Авдонина1 М.А.

1. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; 2. Институт молекулярной генетики РАН; 3. Научно-исследовательский институт цереброваскулярной патологии и инсульта Российского национального исследовательского медицинского университета (РНИМУ) им. Н.И. Пирогова, Москва

Наседкина1 Т.В.

Иконникова1 А.Ю.

Бондаренко2 Е.В.

Сломинский2 П.А.

Шамалов3 Н.А.

Шетова3 И.М.

Лимборская2 С.А.

Заседателев1 А.С.

Скворцова3 В.И.

Исследование ассоциаций полиморфных маркеров генов F12, PON1, PON2, NOS2, PDE4D, HIF1a, GPIba, CYP11B2 с ишемическим инсультом среди русского населения Центральной России

Журнал: Медицинские технологии. Оценка и выбор. ;(): 51-54

Просмотров : 22

Загрузок :

Как цитировать

Авдонина1 М. А., Наседкина1 Т. В., Иконникова1 А. Ю., Бондаренко2 Е. В., Сломинский2 П. А., Шамалов3 Н. А., Шетова3 И. М., Лимборская2 С. А., Заседателев1 А. С., Скворцова3 В. И. Исследование ассоциаций полиморфных маркеров генов F12, PON1, PON2, NOS2, PDE4D, HIF1a, GPIba, CYP11B2 с ишемическим инсультом среди русского населения Центральной России. Медицинские технологии. Оценка и выбор. ;():51-54.

Авторы:

Авдонина1 М.А.

1. Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН; 2. Институт молекулярной генетики РАН; 3. Научно-исследовательский институт цереброваскулярной патологии и инсульта Российского национального исследовательского медицинского университета (РНИМУ) им. Н.И. Пирогова, Москва

Все авторы (10)

В настоящее время сосудистые заболевания головного мозга остаются актуальной медицинской, социальной и экономической проблемой [2, 3, 9]. Возникновение инсульта, как и любого другого сердечно-сосудистого заболевания, зависит от определенных факторов риска, оценка действия которых позволяет прогнозировать вероятность инсульта у каждого больного, а воздействие на эти факторы является важной мерой профилактики острых нарушений мозгового кровообращения (ОНМК). Доказанными и модифицируемыми факторами риска инсульта являются артериальная гипертензия, курение, сахарный диабет, дислипидемия, фибрилляция предсердий, стеноз каротидных артерий, ожирение, малоподвижный образ жизни и ряд других [4].

Систематические эпидемиологические исследования показали, что в развитии цереброваскулярных заболеваний важную роль играют также генетические факторы [8]. Показана ассоциация полиморфных вариантов различных генов с риском развития инсульта как в мировых популяциях [18], так и в России [6, 7].

Целью данного исследования был анализ частоты полиморфных маркеров генов F12, PON1, PON2, NOS2, PDE4D, HIF1a, GPIba, CYP11B2 в группах русских больных с ишемическим инсультом (ИИ) и здоровых доноров того же пола и возраста. Для одновременного определения множества однонуклеотидных полиморфных маркеров (ОНПМ) была использована технология биочипов [1].

Материал и методы

В исследование включали больных с ИИ, последователь­но поступавших в неврологическую клинику РНИМУ им. Н.И. Пиро­гова. Критериями включения являлись первый в жизни ИИ у пациентов в возрасте от 18 лет и старше, а также поступление в клинику в острейшем периоде заболевания (первые 3 сут). Всего обследовали 200 больных с ИИ в возрасте от 34 до 93 лет, 118 (59%) мужчин и 82 (41%) женщин. Также была сформирована контрольная группа здоровых доноров, которую составили 198 этнических русских — жителей различных регионов Центральной России, из них 86 (43,4%) мужчин и 112 (56,6%) женщин, средний возраст 57±5 лет. Все участники исследования (или их родственники) подписывали форму информированного согласия и заполняли предложенные им анкеты, сообщив место рождения и этническое происхождение до третьего колена. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

У пациентов с ИИ степень выраженности неврологической симптоматики оценивали при поступлении в клинику по шкале инсульта NIH [12]. Всем пациентам выполняли компьютерную томографию (КТ) головного мозга при поступлении в стационар, при необходимости — на 3—5-е сутки. На основании данных клинической картины, результатов КТ и ультразвуковых методов исследования брахиоцефальных сосудов (дуплексное сканирование, микроэмболодетекция) и сердца (эхокардиография) устанавливали патогенетический вариант инсульта в соответствии с критериями TOAST [14].

