Введение

Ключевая роль в развитии и поддержании боли тесно связана с участием P2X3-рецепторов [1, 2], которые активируются молекулой аденозинтрифосфата (АТФ), вырабатываемой митохондриями при излишней стимуляции. Активация P2X3-рецепторов приводит к открытию ионных каналов на клеточных мембранах, в результате чего изменяются мембранный потенциал и внутриклеточный метаболический баланс [3, 4]. Роль митохондрий в развитии боли изучена не в полной степени. Известно, что модуляция митохондриальной функции в сенсорных нейронах снижает гипералгезию в доклинических моделях нейропатической и воспалительной боли [5—7]. Генетические мутации в комплексе IV цепи переноса электронов способствуют развитию болевой гиперчувствительности [8]. Известно, что скорость потребления кислорода снижается в поясничных нейронах на пике воспалительной боли, вызванной каррагинаном, но снова увеличивается, когда боль проходит [9]. Исследователи полагают, что дефицит митохондриального дыхания может способствовать стойкой воспалительной и нейропатической боли [10]. Согласно данным литературы, как повышение, так и снижение интенсивности окислительного фосфорилирования приводит к боли [6, 11]. В связи с этим одним из актуальных направлений в поиске фармакологических стратегий лечения боли может быть ингибирование активности P2X3-рецептора.

Цель работы — изучить митохондриальное дыхание первичной смешанной культуры нейронов гиппокампа в условиях фармакологической блокады пуринорецептора P2X3.

Материал и методы

Животные. В работе использованы 2-дневные мыши линии CD-1, полученные от половозрелых самок. Животные были приобретены в филиале «Столбовая» ФГБУН «НЦБМТ ФМБА России» (сертификат №18980 от 23.05.2023) и содержались в условиях конвенционального вивария Белгородского государственного национального исследовательского университета (НИУ БелГУ) при температуре от +22 до +26. °C. Все эксперименты выполнены с соблюдением требований Хельсинкской декларации по гуманному обращению с животными (Хельсинкская декларация этических принципов, 2008) и директив Совета Европейского сообщества по защите животных, используемых в экспериментальных и других научных целях, одобрены комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных НИУ БелГУ (экспертное заключение №01и/23 от 23.01.2023).

Выделение культуры гиппокампа эмбрионов и новорожденных мышат. Выделение головного мозга новорожденной 2-дневной мыши проводили под общей анестезией путем внутрибрюшинного введения препарата золетил из расчета 20 мг/кг. Извлекали мозг и помещали его в чашку Петри с охлажденным PBS. Под бинокуляром («Leica», ×4) разделяли большие полушария головного мозга. Помещали гиппокамп на предметное стекло с лункой в каплю охлажденного PBS, измельчали гиппокамп на 6—8 частей и переносили ткань в пробирку с 0,25% раствором трипсин-ЭДТА. Ткань трипсинизировали в 0,25% растворе трипсин-ЭДТА («Gibco», 25200056) в течение 20 мин при 37°C, 5% CO₂ в инкубаторе Binder (Германия). После трипсинизации проводили трехкратную отмывку клеточной суспензии фосфатно-буферным раствором (pH 7,4). К полученной суспензии добавляли 2 мл нейробазальной среды («Gibco», 21103049), содержащей 2% добавки белка B-27 («Gibco», 17504044), 0,5 мМ L-Glutamax («Gibco», 25030081), 1% PenStrep («ПанЭко»).

Первичную смешанную культуру нейронов гиппокампа культивировали в 8-луночных планшетах для анализатора клеточного метаболизма Seahorse XF HS Mini («Agilent», США). Предварительно готовили планшеты. В канавки вокруг лунок вносили по 400 мкл стерильной дистиллированной воды. Культуральные лунки B—G покрывали 10 мкл poly-D-lysine в концентрации 0,01 мг/мл, в лунки коррекции фона A и H вносили по 180 мкл дистиллированной воды. Планшеты оставляли на 1 ч при 37 °C в термостате. После планшеты трижды промывали средой Дульбекко и покрывали 20 мкл культуральной нейробазальной среды, содержащей 2% добавки белка B-27, 0,5 мМ L-Glutamax, на 10 мин с выдержкой в термостате при 37 °C, затем среду отбирали, планшеты высушивали. Полученную первичную клеточную культуру высеивали в культуральные планшеты Cell Culture Miniplates («Agilent», USA) из расчета 4∙10⁵ в 80 мкл, доводили общий объем среды в ячейке до 180 мкл. Смену ¹/₂ порции среды осуществляли каждые 3 сут.

