Эпидемиологическую ситуацию в Российской Федерации по клещевому энцефалиту (КЭ) и иксодовым клещевым боррелиозам (ИКБ) характеризует их распространенность. На протяжении последней четверти ХХ века заболеваемость этими инфекциями неуклонно росла [7]. Вовлечение в процесс нервной системы при данных заболеваниях усложняет диагностику и изучение микст-инфекции (МИ) [5, 8].

Известно, что нейроглиальные элементы мозга — астроциты, олигодендроциты и микроглия — активно участвуют в инициации воспаления и в иммуноопосредованных механизмах повреждения нервных клеток. Исходом нейрональной дисфункции являются два механизма гибели клеток — некроз и апоптоз. В последние десятилетия создан банк данных о роли свободнорадикального соединения окиси азота (NO) в механизмах повреждения нейронов с образованием пероксинитрит-аниона, который блокирует ряд нейрональных рецепторов и инактивирует фермент супероксиддисмутазу, что вызывает усиление свободнорадикального окисления, приводящего к гибели клетки [3, 9, 16]. Источником NO в ЦНС являются глутаматные нейроны, клетки микроглии, астроциты, а также эндотелиоциты сосудов. Отростки нейронов, содержащих нейрональную NO-синтазу (NOS), столь широко разветвлены, что практически все нейроны ЦНС располагаются в пределах нескольких мкм от источника NO. Нейрональный оксид азота участвует в системе внутри- и межклеточной сигнализации, воздействуя на клетки глии или окружающие нейроны [10]. В ЦНС роль NO в качестве нейромедиатора и/или вторичного мессенджера во многом связана с действием возбуждающей аминокислоты глутамата [3]. Снижение содержания цитоплазматического цГМФ при активации клеточных рецепторов глутаматом и его производными является NO-зависимым процессом. При этом в зависимости от уровня продукции NO это соединение может как ингибировать, так и потенцировать высвобождение глутамата и аспартата. Кроме того, NO контролирует осцилляторную активность нейронов [18], но вместе с тем может вызывать гибель посредством апоптоза корковых нейронов и астроцитов [11—13].

Большинство из разработанных веществ, обладающих NO-модулирующими свойствами, находится на стадии экспериментальных исследований и доклинических испытаний. В то же время предполагается, что применение как экзогенных доноров NO-групп, так и ингибиторов продукции оксида азота может представлять собой потенциальные фармакотерапевтические стратегии [14, 17]. Современные терапевтические подходы, базирующиеся на принципах энергокоррекции, позволяют сбалансировать энергетику клетки и активизировать защитные механизмы, повышающие резистентность к оксидантному стрессу за счет активации собственных антиоксидантных систем. Они рассматриваются в настоящее время как эффективные и реально существующие методы нейропротекции. Одним из лекарственных препаратов с антиоксидантной активностью является цитофлавин. Препарат относится к группе «метаболических средств», выпускается в форме раствора для внутривенного введения. В состав цитофлавина входят следующие активные компоненты: кислота янтарная 100 мг, никотинамид 10 мг, рибоксин 20 мг, рибофлавина мононуклеотид 2 мг.

Цель настоящего исследования — количественное изучение клеточных и молекулярных маркеров иммуно­опосредованного воспаления в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и сыворотке крови у больных с клещевыми нейроинфекциями для уточнения патогенеза развития воспаления в ЦНС и обоснования патогенетически ориентированных методов коррекции выявленных нарушений.

За период 2002—2009 гг. были обследованы 537 больных с различными клиническими формами инфекций, передающихся иксодовыми клещами. Исследование проводилось среди пациентов, госпитализированных в клинику кафедры инфекционных болезней Челябинской государственной медицинской академии, городской центр нейроинфекций, а также в 1-е и 4-е инфекционные отделения Городской клинической больницы №8 Челябинска.

Для углубленного исследования процессов иммуно­опосредованного воспаления в ЦНС и эффективности антиоксидантных препаратов были отобраны 70 больных в возрасте от 28 до 60 лет с этиологически верифицированными клиническими формами клещевых нейроинфекций: 42 пациента — с менингеальными формами КЭ, 8 — с очаговыми формами КЭ, 15 — с клещевой МИ (сочетанием безэритемной или эритемной форм ИКБ с менингеальными и очаговыми формами КЭ), 5 — с нейроборрелиозом.

