Введение
Местные анестетики являются основным классом препаратов для полного или частичного локального обезболивания без потери пациентом сознания [1, 2]. Несмотря на широкое применение, местные анестетики имеют ряд побочных эффектов, самыми тяжелыми из которых являются остановка дыхания и остановка сердца, способные привести к гибели [3—5]. Основной причиной их возникновения является отсутствие селективности действия местноанестетических средств внутри организма [1, 6]. Основные способы снижения количества побочных эффектов — это использование наноструктурированных средств доставки (липосомы и пр.), а также создание препаратов, активность которых может управляться с помощью внешних факторов, например ультразвука или света [7—13]. Использование последнего для активации лекарственных средств внутри организма было реализовано в подходе фотофармакологии [14, 15]. Суть данного подхода заключается в создании молекул, способных обратимо переходить под действием света из одной формы в другую, обладающих различной биологической активностью [15]. Примером реализации данного подхода в местной анестезии является этеркаин, местноанестетическая активность которого может обратимо управляться с помощью света [12, 13]. Этеркаин проявил значительный местноанестетический эффект на роговице глаза кролика (поверхностная анестезия), однако биологический эффект этеркаина не был исследован на других моделях местной анестезии, что делает актуальным углубленное исследование данного препарата in vivo.
Для проведения исследования в настоящей работе была выбрана модель отдергивания хвоста у мышей в ответ на лазерное воздействие (тест tail-flick, инфильтрационная и проводниковая анестезия в зависимости от удаленности точки воздействия от места введения), а также модель исследования ответа двуглавой мышцы бедра крысы на электрическую стимуляцию седалищного нерва (проводниковая анестезия).
Материал и методы
Исследование выполнено в условиях острого опыта на 18 мышах F1 BxD массой 26—32 г и на 24 крысах-самцах линии Wistar массой 190—260 г. Животных содержали по 5—6 особей в клетке при температуре 24±2 °C и влажности 50—60% при 12-часовом цикле освещения и свободном доступе к пище и воде.
Опыты на мышах были одобрены Биоэтическим комитетом МНИОИ им. П.А. Герцена (протокол №14 от 04.03.2023), а опыты на крысах проводили под контролем Этического комитета ФГБНУ НИИОПП (протокол №3 от 07.05.2024). Все процедуры и эксперименты проводили в соответствии с национальными и международными правилами гуманного обращения с животными: «Правилами надлежащей лабораторной практики», утвержденными Приказом Минздрава России от 01.04.2016 №199н, и Межгосударственными стандартами ГОСТ 33215-2014, ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными», соответствующими Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых в экспериментах и в других научных целях (ETS №123, Страсбург, 18 марта 1986 г. с приложением от 15.06.06): European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes, Council of Europe (ETS 123), Eighth Edition of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NRC 2011) [16].
В исследовании использовали следующие вещества: 1% раствор гидрохлорида 4-(2-(N-морфолино)-этокси)-азобензола (этеркаина) на основе 4% мицеллярного водного раствора Kolliphor ELP, который был получен по ранее описанной методике [13]. В качестве отрицательного контроля в экспериментах использовали 4% водный раствор Kolliphor ELP (BASF, Германия) — растворитель, а в качестве препарата сравнения использовали 2% раствор лидокаина (лидокаин, раствор для инъекций 2%, «Борисовский завод медицинских препаратов», Республика Беларусь).
Оценку местноанестетической активности у мышей проводили с помощью стандартного аналгезиометрического теста tail-flick, заключающегося в оценке времени отдергивания (от 1 до 20 с) хвоста при воздействии лазера (810±10 нм, 0,4 Вт, «АЛХТ-ЭЛОМЕД», Россия). Опыты проведены на трех группах животных, в каждой группе по 6 мышей. Для этого перед введением препаратов (1% этеркаин в 4% Kolliphor ELP, 4% Kolliphor ELP или 2% лидокаин) животных фиксировали в отдельных ячейках, позволяющих проводить манипуляции на свободном хвосте. Препараты вводили путем двух инъекций симметрично по 0,03 мл с двух сторон у корня хвоста. При отсутствии ответа в течение 20 с воздействие прекращали с целью уменьшения травматизации животного. Тест проводили каждые 5 мин, начиная с 5-й минуты после введения, в течение всего времени эксперимента (60 мин). В каждой временной точке по очереди проводили оценку сначала на проксимальном участке хвоста (рядом с местом введения, оценка инфильтрационной анестезии) и на дистальном участке (3 см от кончика хвоста, оценка проводниковой анестезии).