ДНК выделяли из крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции [5]. Олигонуклеотиды для иммобилизации на биочипе синтезировали на автоматическом синтезаторе 394 DNA/RNA Synthesizer («Applied Biosystems», США) с использованием стандартной фосфоамидитной процедуры. На 3'-конце олигонуклеотидов находился спейсер со свободной аминогруппой, который вводили при синтезе с помощью 3'-Amino-Modifier C7 CPG 500 («Glen Research», США). Нуклеотидные последовательности могут быть получены у авторов по запросу. Биочипы изготовлены с помощью фотоиндуцируемой совместной полимеризации олигонуклеотидов и компонентов полиакриламидного геля [1].

Для наработки фрагментов ДНК использовали двухэтапную мультиплексную полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Праймеры подбирали с использованием программы Oligo 6 («Molecular Biology Insights», США). Последовательности праймеров могут быть получены у авторов. Первый этап ПЦР проводили для получения ПЦР-продукта с геномной ДНК с использованием набора Амплификация ДНК с Taq полимеразой («Силекс», Россия) согласно протоколу. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 5 пкмоль каждого праймера и матрицу в количестве не менее 10 нг геномной ДНК. Реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94 °С (5 мин), далее 35 циклов амплификации по схеме: 94 °С, 30 с; 60 °С, 30 с; 72 °С, 1 мин; далее 72 °С, 5 мин.

На втором этапе проводили асимметричную ПЦР. Реакционная смесь содержала прямой праймер в количестве 5 пкмоль, обратный праймер по 50 пкмоль, а также флуоресцентно меченный дезоксинуклеотидтрифосфат Сy5-дУТФ. В качестве матрицы использовали 2 мкл ПЦР-продукта первого этапа. Реакцию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация ДНК при 94 °С (5 мин), далее 35 циклов амплификации по схеме: 94 °С, 30 с; 62 °С, 30 с; 72 °С, 1 мин; далее 72 °С, 5 мин.

Полученные на втором этапе мультиплексной ПЦР флуоресцентно меченные продукты использовали для гибридизации на биочипе. Гибридизационная смесь общим объемом 40 мкл состояла из 10 мкл формамида («Serva», США), 10 мкл 20х SSPE («Promega», США) и 20 мкл амплификата (по 4 мкл образца из каждой мультиплексной реакции). Гибридизационную смесь полностью денатурировали при 95 °С (5 мин), быстро охлаждали на льду (1 мин), наносили на биочип и оставляли на ночь при 37 °С. Затем чип отмывали в 1x SSPE в течение 10 мин при комнатной температуре и высушивали.

Флуоресцентный сигнал ячеек биочипа регистрировали с помощью портативного анализатора биочипов, снабженного ПЗС-камерой и программным обеспечением Imageware («Биочип-ИМБ», Россия) [1].

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI Prism Genetic Analyzer 3100 («Applied Biosystems», США).

При статистическом анализе полученных данных (GraphPad InStat) для проверки соответствия распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди—Вайнберга использовали стандартный метод &khgr;2. С целью определения сочетаний ОНПМ, определяющих повышенный и пониженный риск развития инсульта, проводили двусторонний точный тест Фишера с использованием интерактивной таблицы сопряженности и вычисляли значения OR (odds ratio, отношение шансов) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Критический уровень статистической значимости принимали равным 0,05.

Результаты и обсуждение

Для проведения генотипирования разработан биочип, содержащий олигонуклеотидные зонды для анализа полиморфных маркеров следующих генов: F12 (rs1801020 — по базе данных SPN), PON1 (rs662), PON2 (rs1801282), NOS2 (rs2297518), PDE4D (rs966221, rs2910829), HIF1a (rs11549465, rs11549467), GPIba (rs2243093), CYP11B2 (rs1799998). Схема биочипа и пример гибридизационной картины представлены на рисунке, А и Б.

Схема биочипа и картина гибридизации.
Примечание. А - схема расположения зондов в ячейках биочипа (ячейки темного цвета соответствуют последовательности дикого типа; ячейки белого цвета - мутантным последовательностям); каждая ячейка продублирована; Б - пример гибридизационной картины образца ДНК здорового донора.
Схема биочипа и картина гибридизации.

]]>

При анализе картин гибридизации рассчитывали интенсивность сигнала флюоресценции в ячейке по отношению к фону. Далее для каждой гибридизационной картины получали диаграмму значений сигналов флюоресценции ячеек биочипа, нормированных на значение максимального сигнала в паре ячеек «дикий тип — мутация» (Imin/Imax, рисунок, В).

Схема биочипа и картина гибридизации.