При использовании лекарственного препарата цитофлавина по новым показаниям мы строго руководствовались нормативной и регламентирующей документацией Министерства здравоохранения и социального развития РФ. Исследование было одобрено этическим комитетом Челябинской государственной медицинской академии.

Включение в группу исследования проводилось методом адаптивной рандомизации. Все больные были разделены на 2 группы: группа А — пациенты, получавшие базисную терапию; группа В — получавшие базисную терапию + патогенетически ориентированную терапию (цитофлавин). Использованный метод рандомизации позволил поддерживать равновесие в численности групп наблюдения систематически на протяжении всего периода их формирования.

Набор средств базисной терапии включал в себя этиотропные в зависимости от нозологии (противоклещевой иммуноглобулин рибамидил — при КЭ, цефтриаксон в дозе 2 г — при нейроборрелиозе и МИ), инфузионные (5% раствор глюкозы, 0,9% раствор натрия хлорида), ноотропные средства (церебролизин, ноотропил). Цитофлавин пациентам группы В вводили 1 раз в сутки утром внутривенно капельно (медленно) по 10,0 мл на 200 мл 5% раствора глюкозы в течение 7 дней.

Динамическое обследование пациентов проводилось при включении в исследование (1—3-е сутки), после окончания инфузий (8—10-е сутки) и на 16—18-й день от начала терапии. Проводились оценка динамики неврологических симптомов и нейропсихологическое исследование, изучались когнитивные функции. Для нейропсихологического исследования использовались: краткая шкала оценки психического статуса MMSE, шкала Cпилбергера—Ханина, тест-опросник Айзенка.

Этиологическая верификация КЭ осуществлялась методом иммуноферментного анализа (ИФА), специфические антитела иммуноглобулинов классов M и G (IgM и IgG) к вирусу КЭ выявляли с помощью тест-систем Вектор-Бест (Новосибирск). Диагностика ИКБ проводилась методом ИФА с использованием тест-систем Helex (Санкт-Петербург) и методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением тест-систем Векто-Лайм-ДНК-ампли (Новосибирск) и Ампли-Лайм-ЭФ (Санкт-Петербург).

Все клинические формы заболеваний были верифицированы с помощью дискриминаторных для каждой патологии тестов (ИФА, ПЦР). Диагностика КЭ как в виде моноинфекции, так и в случае его сочетания с ИКБ осуществлялась сравнением титров специфических IgM и IgG в динамике; 3-кратное серологическое обследование значительно повышало чувствительность диагностики, так как у больных, получавших серотерапию в первые дни болезни, отмечалось временное угнетение активности иммуногенеза.

С целью оценки выраженности иммуноопосредованного воспаления и оксидантного стресса применяли также дополнительные лабораторные исследования. Популяционный и субпопуляционный спектры лимфоцитов ЦСЖ изучали методом лазерной проточной цитометрии на цитофлюориметре Beckman Coulter, модель Epics XL, с использованием моноклональных антител CALTAG Laboratories к CD3, CD4, CD8, CD20, CD14, CD33, CD95, CD16+56. CD-типирование мононуклеаров ЦСЖ было проведено у 15 включенных в исследование больных.

Количественную оценку содержания NO в крови проводили фотокалориметрическим методом с помощью реакции Грисса в модификации Н.Л. Емченко [6] по суммарному содержанию его конечных стабильных метаболитов.

Выраженность воспаления также оценивалась по содержанию отдельных, влияющих на продукцию NO, цитокинов: фактора некроза опухолей альфа (TNF-α) и ЦСЖ, интерферона гамма (ИФН-γ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4) в крови.

Контрольную группу для ликворологических исследований составили 25 больных, поступивших в инфекционное отделение с подозрением на серозный менингит, у которых цитологическое, биохимическое, бактериологическое и молекулярно-биологическое исследование ЦСЖ не выявило отклонений от соответствующих нормальных показателей: цитоз не превышал 5 клеток в 1 мкл ЦСЖ, белок 0,15—0, 45 г/л, глюкоза 2,0—4,18 ммоль/л при одновременном определении аналогичного показателя в сыворотке крови, где он в норме в 2 раза выше, хлориды 120,0—130,0 ммоль/л, IgG<40 г/л [2]. Для отбора контрольной группы использовали современные лабораторные методы иммуноанализа (латекс-агглютинация, ИФА, ПЦР).