Для изучения влияния препаратов на ответ двуглавой мышцы бедра крыс (M-ответ) при электрической стимуляции седалищного нерва под нембуталовым наркозом (50 мг/кг, внутрибрюшинно) у животных обнажали левый седалищный нерв на уровне подколенной ямки на протяжении 10—12 мм. Выделенный сегмент нерва помещали на серебряные проволочные электроды с межэлектродным расстоянием 2 мм. Опыты проведены на трех группах животных, в каждой группе по 8 крыс. Животным 1-й группы на обнаженный седалищный нерв апплицировали 2% раствор лидокаина; животным 2-й группы — 4% мицеллярный водный раствор Kolliphor ELP (BASF) — растворитель; животным 3-й группы — 1% раствор гидрохлорида 4-(2-(N-морфолино)-этокси)-азобензола на основе 4% мицеллярного водного раствора Kolliphor ELP — этеркаин. Продолжительность аппликации препаратов на обнаженный седалищный нерв у всех животных составляла 15 мин.
Раздражение сегмента седалищного нерва производили прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0,1 мс при помощи электростимулятора Nihon Kohden. При раздражении нерва использовали разную силу тока — от 0,05 до 1 мА. Минимальную силу тока, при которой регистрировали M-ответ, принимали за пороговую. Эффективность проведения сигнала по нерву оценивали по величине амплитуды M-ответа (мкВ). Первое раздражение сегмента седалищного нерва проводили до аппликации препаратов: регистрировали воздействие на мышцу пороговой величины силы тока, а также силы тока величиной в полтора и два порога. Далее на обнаженный седалищный нерв апплицировали препараты. Аппликацию этеркаина и последующие тестирования проводили в темноте. Через 15 мин осушали операционное поле и проводили тестирования в течение 45 мин с интервалами в 10 мин.
Для регистрации M-ответа два изолированных игольчатых электрода вводили в мышцу перпендикулярно направлению мышечных волокон на расстоянии 0,5 мм друг от друга. Электрические сигналы от мышцы регистрировали бимодальным усилителем («Биола»). Измеряемые сигналы оцифровывали 10-канальным преобразователем ППШ-10 («Биола»).
Статистическую обработку данных осуществляли по алгоритмам программы GraphPad 8. Проводили предварительную проверку предположения о нормальном характере распределения в каждой экспериментальной группе по тестам Колмогорова—Смирнова. При нормальном распределении оценку значимости показателей и различий рассматриваемых выборок проводили с помощью одностороннего дисперсионного анализа (On-way ANOVA) с использованием post-hos-критерия Tukey с поправкой Гринхауза—Гейссера. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (M±m). При распределении, отличном от нормального, оценку значимости показателей и различий рассматриваемых выборок проводили по T-критерию (парному критерию Уилкоксона) для связанных выборок и по U-критерию Манна—Уитни для оценки различий между двумя независимыми выборками. В качестве средневыборочной характеристики использовали медиану (Me), первый и третий квартили (Q1; Q3). Оценку качественных эффектов проводили по точному методу Фишера. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при p<0,05.
Результаты
Оценка индивидуальной болевой чувствительности у мышей по тесту tail-flick показала, что инъекция 2% раствора лидокаина в корень хвоста у мышей приводила к полному отсутствию реакции на лазерное воздействие в проксимальном участке хвоста в течение 15—25 мин и в дистальном участке хвоста в течение 10—25 мин после введения (рис. 1, 2).
Рис. 1. Результаты исследования влияния на время ответа в проксимальном участке хвоста 1% раствора гидрохлорида этеркаина, 2% гидрохлорида лидокаина и 4% Kolliphor ELP по методу tail-flick.
Рис. 2. Результаты исследования влияния на время ответа в дистальном участке хвоста 1% раствора гидрохлорида этеркаина, 2% гидрохлорида лидокаина и 4% Kolliphor ELP по методу tail-flick.
Инъекция 1% раствора гидрохлорида этеркаина в корень хвоста у мышей также приводила к полному отсутствию реакции на лучевое воздействие в проксимальном участке хвоста в течение 15—20 мин (см. рис. 1). При этом в дистальном участке хвоста длительность ответа в среднем не превышала 5 с в течение всего времени эксперимента — 60 мин (см. рис. 2). Инъекция растворителя — 4% Kolliphor ELP приводила к кратковременному (5-минутному) уменьшению чувствительности в проксимальном участке хвоста, после чего, с 10-й минуты и далее, длительность ответа в среднем не превышала 5 с в течение всего времени эксперимента. В дистальном участке хвоста длительность ответа в среднем не превышала 5 с в течение всего времени эксперимента (см. рис. 1, 2).