]]>
Примечание. В - диаграмма значений флуоресцентных сигналов.
Если уровни сигнала в ячейках с зондами «дикого типа» и с «мутацией» различались не более чем на 30% (верхняя пунктирная линия на рисунке, В), считалось, что генетический маркер находится в гетерозиготном состоянии. Если сигнал от ячейки с зондом «дикого типа» был равен максимальному значению, а от ячейки с «мутацией» составлял менее 30% от максимального уровня (нижняя пунктирная линия) для данной пары зондов, считалось, что аллель «дикого типа» находится в гомозиготном состоянии. Соответственно, обратная картина наблюдалась для гомозиготы по «мутации». Верификация результатов гибридизации была проведена путем сравнения результатов определения генотипов с использованием разработанного биочипа и выборочного секвенирования исследованных образцов (рисунок, Г).
Схема биочипа и картина гибридизации.

]]>
Примечание. Г - генотип образца.
Результаты гибридизации полиморфных ДНК маркеров на биочипе полностью совпали с результатами секвенирования.

Наблюдаемое распределение частот генотипов остальных изученных генов во всех группах обследованных больных и здоровых соответствовало равновесию Харди—Вайнберга. Отклонение от равновесия Харди—Вайнберга выявлено лишь в случае полиморфного маркера rs11549467 гена HIF1a для группы больных с ИИ. Тем не менее частоты аллелей в группе больных с ИИ и здоровых не отличались. Частота аллеля G составила 97,5%, аллеля A — 2,5%, что соответствует базе данных National Center for Biotechnology Information [15]. Для подтверждения полученных результатов все 18 образцов ДНК, содержащие минорный аллель, были просеквенированы. Поскольку аллель A (rs11549467) гена HIF1a является достаточно редким, отклонения от равновесия Харди—Вайнберга могут быть связаны с недостаточной величиной выборки.

Результаты по определению частоты аллелей в группах больных и здоровых представлены в таблице.

Таблица1

]]>
Достоверных различий в распределении частот аллелей между группами для всех 10 исследованных ОНПМ в контрольной группе в сравнении с группой больных с ИИ не выявлено, что соответствует результатам проведенных ранее исследований [10].

Далее проводили анализ межгенных взаимодействий в группе больных с ИИ в сравнении с группой здоровых доноров. Сравнительный анализ парных сочетаний генов в двух группах показал, что комбинация генотипов PON1A/-x PON2 GG достоверно чаще встречается в группе больных (p=0,044, OR=3,4, 95% CI 1,06—10,4) и, таким образом, ассоциирована с повышенным риском развития заболевания.

Ранее в ряде работ была показана достоверная ассоциация генов PON1 и PON2 как самостоятельных факторов риска, так и сочетаний их аллелей с развитием ИИ [12,13,16, 17,19]. Гены семейства PON кодируют параоксаназы, обладающие антиоксидантной активностью и защищающие клетки от оксидантного стресса. Белок PON1 обнаруживается в сыворотке крови, где ассоциирован с липопротеинами высокой плотности (ЛПВП) и предположительно участвует в их взаимодействии с липопротеинами низкой плотности (ЛПНП). В многомерном анализе, включающем возраст, пол, уровень ЛПНП, гипертонию, диабет, курение и лечение правастатином [19], выявлена ассоциация замены Gln/Arg (A>G) аминокислотного остатка 192 гена PON1 с возникновением инсульта. Параоксаназа 2 (PON2) является внутриклеточным ферментом, в плазме крови белок не обнаружен. Тем не менее замена серина на цистеин 311Ser/Cys (C>G) приводит к повышению уровня холестерина и ЛПНП, что является фактором риска развития инсульта. Гомозиготность по аллелю 311Cys ассоциирована с более тяжелым течением инсульта [17]. В настоящей работе выявлено, что негативное влияние гомозиготного генотипа 311GG(Cys) гена PON2 проявляется именно в сочетании с «нормальным» аллелем 192Gln PON1, что указывает на важность анализа гаплотипов.

Настоящие результаты, полученные на русской популяции жителей различных регионов Центральной России, согласуются с многочисленными зарубежными и отечественными исследованиями, в которых было показано, что нарушения в функционировании антиоксидантной системы могут лежать в основе большинства известных сегодня мультифакториальных заболеваний, в том числе и инсульта. Обнаружение генетических маркеров инсульта позволит повысить возможность проведения адекватного патогенетического лечения и разработать эффективные основы профилактики ОНМК.

Работа выполнена в рамках Государственного контракта №№02.522.11.2018 с Министерством образования и науки РФ.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail