Впервые фотодинамический эффект описан в работе О. Raab в 1900 г., в которой было показано, что в присутствии акридинового и некоторых других красителей парамеции погибают при освещении солнечным светом [23]. Позже H. von Tappeiner (1904) предложил термин «фотодинамическая реакция» для описания специфической фотохимической реакции, которая приводит к гибели биологических систем в присутствии красителя, поглощающего световое излучение, и кислорода [27].

Применение фотодинамического эффекта в онкологии берет свое начало с работы A. Policard в 1924 г., в которой было установлено, что при облучении УФ-светом некоторые злокачественные опухоли человека флуоресцируют в оранжево-красной области спектра. Данное явление объясняли наличием в опухолях эндогенных порфиринов [18]. Как показали современные исследования, накопление эндогенных порфиринов в некоторых типах злокачественных опухолей действительно может происходить на поздних стадиях их развития, распада и метастазирования [25]. В 1966 г. R. Lipson провел флуоресцентное детектирование и первое фотодинамическое лечение пациентки с раком молочной железы [14].

Первое клиническое исследование флуоресцентного эффекта при внутривенном использовании флуоресцеина во время нейрохирургических операций при опухолях головного мозга выполнено G. Moore и соавт. [17]. Авторы описали эффект накопления флуоресцеина в опухолевой ткани, что до появления методов нейровизуализации способствовало более точному определению локализации опухоли во время оперативного вмешательства. Накопление флуоресцеина было связано с нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера как в опухоли, так и в перифокальной ткани. По ряду причин этот метод, а также применение других красителей не получили широкого распространения в нейрохирургии [1, 4а, 5, 13].

Первые работы по использованию 5-аминолевулиновой кислоты (5-АЛК) в качестве препарата для фотодинамической диагностики относятся к 1979 г., когда Z. Malik и соавт. [15] применили 5-АЛК для исследования эритролейкемических клеток. Препарат использовался для диагностики опухолей кожи, слизистых, желчных и мочевых протоков, бронхов. В эксперименте на глиомах 9L и С6 в культуре и в мозге крыс было показано накопление опухолевыми клетками и синтез в них эндогенных порфиринов в присутствии 5-АЛК [10]. В дальнейшем было подтверждено, что более интенсивное накопление протопорфирина IX (ПпIX) в опухоли связано не только с увеличением проницаемости ткани для 5-АЛК, но и с усилением захвата 5-АЛК ее клетками, изменением активности ферментов, катализирующих трансформацию ПпIX в гем [11]. Результаты проспективных мультицентровых исследований показали, что применение флуоресцентного метода во время оперативных вмешательств позволяет увеличить частоту радикальной резекции контрастируемой на МР-томограмме части злокачественной глиомы по сравнению с традиционной микрохирургией (65 и 36% соответственно) при увеличении 6-месячной безрецидивной выживаемости (41,0% против 21,1%) [26]. Позже метод флуоресцентной навигации был одобрен Еврокомиссией для использования в нейрохирургии [16]. В 2008 г. были опубликованы результаты эффективного использования не только микроскопа, но и эндоскопа с флуоресцентными фильтрами в хирургии опухолей головного мозга различного генеза [22].

Однако в литературе [4, 19—21, 28] имеются лишь единичные сообщения о количественной и качественной оценке флуоресцентного эффекта в эксперименте и клинике.

Цель настоящей статьи — оценка результатов применения флуоресцентной диагностики и лазерной спектроскопии в хирургии глиом головного мозга разной степени злокачественности.

В исследование включены 99 пациентов (58 мужчин, 41 женщина) с глиомами головного мозга, оперированных с 2010 по 2012 г. в НИИ нейрохирургии им. акад. Н.Н. Бурденко РАМН с использованием флуоресцентной диагностики и лазерной спектроскопии. Средний возраст пациентов составил 47±15,64 года, минимальный возраст 17 лет, максимальный — 74 года. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом Института нейрохирургии; пациентов включали в исследование при условии получения информированного согласия с учетом противопоказаний, изложенных в работе W. Stummer и соавт. [26]. Метод не применяли при нарушении функции печени и почек с изменением соответствующих биохимических ферментов.

