭГ 30 образцов крови с различными концентрациями полибрена (0,25, 0,5, 0,75 и 1 мг/мл) наиболее близкие параметры R, K, угол α и МА к аналогичным параметрам ТЭГ с гепариназой получены с полибрен-кальциевым реактивом, содержащим 0,25—0,5 мг/мл полибрена (рис. 1).

Все дальнейшие исследования проводили с реактивом, содержащим 0,5 мг/мл полибрена и 0,2 М раствор хлорида кальция в качестве растворителя. Для валидации разработанного полибрен-кальциевого реактива сравнили изменения основных параметров при выполнении ТЭГ с полибреном и в стандартных гепариназных кюветах у 56 онкогематологических больных, получающих гепарин в различных дозах. Оба реактива приводили к уменьшению параметров R и К и увеличению МА по сравнению с нативной пробой, содержащей гепарин, причем не было статистически значимых различий параметров R, К и МА в ТЭГ с гепариназой и полибреном (см. таблицу).

При сравнении изменений параметров ТЭГ (R, K, угол α, МА) в тестах с цитратной кровью после добавления гепариназы или полибрен-кальциевого реактива по сравнению с нативной ТЭГ с цельной кровью выявлена сильная корреляция между изменениями основных величин при нейтрализации гепарина гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом (рис. 2).

Таким образом, при анализе изменений параметров ТЭГ (R, К, угла α и МА) в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом по сравнению с цитратной кровью без нейтрализации гепарина установлены схожие изменения этих показателей. Следовательно, ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом позволяет определить активность гепарина в пробах крови так же, как и ТЭГ с гепариназой.

Клинические примеры использования полибрена для определения активности гепарина в различных ситуациях

Клинический пример 1. Больной Г., 27 лет, получал гепарин в виде непрерывной внутривенной инфузии в дозе 800 ед/ч. Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) составляло 40 с, тромбиновое время — 44 с. Выполнены ТЭГ с нативной цельной цитратной кровью, ТЭГ с гепариназой и с полибрен-кальциевым реактивом (рис. 4).

Клинический пример 2. Больному Л., 71 года, во время проведения коронарографии и баллонной ангиопластики коронарной артерии выполнено болюсное введение 5000 МЕ гепарина. После внутривенного введения гепарина АЧТВ не определялось. На ТЭГ с нативной цитратной кровью отмечено резкое удлинение показателя R, вместе с тем К угол α и МА не определялись, сгусток крови не образовывался (рис. 5, а).

Преимуществом мониторинга гепаринотерапии с помощью ТЭГ является использование цельной крови, не требующей центрифугирования. Это означает, что метод можно выполнять у постели больного, в отличие от коагулологических методов, для выполнения которых нужна плазма, полученная в результате центрифугирования крови, и требуется специальное оборудование.

Настоящая работа — это не первая попытка, ставящая целью заменить в методе ТЭГ гепариназу другим реактивом, нейтрализующим гепарин [11, 12]. Одним из факторов, ограничивающих широкое применение гепариназы, является ее стоимость. В частности, реактив для ТЭГ, созданный на основе протамина, оказался в 100 раз дешевле гепариназы [12].

Гепариназа — это фермент, продуцируемый Flavobacterium heparinum, который нейтрализует гепарин путем энзиматического расщепления альфа-гликозидных связей в месте связывания с антитромбином III. Уменьшение R, K и увеличение угла α и МА на ТЭГ свидетельствуют о наличии в пробе гепарина [8, 13, 14]. Гепариназа нейтрализует как минимум 10 мг/мл гепарина в пробе [11].

ТЭГ с гепариназой слабо коррелирует с активированным временем свертывания и АЧТВ [5]. ТЭГ лучше определяет активность гепарина в образцах крови, чем такие стандартные тесты, как АЧТВ, тромбиновое время, протромбиновое время. Только определение анти-Ха активности является более чувствительным методом, чем ТЭГ, при определении активности гепарина в образцах крови [14].