Статистическую обработку данных проводили с помощью электронных таблиц Microsoft Exсel. Проверку нормальности распределения количественных показателей осуществляли с использованием критерия Колмого­рова—Смирнова. В случае отклонения распределения от нормального достоверность различий определяли с помощью непараметрических критериев Манна—Уитни и Вилкоксона. Также использовался критерий Стьюдента. В таблицах числовые данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (QL-нижний квартиль, QU-верхний квартиль).

При сборе эпидемиологического анамнеза у обследованных больных присасывание клеща отмечали 94% пациентов с КЭ, 89,6% — с моноинфекцией ИКБ и 81,3% — с МИ (ИКБ+КЭ). Отрицали укус, но при этом находились на дачных участках или посещали лесные массивы Челябинской области 7%, еще 2,3% больных не выезжали за пределы города, а 2,3% снимали с себя ползающих клещей. Алиментарный путь инфицирования установлен у 5 (0,9%) больных (3 пациента с КЭ и 2 с ИКБ) и был связан с употреблением сырого козьего молока. Следует заметить, что в последние годы наблюдается резкое снижение числа случаев алиментарного пути заражения, что некоторые авторы объясняют снижением поголовья коз [8]. Инкубационный период варьировал в широком интервале — от 2 до 30 сут, в большинстве случаев не превышая 2 нед и в среднем составляя 9,1±2,4 дня. Интоксикационный синдром проявлялся фебрильной лихорадкой у 81,4% больных с КЭ и 90% с МИ, двухволновой характер температурной кривой отмечен преимущественно у больных с КЭ и МИ с поражением ЦНС. Длительность первой волны составляла 2—10 дней, второй 2—17 дней, продолжительность апирексии между ними была 7,3±0,44 сут.

Спектр основных клинических проявлений поражения нервной системы у больных клещевыми нейроинфекциями представлен в табл. 1.

Таблица1

Тяжесть общего состояния у большинства больных соответствовала выраженности изменений ЦСЖ. Воспалительные изменения в ЦСЖ характеризовались лимфоцитарным плеоцитозом. При нейроборрелиозе и МИ определялась тенденция к более высокому цитозу (Me 360 и 127 в 1 мкл ЦСЖ соответственно). Содержание белка в ЦСЖ у больных КЭ, как правило, не было высоким. Отмечена тенденция к более высокому уровню белка у больных нейроборрелиозом и МИ (Me от 562 до 735 мг/л). У 1 больного МИ наблюдалась белково-клеточная диссоциация.

Поражения периферической нервной системы (см. табл. 1) были наиболее представительной патологией при нейроборрелиозе. В 1 случае отмечено поражение лицевого нерва по периферическому типу. Кроме краниальных невритов наблюдалось поражение периферической нервной системы другой локализации в виде полирадикулоневритов с умеренно выраженными быстро регрессировавшими периферическими парезами и радикулярными болями. При нейрофизиологических обследованиях у 2 больных обнаружены аксональные демиелинизирующие нейропатии. В ряде случаев наблюдались вегетативные расстройства преимущественно в виде цианоза, сухости кожи и похолодания в области дистальных отделов конечностей.

Результаты лабораторных исследований показали, что нейроформы клещевых инфекций сопровождаются отчетливо выраженной гипернитроксидемией, определяемой по достоверному (p<0,05) увеличению концентраций конечных стабильных метаболитов нитроксид-молекулы в крови (табл. 2).

Таблица2

]]>

Клеточные кооперативные взаимодействия в ходе формирования специфического иммунного ответа на локальном уровне развиваются между фагоцитирующими, антигенпрезентирующими и иммунокомпетентными лим­фо­цитами. С помощью рутинных методов оценки клеток ЦСЖ подтверждены данные об общем росте клеток в ЦСЖ за счет мононуклеаров с формированием лимфоцитарного плеоцитоза, что является характерным дифференциально-диагностическим признаком клещевых нейроинфекций. С помощью проточной цитофлюориметрии выявлено формирование в ЦСЖ не только лимфоцитарного плеоцитоза (роста СD3⁺, СD4⁺, СD8⁺), но и моноцитоза (число СD14⁺-клеток составило 34%). Как показало настоящее исследование (см. рисунок),

CD-типирование мононуклеаров ЦСЖ у больных клещевыми нейроинфекциями. Темный фон - процентный состав типов мононуклеаров.