Оценка влияния аппликации препаратов на амплитуду M-ответа у животных всех групп показала, что до аппликации препаратов различий между ними не наблюдалось. Увеличение силы тока в 1,5 и 2 раза от пороговой у животных всех групп приводило к увеличению амплитуды M-ответа (табл. 1).
Таблица 1. Амплитуда M-ответа до аппликации лидокаина, растворителя и этеркаина
| № п/п | Группа и количество (n) животных | Амплитуда M-ответа при пороговой силе тока, мкВ | Амплитуда M-ответа при силе тока в 1,5 раза выше пороговой, мкВ | Амплитуда M-ответа при силе тока в 2 раза выше пороговой, мкВ |
| 1 | Лидокаин (n=8) | 3520,54 (2834,5; 4250,87) | 5708,28 (4182,41; 6180,09)** | 5601,98 (5267,79; 6306,02)** |
| 2 | Растворитель (n=8) | 2519,67 (1261,06; 4916,73) | 4614,46 (3826,16; 6589,71)* | 4723,77 (3418,03; 6665,9)* |
| 3 | Этеркаин (n=8) | 2189,97 (1687,71; 3762,07) | 3721,05 (3665,54; 4758,29)*** | 5002,99 (3549,11; 6423,57)*** |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей: Me (Q1; Q3). * — p=0,025, ** — p=0,017, *** — p=0,012 по сравнению с соответствующим значением при пороговой силе тока.
Аппликация 2% раствора лидокаина у всех животных приводила к увеличению пороговой силы тока на 0,25—0,75 мА. Это изменение сохранялось до конца эксперимента. У 3 (37,5%) крыс аппликация лидокаина блокировала M-ответ в течение всего эксперимента — 60 мин. У 5 (62,5%) животных M-ответ полностью блокировался от 30 мин (у 1 крысы) до 45 мин (у 4 крыс) (табл. 2).
Таблица 2. Влияние аппликации лидокаина, растворителя и этеркаина на амплитуду M-ответа и силу тока
| № п/п | Группа и число (n) животных | До аппликации | После аппликации | ||||||||
| 15 мин | 30 мин | 45 мин | 60 мин | ||||||||
| амплитуда M-ответа, мкВ | сила тока, mA | амплитуда M-ответа, мкВ | сила тока, mA | амплитуда M-ответа, мкВ | сила тока, mA | амплитуда M-ответа, мкВ | сила тока, mA | амплитуда M-ответа, мкВ | сила тока, mA | ||
| 1 | Лидокаин (n=8) | 3520,54 (2834,5; 4250,87) | 0,15 (0,1; 0,2) | — | — | 776,44 (776,44; 776,44) (n=1) | 1 (1;1) | 3257,08 (1976,65; 4236,74) (n=4) | 0,38 (0,3; 0,57) | 3500,34 (2370,63; 5410,13) | 0,45 (0,3; 0,5)# |
| 2 | Растворитель (n=8) | 2519,67 (1261,06; 4916,73) | 0,18 (0,1; 0,23) | 4243,45 (1860,34; 4831,75) | 0,13 (0,1; 0,2) | 2676,66 (1741,25; 4150,29) | 0,2 (0,1; 0,22) | 4263,35 (2010,08; 5597,18) | 0,2 (0,1; 0,22)++ | 4263,35 (2010,08; 5597,18) | 0,25 (0,13; 0,35)+++ |
| 3 | Этеркаин (n=8) | 2189,97 (1687,71; 3762,07) | 0,18 (0,13; 0,25) | 2883,86 (1424,61; 4030,32) | 0,23 (0,15; 0,35) | 2019,95 (862,66; 4696,91) | 0,27 (0,15; 0,4)## | 1493,06 (1010,98; 2758,53)## | 0,25 (0,13; 0,35) | 1325,83 (680,08; 3174,99)Х+# | 0,25 (0,13; 0,35) |
Примечание. Данные представлены в виде медианы, первого и третьего квартилей: Me (Q1; Q3). + — p=0,028, ++ — p=0,004, +++ — p=0,002 по сравнению с этими показателями в группе с аппликацией 2% лидокаина; х — p=0,036 по сравнению с этими показателями в группе с аппликацией растворителя; # — p=0,04, ## — p=0,03 по сравнению с этими показателями до аппликации.