Критерии включения в исследование: возраст 16—75 лет, опухоли головного мозга, диагностированные по данным МРТ и КТ, индекс Карновского не менее 70. Среди пациентов данной серии глиомы Grade I отмечались у 2 пациентов; Grade II — у 11; Grade III — у 16; Grade IV — у 70. Большинство пациентов (83) были оперированы впервые, 16 — повторно в связи с продолженным ростом опухоли.

В исследовании был использован гидрохлорид 5-АЛК, выпускаемый ФГУП «ГНЦ «НИОПиК» (Москва, Россия). Препарат в виде белого кристаллического порошка растворяли в 150—200 мл воды при комнатной температуре в расчете 20 мг на 1 кг массы тела пациента. Полученный раствор пациенты принимали внутрь за 4 ч до начала удаления опухоли.

Все больные были оперированы с использованием микрохирургической техники. В 88 наблюдениях применялся операционный микроскоп Carl Zeiss OPMI Pentero с приставкой для флуоресцентной навигации; в 11 наблюдениях — микроскоп OPMI NC, а также эндоскоп Karl Storz со специальными светофильтрами для работы во флуоресцентном режиме c источником света 400 нм.

Помимо экспертной качественной оценки степени флуоресценции проводился компьютерный анализ спектров флуоресценции. Начиная с 2010 г., в рутинном порядке нами применялся лазерный спектроанализатор ЛЭСА-01-БИОСПЕК (ЗАО «БИОСПЕК», Москва, Россия). Для возбуждения АЛК-индуцированного ПпIX был использован гелий-неоновый лазер (длина волны 632,8 нм). Специальное программное обеспечение для получения и обработки спектральных сигналов позволяет в режиме реального времени оценивать уровень накопления протопорфирина в тканях. После визуальной оценки флуоресценции проводилась лазерная спектроскопия с вычислением показателей пиков ПпIX и величин флуоресцентного контраста для каждого участка с параллельным взятием множественных биоптатов с целью количественной оценки флуоресценции опухолевой ткани, переходной зоны, зоны некроза в сопоставлении с интактным мозговым веществом.

Спектры, получаемые таким образом, имеют два основных максимума: максимум рассеянного тканью света от лазера с длиной волны 632,8 нм и максимум спектра флуоресценции, соответствующий пику флуоресценции ПпIX в ближнем инфракрасном диапазоне (около 705 нм). В качестве диагностического критерия использовалась величина флуоресцентного контраста, представляющая собой отношение интенсивности флуоресценции измененной ткани к интенсивности флуоресценции нормальной ткани мозга. Таким образом, можно нивелировать влияние индивидуальных физиологических особенностей конкретного пациента. После операции ведение пациентов осуществлялось по стандартной схеме. В течение 48 ч после операции соблюдался режим защиты от прямых солнечных лучей во избежание фотосенсибилизации кожи и сетчатки. У всех больных выполняли биохимические исследования ферментов сыворотки крови для оценки состояния печени и почек в послеоперационном периоде.

В среднем видимая флуоресценция и достоверное повышение уровня спектров среди 99 пациентов с опухолями глиального ряда отмечались у 68% (табл. 1).

Только видимая флуоресценция отмечалась в среднем у 68% пациентов с глиомами головного мозга, при использовании лазерной спектроскопии чувствительность метода возрастает до 74% за счет группы опухолей Grade III—IV (n=6), где отсутствовала видимая флуоресценция, но отмечалось достоверное повышение уровня спектральных характеристик. Часть пациентов из данной подгруппы составляли пациенты с продолженным ростом глиом Grade III—IV после лучевой терапии [2]. Вероятно, на фоне постлучевого радионекроза отсутствовало значительное накопление препарата в опухоли, достаточное для индукции видимой флуоресценции.

Общее впечатление хирургов о новой методике было положительным, поскольку флуоресцентная навигация увеличивает точность определения границ опухоли, которые не всегда видны в белом свете, повышая радикальность удаления, а применение лазерной спектроскопии позволяет получать быстрый ответ о метаболическом статусе исследуемой ткани, что особенно важно при отсутствии видимой флуоресценции. Безусловно, имелись и недостатки: увеличение длительности операции на 10—60 мин, применение дополнительного хирургического оборудования и необходимость затемнения операционной, что повышает зрительную нагрузку на персонал. Кроме того, для адекватного осмотра полости в режиме флуоресценции требовался удовлетворительный гемостаз, поскольку кровь препятствует визуализации флуоресцирующих зон.