Фармакологическая блокада P2X3-рецептора. С целью фармакологической блокады P2X3-рецептора использовали высокоселективный блокатор 5-(5-йод-2-изопропил-4-метоксифенокси)пиримидин-2,4-диамин монохлоридная соль (Ro-4; «Sigma-Aldrich») в конечной концентрации 12 нМ. Выбор дозы препарата основан на известной для данного лиганда концентрации полумаксимального ингибирования (IC₅₀), которая, по данным литературы, составляет 3,16 нМ [12]. Блокатор вводили в культуральные планшеты за 24 ч до проведения метаболических тестов, в опытные ячейки (B, C, D) культуральных планшетов. В качестве контроля были ячейки (E, F, H) с культурой без препарата. Смену ¹/₂ порции среды на свежеприготовленную проводили в контрольных лунках за 24 ч до выполнения метаболических тестов параллельно с внесением блокатора P2X3-рецептора в опытные лунки.

Измерение параметров митохондриального дыхания. Для измерения параметров митохондриального дыхания готовили аналитическую среду DMEM Media, содержащую 1 М глюкозы в конечной концентрации 10 мМ, 100 мМ пирувата в конечной концентрации 1 мМ, 200 мМ L-глютамина в конечной концентрации 2 мМ. Нейробазальную среду в анализируемых планшетах заменяли аналитической средой и инкубировали в ней 1 ч при 37°C до проведения анализа. Затем измеряли базальное митохондриальное дыхание на анализаторе клеточного метаболизма Seahorse XF HS Mini («Agilent», США). Скорость потребления кислорода (OCR) в условиях действия блокатора P2X3-рецептора измеряли на 1, 5, 8, 11 и 14-е сутки дифференцировки.

Измерения выполнены на культуре клеток гиппокампа, полученных от 12 новорожденных мышат линии CD-1 на 2-й день после рождения. Каждая экспериментальная серия выполнена в 8 повторностях (8 планшетов для анализатора клеточного метаболизма). В каждом 8-луночном планшете три ячейки были отнесены к опытной группе (в них вводили блокатор) и три ячейки служили контролем (без блокатора). Две оставшиеся ячейки были фоном коррекции. В каждой опытной и контрольной ячейках выполнено по четыре технических измерения.

Анализ энергетического фенотипа. Оценку энергетического фенотипа нейронов проводили на 14-е сутки дифференцировки с использованием набора Cell Energy Phenotype (Kit 103325-100, «Agilent», США). В наборе использовали олигомицин (ингибитор АТФ-синтазы) в конечной концентрации 100 мкМ и FCCP (митохондриальный разобщитель) в конечной концентрации 100 мкМ. Концентрация стрессового раствора олигомицин/FCCP, которую вносили в порт картриджа, составляла 1,0/1,0 мкМ. Каждая серия выполнена в 8 повторностях. В каждом 8-луночном планшете три ячейки были отнесены к опытной группе (в них вводили блокатор) и три ячейки служили контролем (без блокатора). Две оставшиеся ячейки были фоном коррекции. В каждой опытной и контрольной ячейках выполнено по три технических измерения. По результатам измерений строили метаболические карты с помощью программного продукта Nova 1.3 (США) и Multi-File Seahorse XF Cell Energy Phenotype (США).

Статистический анализ. Результаты экспериментальных данных обработаны с использованием пакета описательной статистики Excel 10.0. Экспериментальные данные в таблицах представлены средним значением (M) и стандартным отклонением (SD). В исследовании выполнена проверка гипотезы о нормальном распределении. Учитывая, что все полученные числовые данные не подчиняются гипотезе нормального распределения, для оценки достоверности полученных результатов использован критерий Манна—Уитни для выборок с ненормальным распределением и числом n≤20. Для оценки достоверности данных с n>20 использован T-критерий Уилкоксона. В целом при изучении динамики митохондриального дыхания в опытной и контрольной группах на каждые сутки дифференцировки выполнено по 12 измерений в 8 повторностях. Таким образом, общее количество выполненных измерений составило 96. При изучении метаболического профиля нейроглиальной культуры было выполнено 9 измерений в 8 повторностях для каждой опытной и контрольной групп. Таким образом, общее количество измерений составило 72. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался равным 0,05.