Аппликация 1% раствора этеркаина (8 крысам) у 6 (75%) животных приводила к повышению исходных порогов на 0,08—0,15 мА (p=0,025 по сравнению с аппликацией растворителя). У 1 (12,5%) животного после аппликации исходное значение порога не менялось на протяжении всего эксперимента, но наблюдалось существенное снижение амплитуды M-ответа (мкВ) как при действии пороговой силы тока (p=0,0003), так и при увеличении силы тока в 1,5 и 2 раза (p=0,0004) по сравнению с первоначальными значениями. У 1 (12,5%) животного аппликация этеркаина не оказывала влияния ни на пороговую силу тока, ни на амплитуду M-ответа (см. табл. 2).
Аппликация растворителя (8 крысам) у 4 (50%) животных не приводила к изменению исходного порога (до аппликации препарата). У 3 (37,5%) животных после аппликации порог снижался на 0,05 мА, эти изменения сохранялись от 15 до 45 мин. У 1 (12,5%) животного порог увеличился на 0,08 мА, это изменение сохранялось до конца эксперимента (см. табл. 2).
Обсуждение
Изучение влияния управляемого светом местного анестетика этеркаина на реакцию хвоста у мышей в ответ на лучевое воздействие (tail-flick)
После инъекции препарата с двух сторон в корень хвоста исследовался ответ в двух точках — дистальной (модель проводниковой анестезии) и проксимальной (модель инфильтрационной анестезии). Было обнаружено, что 1% раствор гидрохлорида этеркаина в 4% Kolliphor ELP на модели инфильтрационной анестезии обладает активностью, сопоставимой с лидокаином, используемым в качестве препарата сравнения (см. рис. 1). Растворитель (4% Kolliphor ELP) вызывал кратковременную (на 5 мин) потерю чувствительности вблизи точки введения препарата, а с 10-й минуты чувствительность восстанавливалась.
При этом на модели проводниковой анестезии с использованием теста отдергивания хвоста у мышей (облучение на дистальном участке) 1% этеркаин не проявил статистически значимой анестетической активности, его эффект был сопоставим с эффектом растворителя (4% Kolliphor ELP), в отличие от 2% лидокаина, проявившего местноанестетический эффект вплоть до 30—35-й минуты после введения (см. рис. 2).
Изучение влияния управляемого светом местного анестетика этеркаина на ответ двуглавой мышцы бедра крысы (M-ответ) при электрической стимуляции седалищного нерва
Оценка влияния аппликации препаратов на амплитуду M-ответа у животных всех групп показала, что до аппликации препаратов различий между ними не наблюдалось. Увеличение силы тока в 1,5 и 2 раза от пороговой у животных всех групп приводило к увеличению амплитуды M-ответа (см. табл. 1).
Аппликация лидокаина через 45 и 60 мин существенно не влияла на амплитуду M-ответа по сравнению со значениями до аппликации (см. табл. 2). Через 15 мин у всех животных даже при максимальной силе тока в 1 мА M-ответ не фиксировался. Через 30 мин M-ответ наблюдали только у 1 (12,5%) животного. Аппликация растворителя не оказывала влияния на амплитуду M-ответа на протяжении всего эксперимента. Аппликация этеркаина через 45 и 60 мин снижала амплитуду M-ответа по сравнению с первоначальными значениями (p=0,03 и p=0,04 соответственно). Следует отметить, что через 60 мин наблюдения амплитуда M-ответа у этих животных была ниже по сравнению с таковой при аппликации лидокаина (p=0,028) и при аппликации растворителя (p=0,036).
Оценка пороговой силы тока показала, что исходные значения, до воздействия препаратов, у животных всех групп не различались. Через 30 мин у животных с аппликацией гидрохлорида этеркаина и через 60 мин у животных с аппликацией лидокаина наблюдали увеличение пороговой силы тока, по сравнению с первоначальной (p=0,03 и p=0,04 соответственно) (см. табл. 2).
Таким образом, гидрохлорид этеркаина в большинстве случаев снижал эффективность проведения импульсов по седалищному нерву. При этом эффект от аппликации этеркаина был существенно ниже по сравнению с местным анестетиком лидокаином.
Заключение
В рамках работы было исследовано действие 1% раствора местного анестетика этеркаина на моделях инфильтрационной и проводниковой анестезии с использованием мышей и крыс. Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения 1% раствора этеркаина в 4% Kolliphor ELP при поверхностной и инфильтрационной анестезии, однако возможность использования этеркаина при проводниковой анестезии ограниченна и требует дополнительных исследований.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.