Коцюба А.Е.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Черток В.М.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Иммуногистохимическое исследование H2S-позитивных нейронов в некоторых структурах головного мозга человека при артериальной гипертензии

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2012;112(1): 54-59

Просмотров : 945

Загрузок : 254

Как цитировать

Коцюба А. Е., Черток В. М. Иммуногистохимическое исследование H2S-позитивных нейронов в некоторых структурах головного мозга человека при артериальной гипертензии. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2012;112(1):54-59.

Авторы:

Коцюба А.Е.

Кафедра анатомии человека Владивостокского государственного медицинского университета

Все авторы (2)

О нейрогенной функции эндогенного сероводорода (H2S) известно немного. В мозге крысы, человека и быка были обнаружены относительно высокие концентрации сероводорода (по разным данным от 50 до 160 мкМ, в плазме крови — около 46 мкМ), что послужило основанием для предположения о его важной роли в работе нервной системы [8, 9, 23]. Высказывается мнение, что H2S — основной модулятор кальциевого гомеостаза в нейронах, активирующий поступление кальция в цитозоль через Ca2+ каналы L-типа [15]. Нарушение этого процесса сопровождается разнообразными изменениями в работе нервных клеток и прежде всего их сигнальной функции. При ряде нейродегенеративных заболеваний отмечено снижение концентрации H2S, а при болезни Дауна — его избыточный синтез в мозге [17]. Имеются косвенные доказательства участия этого газа в центральной регуляции гемодинамики [20, 21], хотя морфологические данные о наличии нервных клеток, использующих в качестве нейротрансмиттера H2S в соответствующих ядрах ствола мозга при гипертензии, нам неизвестны.

Цель работы — изучение топографии и количественного распределения H2S-позитивных нейронов (H2S-нейронов) в некоторых ядрах продолговатого мозга и моста, входящих в состав сердечно-сосудистого центра при артериальной гипертензии I—III степени.

Материал и методы

Для исследования был использован судебно-медицинский аутопсийный материал 8 практически здоровых мужчин в возрасте 18—44 лет (контрольная группа) и 19 мужчин соответствующего возраста, погибших от механических травм, не связанных с повреждением головного мозга, у которых при жизни была диагностирована артериальная гипертензия I—III степени (группы АГ-I, АГ-II и АГ-III).

Не позднее 3 ч после смерти из полости черепа извлекали головной мозг, отделяли от него мост и продолговатый мозг, которые фиксировали в течение 1 ч в 4% растворе параформальдегида, приготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) при 4 °С.

Из образцов мозга готовили криостатные срезы толщиной 30 мкм, которые обрабатывали для иммуногистохимического выявления цистатионин-β-синтетазы (СВS) — фермента, участвующего в синтезе H2S в ЦНС [14, 25]. Для этого срезы последовательно инкубировали с 1% нормальной сывороткой лошади 1 ч при комнатной температуре мышиными моноклональными антителами против цистатион-β-синтазы (в разведении 1:1000) (Abcam, Bеликобритания) при температуре 4°С в течение 18 ч, биотинилированными антителами в разведении 1:100 (VeсtorLabs, США) 2 ч, а также с авидин-пероксидазным комплексом (Vectastain Elite ABC Kit, VeсtorLabs, США) 1 ч при комнатной температуре. Для выявления продуктов реакции под контролем микроскопа срезы инкубировали в субстрате для обнаружения пероксидазы (VIP Substrate Kit, VeсtorLabs, США). Затем срезы промывали, обезвоживали по стандартной методике и заключали в полистерол. Для оценки специфичности реакции проводили окрашивание срезов без первичных или вторичных антител.

Изучали ядро солитарного тракта, дорсальное ядро блуждающего нерва, ретикулярные ядра — мелко-, гигантоклеточное, центральное, околоцентральное, латеральное, мостовые ядра — оральное и каудальное, а также ядра задней группы шва — бледное, темное, крупное и мостовое. В серии из последовательных срезов один окрашивали 0,5% раствором метиленового синего, а следующий за ним обрабатывали для выявления H2S-нейронов. При изучении топографии ядер каждый из двух срезов исследовали раздельно на двух микроскопах, в окуляры которых помещали одинаковые сетки с равновеликими квадратами. Каждое ядро ориентировали по характерным признакам в сагиттальной и фронтальной плоскостях, после чего его контуры воспроизводили на экране монитора в соответствии с положением ядер относительно координат сетки.

В проекции среза каждого ядра определяли общее число нейронов и долю, приходящуюся на H2S-нейроны, а также величину среднего значения оптической плотности продукта реакции (активность реакции) в иммунопозитивных нейронах каждого ядра в соответствии с опубликованными ранее методиками [2]. Количественную обработку материалов проводили с использованием автоматизированной системы анализа изображений Allegro MC. Данные количественного анализа представляли в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего, полученных от каждого человека при обработке не менее 12 срезов. Для оценки значимости цифровых данных применяли t-критерий Стьюдента. Значения доверительного интервала, p<0,05, считали статистически достоверными.