Результаты

Клеточное дыхание постнатальной первичной смешанной культуры нейронов гиппокампа. Под влиянием блокатора пуринорецептора P2X3 установлены две разнонаправленные реакции в кинетике клеточного дыхания. Одна часть клеток демонстрировала интенсивное дыхание под влиянием блокатора начиная с 1-х суток дифференцировки, другая — снижение скорости потребления кислорода (см. таблицу).

Параметры клеточного дыхания первичной смешанной культуры нейронов гиппокампа в условиях блокады P2X3-рецептора (M±SD)

Примечание. M — среднее значение; SD — стандартное отклонение; DoD — сутки дифференцировки; n — количество измерений; OCR — скорость потребления кислорода; ECAR — скорость закисления среды; * — достоверные различия (p<0,05) по сравнению с контролем по T-критерию Уилкоксона при количестве измерений n=70; ** — достоверные различия (p<0,05) по сравнению с контролем по U-критерию Манна—Уитни при количестве измерений n=21.

Согласно данным, представленным в таблице, под влиянием блокатора пуринорецептора P2X3 в 1-е сутки дифференцировки скорость потребления кислорода и степень закисления среды возрастали соответственно на 18,8 и 16,7% (p<0,05) по сравнению с контролем. Интенсивное клеточное дыхание наблюдали также на 5, 8, 11 и 14-сутки дифференцировки — рост соответственно на 39, 32, 24 и 19% (p<0,05) по сравнению с контролем. Причем скорость закисления среды достоверно возросла лишь на 14-е сутки дифференцировки — на 15,6% (p<0,05) по сравнению с контролем.

У части клеточной популяции наблюдали снижение клеточного дыхания в ответ на блокаду P2X3-рецептора начиная с 5-х суток дифференцировки. Так, на 5-е сутки скорость потребления кислорода была снижена на 56% (p<0,05), на 8-е сутки — на 32% (p<0,05), на 11-е сутки — на 24% (p<0,05), на 14-е сутки — на 32% (p<0,05) по сравнению с контролем (см. таблицу).

Таким образом, в условиях блокады пуринорецептора P2X3 в постнатальной нейроглиальной культуре гиппокампа выявлены разнонаправленные реакции. У большей части клеточной популяции (в ≈73% измерений) отмечено усиление клеточного дыхания под действием блокатора пуринорецептора P2X3, у меньшей части (≈27% измерений) — снижение скорости потребления кислорода и степени закисления среды.

Фенотипический профиль постнатальной нейроглиальной культуры гиппокампа. Известно четыре биоэнергетических фенотипа, в которых может находиться клетка: состояние покоя — когда в клетке сведены к минимуму любые из метаболических путей; энергетический фенотип — когда клетка использует окислительное фосфорилирование и гликолиз; аэробный фенотип — когда клетка использует преимущественно митохондриальное дыхание; гликолитический фенотип — когда клетка использует преимущественно гликолиз. В выполненном исследовании изучен энергетический фенотип и построены метаболические карты, отражающие соотношение в метаболизме культуры окислительного фосфорилирования и гликолиза в физиологических условиях и при внесении стрессоров (смеси олигомицина и FCCP) на фоне блокады P2X3-рецептора. При внесении олигомицина блокируется работа АТФ-синтазы, вследствие чего не вырабатывается митохондриальная АТФ. В этих условиях клетка компенсаторно пытается удовлетворить свои энергетические потребности посредством гликолиза. FCCP управляет митохондриальным дыханием и является разобщителем, разъединяя транспорт электронов и процессы окислительного фосфорилирования, закачивая протоны внутрь митохондрии против градиента концентрации.

Согласно полученной карте метаболического профиля, в контрольной и опытной группах наблюдали смешанный тип дыхания — окислительное фосфорилирование и гликолиз, однако при блокаде АТФ-синтазы и введении разобщителя митохондриального дыхания в контрольной группе наблюдали переключение биоэнергетического фенотипа в область дыхательного покоя, а в опытной группе — в область энергетического фенотипа (см. рисунок).

Метаболическая карта энергетического фенотипа нейроглиальной культуры.

Обозначены области дыхания Аэробный — аэробное дыхание, Покой — дыхательный покой, Энергетический — клеточный метаболизма, основанный на смешанном дыхании окислительного фосфорилирования и гликолиза, Гликолиз — анаэробное дыхание. Серым цветом указана опытная группа, черным контрольная группа. Закрашенные квадратики обозначают дыхание до блокады цепи переноса электронов, не закрашенные квадратики означают дыхание после блокады цепи переноса электронов стрессорами.