В нашей серии осложнений, связанных как с применением препарата, так и с хирургическим вмешательством, зафиксировано не было. На фоне строгого контроля явлений фотосенсибилизации ни одного случая развития данного осложнения не было зарегистрировано. У 5 пациентов отмечалось бессимптомное транзиторное повышение в 2—3 раза уровня ферментов печени, регрессировавшее в течение 2—3 дней.

В нашей серии оказались двое пациентов с пилоидными астроцитомами (Grade I), в обоих наблюдениях отмечалась видимая флуоресценция и повышение уровня спектров от ПпIX. По нашим данным, отсутствие видимой флуоресценции и достоверного повышения уровня спектральных характеристик при лазерной спектроскопии отмечалось у 5 из 11 пациентов с глиомами Grade II (как правило, при диффузных астроцитомах). В то же время видимая флуоресценция отмечалась у 6 из 11 пациентов с глиомами Grade II (в данную подгруппу входили пациенты с олигодендроглиомами и смешанными глиомами — олигоастроцитомами (Grade II). На рис. 1, 2

Следующий клинический пример демонстрирует, что в начале операции отмечается интенсивная видимая гомогенного типа флуоресценция опухоли у пациента с олигодендроглиомой Grade II, выходящей на кору лобной доли (рис. 3).

В группе из 86 пациентов с глиомами Grade III—IV видимая флуоресценция наблюдалась у 59 (67,8%) пациентов, причем спектральный анализ показал повышение значений спектральных характеристик у 64 (73,5%). Отсутствие видимой флуоресценции и достоверного повышения уровня спектров отмечалось у 28 (32,2%) пациентов с глиомами Grade III—IV. Как правило, видимая флуоресценция носила неоднородный характер — «пятнистого» типа (одиночные или множественные очаги), реже отмечался гомогенный однородный характер свечения. Вероятно, при наличии «пятнистого» типа флуоресценции очаги свечения соответствуют анапластическим фокусам опухоли, что соответствует данным других авторов [8]. Интенсивность видимой флуоресценции у разных пациентов варьировала от слабо-розовой до ярко-красной (рис. 5, 6).

С 2010 г. с целью объективизации оценки флуоресценции мы стали применять лазерный спектроанализатор, во всех случаях сопоставляя спектры опухоли и здоровых тканей до и после удаления. Преимущество спектроанализа заключается в том, что он позволяет выявить флуоресценцию ткани при наличии умеренного количества крови, а также в отсутствие видимой флуоресценции определяет ее уровень. Благодаря чему было обнаружено, что даже визуально «нефлуоресцирующие» опухоли на самом деле обладают определенным уровнем флуоресценции. Суммарный анализ серии из 70 операций у пациентов с глиомами Grade IV WHO, в ходе которых флуоресцентная навигация была дополнена лазерной спектроскопией, показал наличие четкой стратификации спектров по уровням в зависимости от объекта (опухолевая ткань, некротическая ткань, перифокальная зона, здоровый мозг), что составляет картину соответствия определенных уровней спектров конкретным видам ткани (табл. 2).

В местах видимой флуоресценции во всех случаях получены высокие спектры накопления ПпIX. Никогда не отмечалось видимой флуоресценции и накопления ПпIX в зоне некроза. По мере дальнейшего удаления опухоли интенсивность видимой флуоресценции снижается, однако показатели лазерной спектроскопии позволяют выявлять накопление ПпIX даже в видимо нефлуоресцирующих зонах опухоли, что иногда служило основанием для продолжения удаления при условии физиологической дозволенности. Это свидетельствует о большей чувствительности видимой флуороскопии, дополненной лазерной биоспектроскопией в хирургии глиом высокой степени злокачественности.