Результаты

Изучение образцов, взятых у контрольной группы, показало наличие H2S-нейронов в проекции ядер, между ядрами, между ядрами и проводящими путями (рис. 1, а—д).

Рис. 1. Разный уровень интенсивности реакции CBS в H2S-нейронах ядер ретикулярного гигантоклеточного (а), двойного (б), солитарного тракта (в), ретикулярного каудального мостового (г), нервных волокнах и капиллярах (д) и отсутствие реакции без антител в инкубационном растворе (е) у контрольной группы.
Примечание. Иммуногистохимический метод. Ув. на фрагментах а—в, е —100, г, д —200.
При специфической иммуноцитохимической реакции в местах локализации СВS образуется мелкозернистый осадок, который в зависимости от плотности расположения гранул маркирует нейроны, нервные проводники, отдельные капилляры в различные оттенки коричневого цвета. При проведении реакции без первичных и вторичных антител характерной структуры преципитата не образуется (рис. 1, е).

Наибольшие цифры среднего показателя оптической плотности продукта реакции были установлены в двойном ядре, ретикулярных ядрах — гигантоклеточном и центральном, а также в темном ядре шва (рис. 2, А).

Рис. 2. Распределение реакции CBS в нейронах (а) и H2S-нейронов (б) в исследованных ядрах контрольной группы и лиц, страдавших АГ I—III степени.

]]>
Примечание. Ядра: I — солитарного тракта, 2 — дорсальное блуждающего нерва, ретикулярные — мелкоклеточное (3), центральное (4), околоцентральное (5), гигантоклеточное (6), латеральное (7); мостовые—оральное (8) и каудальное (9); двойное (10), а такжешва задней группы—бледное (11), темное (12), крупное (13) и мостовое (14).
За 100% принята величина соответствующих показателей у контрольной группы.
Наименьший уровень этого показателя определялся в чувствительных ядрах (ядро одиночного пути, ретикулярные мелкоклеточное и латеральное ядра) и вегетативном — дорсальном ядре блуждающего нерва. Прослеживается определенная зависимость между содержанием СВS и величиной нейронов. Средний показатель активности реакции выше в медиальной зоне продолговатого мозга, включающей ядра с двигательными функциями (двойное ядро, ретикулярные гигантоклеточное, околоцентральное, центральное, оральное и каудальное мостовые ядра), которые содержат большое количество крупных интенсивно окрашенных клеток (см. рис. 1, а, б, г). В латеральной, чувствительной зоне, велика доля мелких нейронов с невысокой активностью СВS (см. рис. 1, в). Между тем в проекции ядер с сенсорными функциями также выявляются клетки с интенсивной реакцией, которые чаще располагаются на периферии ядер или между ними, а среди крупных нейронов двигательных ядер встречаются клетки с умеренной или низкой активностью реакции.

Между ядрами имеются значительные отличия в содержании H2S-нейронов (рис. 2, Б). В некоторых ядрах доля таких клеток не превышает 2—4% (дорсальное ядро блуждающего нерва, ядро одиночного пути), в других (двойное ядро, ретикулярное гигантоклеточное, каудальное, медиальное, центральное ядра) достигает 12—14%.

При АГ-I в нейронах дорсального ядра блуждающего нерва на 12,4% возрастают значения среднего показателя активности реакции СВS (см. рис. 2, а). Это происходит в основном за счет увеличения интенсивности реакции в группе клеток, расположенных на периферии его дорсальной поверхности, прилегающей к тонкому ядру. Содержание нейронов с высокой активности реакции возрастает по направлению от ростральной к каудальной части ядра. Особенно много таких клеток определяется в нем на уровне средней трети нижней оливы. Вместе с тем доля H2S-позитивных нейронов в этом ядре остается на уровне контрольных значений (см. рис. 2, б). Во многом сходные изменения количественных показателей отмечены в ядрах двойном, ретикулярном гигантоклеточном, ретикулярных оральном и каудальном мостовых и темном и крупном ядрах шва, но в отличие от вегетативного ядра в них повышение активности фермента происходит относительно равномерно в большинстве выявленных нейронов. В других ядрах существенных изменений величины исследованных показателей не установлено (см. рис. 2, а, б).