]]>

Методом наименьших квадратов между суммарной концентрацией NOх и процентным содержанием клеток, экспрессирующих CD14-маркер, установлена корреляционная зависимость с коэффициентом парной корреляции (r=0,505, p<0,001), что делает предположение о моно­цитарно-макрофагальном происхождении оксида азота в ЦСЖ правомерным. Локальное действие NO на иммунные клетки может оказывать прямой апоптогенный эффект, описанный многими авторами для данного соединения и его метаболитов, и согласуется с полученными нами данными о достоверно высоких показателях готовности лимфоцитов ЦСЖ к Fas-зависимой программированной гибели, установленной на основании определения CD95-мембранного рецептора в 64% клеток ЦСЖ. Таким образом, экспрессия гена iNOS с гиперпродукцией указанного метаболита вызывает серьезные патофизиологические изменения: увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера, активацию клеточного состава микроглии с развитием иммунопатологических реакций [4, 15]. Индуцируемое иммунное воспаление приводит к накоплению микроглиальных клеток, иммунных клеток крови, а затем запускаются антигенпрезентирующие механизмы и развивается регионарный иммунный ответ Th1-типа при участии пришлых и резидентных клеток.

Отмечена хорошая переносимость терапии цитофлавином. Побочных реакций не было.

Анализ динамики основных субъективных симптомов заболевания свидетельствовал о более быстром исчезновении головной боли, слабости и повышенной раздражительности в группе пациентов, получавших цитофлавин. К моменту окончания инфузий у большинства больных восстанавливался сон, уменьшалась утомляемость. На 8-й день после завершения инфузий цитофлавина наблюдалась отчетливая тенденция к регрессу общемозговой симптоматики и собственно менингеального симптомокомплекса, а к 18-му дню комплексной терапии — существенное снижение анизорефлексии и чувствительных корешковых расстройств. В табл. 3

Таблица3

]]>

Динамика нитроксидергических показателей в двух обследуемых группах представлена в табл. 4.

Таблица4

]]>

Таким образом, можно заключить, что основными патогенетическими механизмами при развитии иммунного воспаления в пределах ЦНС при клещевых нейроинфекциях являются: 1) L-аргинин-зависимый механизм с гиперпродукцией метаболитов NO в крови и ЦСЖ; 2) прогрессирующий апоптоз как результат прямого про­апоптогенного действия NO на клетки-мишени и опосредованного действия нейропатогенов через активацию TNF-α и рецептора CD95; 3) воспалительная цитокиновая реакция; 4) формирование специфического иммунного ответа на локальном уровне между фагоцитирующими, антигенпрезентирующими и иммунокомпетентными лим­фо­цитами. Использование цитофлавина с целью коррекции гиперпродукции оксида азота у больных клещевыми нейроинфекциями является патогенетически обоснованным^[1]. Воздействие препарата на метаболизм нитроксид-молекулы можно объяснить его составом, в который входят известные фармакологические препараты [1]. Рибоксин — агонист пуринергических рецепторов, участвующий во внутриклеточной биотрансформации аденозина, который задействован в образовании NO, регулируя образование эндотелиальной NOS через свой ингибиторный белок (Gi). Известно, что нейрональная NOS способна образовывать оксид азота, который усугубляет тканевое повреждение, в то время как эндотелиальная NOS вызывает системную вазодилатацию и улучшает кровообращение. Рибоксин, как и янтарная кислота, осуществляет неконкурентную блокаду NMDA-рецепторов и воздействует на эксайтотоксичность, препятствуя инфузии кальция и натрия в нейроны и глию. Янтарная кислота также ускоряет оборот дикарбоновой части цикла трикарбоновых кислот, увеличивает объем энергии, необходимой для синтеза АТФ. Ферменты цикла Кребса относятся к группам мишеней для NO, где он реализует свое действие.