У всех пациентов в процессе выполнения лазерной спектроскопии проводились множественные биопсии из разных участков опухоли (общее число биопсий 410). На основании исследования, проведенного у 70 пациентов с глиобластомами, были вычислены средние значения показателей спектральных характеристик различных участков опухоли и неизмененного мозга (см. табл. 2) и статистические различия между ними (табл. 3).

Таким образом, в группе пациентов с глиобластомами получены достоверные различия показателей спектральных характеристик между опухолевой тканью и неизмененной мозговой тканью, опухолевой тканью и зоной некроза, мозговой тканью и перифокальной зоной, некрозом и перифокальной зоной.

Принципы флуоресцентной диагностики в хирургии глиом были подробно изложены J. Tonn и W. Stummer [29] в 2008 г. Использование интраоперационной флуоресцентной диагностики в хирургии глиом имеет ряд преимуществ, среди которых можно отметить следующие:

1) в хирургии глубинно расположенных глиом 5-АЛК флуоресценция используется как вспомогательная навигация [24];

2) более интенсивная визуализация анапластических участков глиом [8];

3) интраоперационная визуализация при продолженном росте глиом высокой степени злокачественности после предшествующего адъювантного лечения [12];

4) при локализации опухоли вблизи желудочковой системы использование 5-АЛК позволяет выявить опухолевые клетки в стенках желудочков даже при отсутствии видимой инвазии их стенок [9]. На основании наших исследований установлено, что неизмененная стенка бокового желудочка в норме слабо флуоресцирует в режиме BL 400, вероятно, вследствие того, что субэпендимарная зона боковых желудочков является областью нейрогенеза в головном мозге человека.

Полученные данные о применении флуоресцентной диагностики у пациентов с глиомами головного мозга дают основания полагать, что методика в силу высокой специфичности и чувствительности позволяет лучше оценить границы опухоли, а также, возможно, достичь большей радикальности и избежать излишней резекции окружающих тканей, которая может обусловливать риск послеоперационных осложнений. Использование интраоперационного лазерного спектроанализа дает более полную информацию о степени накопления фотосенсибилизатора в исследуемой ткани, что повышает чувствительность метода. Метод может быть полезен у пациентов как с глиомами Grade I—II, так и с глиомами Grade III—IV, а также в хирургии глиом головного мозга с продолженным ростом. Таким образом, метод продемонстрировал определенную эффективность в хирургии глиом. Современная метаболическая «навигация» предоставляет хирургу возможность быстрой оптической дифференциации тканей в операционной ране, выявления зон повышенного накопления ПпIX, что в свою очередь позволяет при необходимости быстро менять операционную тактику.

Безусловно, у методики имеются и недостатки, такие как увеличение длительности операции на 10—60 мин, применение дополнительного оборудования и наличие квалифицированного специалиста, владеющего методом. Кроме того, для адекватного осмотра полости в режиме флуоресценции требовался удовлетворительный гемостаз, поскольку кровь препятствует визуализации флуоресцирующих зон. При работе во флуоресцентном режиме возрастает вероятность повреждения сосудов, визуализация которых ухудшается по сравнению с обычным режимом работы в белом свете. Кроме того, необходима адаптация световосприятия хирурга через оптический микроскоп к работе во флуоресцентном режиме, затемнение операционной, что повышает зрительную нагрузку на сотрудников. Необходимо учитывать и латентность световосприятия хирурга через оптический микроскоп для работы в режиме BL 400 при переключении световых режимов микроскопа. С точки зрения безопасности, удаление опухолей вблизи функционально значимых зон и крупных мозговых сосудов требует особой предосторожности. Несмотря на то что операционный микроскоп Carl Zeiss OPMI Pentero позволяет настроить яркость и контрастность изображения так, чтобы было удобно удалять опухоль во флуоресцентном режиме, данные манипуляции следует производить с осторожностью, особенно в отношении крупных сосудистых структур, которые с целью профилактики повреждения желательно выявлять в режиме белого света. Мы рекомендуем использовать интраоперационный электрофизиологический мониторинг и нейронавигацию в качестве дополнительных методик, уменьшающих риск возникновения послеоперационного неврологического дефицита.