Для определения активности гепарина в образцах крови мы выбрали полибрен или гексадиметрина бромид (рис. 6).

В 60-е годы прошлого века полибрен начали применять не только как лабораторный реактив, но и как лечебный препарат в клинической практике для нейтрализации гепарина [18]. В методе ТЭГ полибрен как реактив до настоящего времени не использовали. Нами разработан отечественный полибрен-кальциевый реактив, позволяющий определять с помощью ТЭГ активность гепарина в пробах крови, который также значительно дешевле гепариназы. В отличие от гепариназы, которая подвергает гепарин энзиматическому расщеплению [19, 20], полибрен, являясь синтетическим положительно заряженным полимером (катионом), нейтрализует гепарин через кислотно-основное взаимодействие, так как гепарин является сильной органической кислотой (анионом) [21]. Нейтрализующий эффект полибрена длится несколько часов [22]. Имеется прямая корреляция между количеством гепарина в крови и количеством полибрена, способного нейтрализовать его действие. Полибрен позволяет измерять гепарин в дозах от 0,6 ед/мл плазмы в организме. Известно, 0,04 мг полибрена нейтрализует гепарин в дозе, удлиняющей время свертывания в 2—6 раз, 0,08 мг — в дозе, удлиняющей время свертывания в 8 раз [23].

Наличие кальция в реактиве, содержащем полибрен, упрощает процесс выполнения ТЭГ. На примере больного, получившего болюсно внутривенно большую дозу гепарина (см. рис. 5), показано, что при передозировке антикоагулянта полибрен-кальциевый реактив инактивирует нефракционированный гепарин, даже когда недостаточно гепариназы и не определяются клоттинговые тесты (например, тест АЧТВ). Тест с полибреном не повторяет полностью тест с гепариназой и между ними могут быть различия. Полибрен реализует свое взаимодействие с гепарином через анионо-катионную связь [21], в то же время гепариназа вызывает расщепление гепарина путем энзиматического воздействия [24].

При корреляционном анализе изменений параметров тромбоэластограммы (R, К угла α и МА) в пробах с гепариназой и полибрен-кальциевым реактивом по сравнению с цитратной кровью без нейтрализации гепарина установлены схожие изменения этих показателей. Это означает, что ТЭГ с полибрен-кальциевым реактивом позволяет выявить гепарин в пробах крови с высокой точностью при относительной простоте исследования. Таким образом, индукция образования сгустка в цельной цитратной крови методом ТЭГ с добавлением полибрен-кальциевого реактива, содержащего 0,2 М раствора кальция хлорида и полибрен в концентрации 0,25—0,5 мг/мл, позволяет определять активность гепарина.

Модифицированный метод тромбоэластографии с помощью полибрен-кальциевого реактива позволяет определять активность гепарина в образцах крови. При сравнении результатов тромбоэластографии, выполненной с полибреном и нативной цельной цитратной кровью, отмечаются укорочение периодов R и K, увеличение угла α и М.А. Изменения, получаемые при добавлении полибрен-кальциевого реактива, коррелируют с таковыми, получаемыми при выполнении тромбоэластографии в пробирках с гепариназой. Применение полибрен-кальциевого реактива позволяет значительно удешевить метод определения активности гепарина с помощью ТЭГ, сделав его доступным для применения на территории России.

Ограничения исследования

ТЭГ с полибреном предназначена для определения активности гепарина в образцах крови, однако не ясно, можно ли его использовать для подбора дозы гепарина при проведении гепаринотерапии, а также не исследованы чувствительность и специфичность метода для низкомолекулярного гепарина. Метод не позволяет выявлять наличие в крови прямых пероральных антикоагулянтов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Для корреспонденции: Галстян Геннадий Мартинович, доктор мед. наук, зав. отд. реанимации и интенсивной терапии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава России, Москва. E-mail: gengalst@gmail.com