Обсуждение

В выполненном исследовании изучена динамика клеточного дыхания первичной нейроглиальной культуры гиппокампа в норме и в условиях фармакологической блокады пуринорецептора P2X3. Постнатальная культура нейронов гиппокампа, полученная от 2-дневных новорожденных мышат, характеризуется высокой пластичностью и формированием сложных связей между нейронами [13], в связи с чем мы отмечали разнонаправленные реакции митохондриальной активности в норме и в условиях блокады P2X3-рецептора. С 1-х суток дифференцировки в культуре присутствовали клетки, которые реагировали на введение блокатора снижением дыхательной функции, в то время как большая часть клеток демонстрировала усиление клеточного дыхания в условиях блокады пуринорецептора P2X3. Фенотипический профиль постнатальной нейроглиальной культуры под влиянием блокатора P2X3 представлял смешанный тип дыхания, основанный на окислительном фосфорилировании и гликолизе, однако при выключении работы АТФ-синтазы олигомицином наблюдали снижение потребления кислорода и небольшое увеличение степени закисления среды, что указывает на включение компенсаторного механизма и переключение дыхания с аэробного на гликолитический тип.

Установленная в нашей работе разнонаправленная реакция клеточного дыхания, скорее всего, связана с реализацией различных сигнальных путей в нейронах и глиальных клетках. Выявленное нами переключение клеточного фенотипа на гликолитический тип дыхания в условиях блокады P2X3-рецептора наводит на мысль, что, скорее всего, глиальные клетки реагируют на блокаду P2X3-рецептора снижением скорости потребления кислорода. Согласно данным литературы, P2X3-рецепторы экспрессируются на терминале астроцитов [14]. Установлено, что астроциты функционируют без окислительного фосфорилирования in vivo, обеспечивают GSH-зависимый защитный эффект на нейроны, функционируют как нейтрализующие и циклические агенты глутаматергической/ГАМКергической передачи сигналов, а также являются синтезаторами/экспортерами биоэнергетических молекул для окислительного фосфорилирования (лактат/кетоновые тела) [15].

Усиление клеточного дыхания в ответ на блокаду P2X3-рецептора, скорее всего, присуще нейронам. Основной механизм такого ответа может быть связан с Ca²⁺-зависимым усилением окислительного фосфорилирования, что в дальнейшем приводит к увеличению синтеза АТФ [16]. Не исключено, что усиление кальциевого сигнала внутри нейрона обеспечено его притоком через другие лиганд-рецепторные каналы. В частности, в литературе известны работы, описывающие перекрестные взаимодействия между P2X3-рецептором и глутаматергическими (NMDA) рецепторами. Показано, что P2X3-рецептор влияет на Ca²⁺-зависимую активацию NMDA-рецептора в гиппокампе. Активация P2X3-рецептора ингибирует токи Ca²⁺ через NMDA [17]. При этом важным аспектом является тот факт, что пуринергические каналы могут увеличивать уровень внутриклеточного кальция, когда мембранный потенциал близок к уровню физиологического покоя, в отличие от NMDA-каналов, для работы которых нужна деполяризация мембраны и вход кальция [18]. Исследователи полагают, что взаимодействие между пуринергическими и ионотропными рецепторами направлено на пресинаптический контроль высвобождения нейротрансмиттеров с целью регуляции синаптической пластичности в гиппокампе [19]. Учитывая, что гиппокамп — ключевая структура мозга, связанная с формированием долгосрочной памяти, изменение активности ионотропных рецепторов — пуринергических и глутаматергических — может модулировать пластичность гиппокампа и зависящие от него обучение и память. Ингибирование P2X3-рецепторов усиливает индукцию долговременной памяти [16].

Заключение

В выполненном исследовании проанализирована динамика митохондриальной функции первичной смешанной культуры нейронов в условиях блокады пуринергического P2X3-рецептора. Доказано разнонаправленное воздействие блокады пуринорецептора P2X3 на метаболический профиль первичной смешанной нейроглиальной культуры гиппокампа. Полученные данные дополняют современные представления о роли пуринорецептора P2X3 в митохондриальной физиологии и могут быть использованы при поиске фармакологических стратегий, направленных на управление митохондриальной функцией и восстановление митохондриальной динамики, в качестве терапевтических вмешательств при болевых синдромах. Кроме того, полученные данные расширяют современные представления о механизмах воздействия высокоселективных блокаторов на физиологию клеточного дыхания нейронов.

Источник финансирования. Научное исследование проведено при поддержке Российского научного фонда (грант РНФ №23-24-00600).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.