Методика лазерной спектроскопии может использоваться и в хирургии нефлуоресцирующих опухолей головного мозга, помогая выявить границы инфильтративной растущей глиомы, когда стандартные методы флуоресценции неэффективны [30]. Результаты наших исследований и данные других авторов [7] свидетельствуют о том, что использование лазерной спектроскопии позволяет уменьшить частоту ошибок в ходе операции при идентификации злокачественных глиальных опухолей (Grade III—IV), а также некоторых доброкачественных опухолей (Grade I—II), накапливающих 5-АЛК. На наш взгляд, наибольшей способностью к накоплению 5-АЛК среди глиом Grade I—II обладают пилоидные астроцитомы, олигодендроглиомы, смешанные глиомы и опухоли с кистозным компонентом. Методика лазерной спектроскопии требует дальнейшего изучения и модификации с целью повышения ее чувствительности при доброкачественных глиомах [3, 16]. Для оценки влияния интраоперационной флуоресцентной диагностики на улучшение результатов хирургии глиом необходимо проведение дальнейшего клинического исследования.

1. Флуоресцентную навигацию следует использовать при удалении глиом с целью контроля границ распространения опухоли и дифференцирования опухолевой ткани от интактной или ишемизированной мозговой ткани. Чувствительность метода составляет 61,5% среди глиом Grade I—II и 67,8% у пациентов с глиомами Grade III—IV.

2. Среди глиом Grade I—II наибольшей способностью к накоплению препарата обладают олигодендроглиомы, смешанные глиомы и опухоли с кистозным компонентом (пилоидные астроцитомы).

3. В ходе оперативного вмешательства при удалении глиом головного мозга может наблюдаться изменение характера видимой флуоресценции и ее исчезновение при сохранении высокого сигнала от ПпIX по данным лазерной спектроскопии.

4. Использование лазерной спектроскопии повышает чувствительность метода до 74% у пациентов с глиомами Grade III—IV, что особенно важно в хирургии глиом с продолженным ростом.

5. Метод лазерной биоспектроскопии позволяет получать достоверные различия между уровнем накопления 5-АЛК в различных участках глиобластом.

6. Применение 5-АЛК безопасно и не вызывает нежелательных реакций при соблюдении критериев отбора пациентов, в особенности с сопутствующей соматической патологией.

Коллективом авторов под руководством акад. РАН и РАМН проф. А.А. Потапова представлены результаты применения интраоперационной флуоресцентной диагностики и лазерной спектроскопии в хирургии глиом головного мозга различной степени злокачественности.

В результате проведенных исследований на примере 99 пациентов с внутримозговыми опухолями Grade I—IV установлено, что видимая флуоресценция наблюдается в 68% случаев, при использовании лазерной спектроскопии чувствительность метода увеличивается до 74% за счет того, что часть видимо нефлуоресцирующих опухолей при спектральном анализе обладает определенным накоплением протопорфирина IX. Кроме того, авторами показано, что в ходе оперативного вмешательства при удалении глиом головного мозга может наблюдаться изменение характера видимой флуоресценции и ее исчезновение при сохранении высокого сигнала по протопорфирину IX по данным лазерной спектроскопии. На примере глиобластом авторами показаны средние значения и статистические различия между различными участками глиобластомы: опухолевой тканью, зоной некроза, перифокальной зоной в сравнении с неизмененным мозгом. Было бы интересно провести измерение показателей лазерного сигнала в сопоставлении с данными о концентрации опухолевых клеток при удалении от первичного очага в перифокальной зоне с учетом их гистологического строения.

Показаны преимущества метода комбинированной спектроскопии с параллельной регистрацией оксигенации, светорассеяния и аутофлуоресценции тканей, что особенно важно в хирургии нефлуоресцирующих глиом. Необходимо проведение дальнейших исследований в направлении комбинированной спектроскопии.

В будущем необходимо изучение причин отсутствия флуоресцентного эффекта в 32% случаев у пациентов с внутримозговыми опухолями на основе иммуногистохимических исследований.

В целом работа является весьма актуальной и востребованной в нейроонкологии, а также открывает существенные перспективы в изучении одного из самых сложных и малоизученных направлений в нейрохирургии.

Проф. О.Н. Древаль (Москва)