При АГ-II в большинстве ядер наблюдалось выраженное снижение (на 18—26%) среднего показателя активности реакции при весьма умеренном уменьшении (на 2—12,8%) доли H2S-нейронов (см. рис. 2, а, б). При этом сокращение количественных показателей в большей степени затрагивает ядра медиальной зоны продолговатого мозга и моста. В латеральной зоне изменения морфометрических параметров в большинстве ядер остаются на уровне контрольных значений. В ретикулярном гигантоклеточном ядре отмечается максимальное снижение (на 26%) активности и числа (на 12,8%) H2S-нейронов. В ретикулярных мелкоклеточном, центральном и оральном мостовом ядрах наблюдается выраженное уменьшение (до 14%) интенсивности реакции при умеренном сокращении (на 6—8%) числа клеток. В дорсальном ядре блуждающего нерва величина показателей хотя и снижается по сравнению с АГ-I, но остается достоверно выше контрольных значений. В других ядрах изменения величины количественных показателей минимальны (2—4%) и не выходят за рамки статистической погрешности.

При АГ-III прибавляется количество ядер, в которых установлено значимое снижение доли нейронов (см. рис. 2, а, б). В двигательных ядрах продолговатого мозга и моста сокращение количества H2S-нейронов и содержания в них фермента более выражено, чем в чувствительных (рис. 3, а, б).

Рис. 3. Изменение активности CBS в нейронах и содержания H2S-нейронов в некоторых ядрах людей, страдавших АГ.

]]>
Примечание. а — двойное ядро при АГ-I, б — ретикулярное гигантоклеточное ядро при АГ-II.
Иммуногистохимический метод. Ув. 100.
В ядрах одиночного пути и дорсальном блуждающего нерва величина метрических показателей остается в пределах, а в ретикулярном латеральном и мелкоклеточном опускается соответственно на 9 и 12% ниже контрольных значений. Однако во всех случаях количество клеток уменьшается в большей степени в тех частях ядра, в которых при АГ-II отмечено повышенное содержание клеток с низкой активностью реакции.

Обсуждение

Вазорелаксирующий эффект NO и монооксида углерода хорошо известен, что позволяет им принимать непосредственное участие в регуляции артериального давления. При подавлении активности ферментов, отвечающих за синтез указанных выше газов в стенке сосудов, развивается гипертензия [5, 7, 21]. Не является исключением в этом плане и H2S: снижение уровня (или отсутствие у инбредных животных) цистатионин-γ-лиазы — фермента, участвующего в образовании сероводорода в сосудах, приводит к существенному сокращению его уровня в сыворотке крови и повышению систолического давления на 12—30 мм рт.ст. [10, 25, 26]. Однако отсутствие этого фермента не сказывается на концентрации H2S в мозге, где его синтез обеспечивает другой фермент — цистатионин-β-синтетаза [8, 13]. На этом основании исследователи заключают, что у животных, нокаутированных по цистатио­нин-γ-лиазе, возникновение гипертензии обусловлено периферическими механизмами, связанными с повышением тонуса сосудов.

О роли H2S в центральных механизмах регуляции кровотока в литературе сведения практически отсутствуют. В отличие от NO, участие которого в этих процессах подтверждается большим количеством фактов [1—3, 19], в отношении H2S приводятся лишь косвенные доказательства. Установлено, в частности, снижение концентрации тиосульфата, являющегося продуктом утилизации сероводорода в мозге, у гипертензивных животных [24]. Недавно появилось сообщение, что вовлечение H2S в центральную регуляцию кровяного давления может осуществляться посредством воздействия этой сигнальной молекулы на АТФ-зависимые К+-каналы нейронов гипоталамуса крыс [12]. Вместе с тем никто не продемонстрировал клеток, экспрессирующих CBS, ни в гипоталамусе, ни в других центрах мозга, управляющих вазомоторикой. Не было представлено материалов о топографии, количественном распределении и активности фермента в H2S-нейронах у здоровых людей и изменениях этих параметров при гипертензии, что имеет принципиальное значение для оценки функции нервного центра.

Проведенное нами исследование показало наличие морфологического субстрата, с помощью или посредством которого H2S может участвовать в реализации центральных механизмов регуляции кровотока. В проекции всех исследованных ядер продолговатого мозга и моста, имеющих отношение к так называемому бульбарному отделу сердечно-сосудистого центра, постоянно определяются клетки, обладающие разной степенью активности СВS. Интенсивная реакция, как правило, проявляется в крупных клетках двигательных ядер, часть из которых связана с преганглионарными симпатическими нейронами спинного мозга [16], мелкие и немногочисленные клетки чувствительных ядер обычно имеют невысокую активность фермента. Между ядрами, ядрами и проводящими путями определяются одиночные H2S-нейроны. Таких нейронов немного, но они занимают стратегически важные участки и, по имеющимся данным [2], обмениваются многочисленными отростками с ядрами ретикулярными, вегетативным блуждающего нерва и одиночного пути. Эти клетки по сути представляют собой интернейроны, подобно описанным в коре мозга, которые содержат разные нейротрансмиттеры и нейромодуляторы, что позволяет им выполнять интегративную функцию в отношении клеток различной нейрохимической и функциональной принадлежности [11].

Содержание H2S-нейронов в проекции изученных ядер колеблется довольно значительно — от 2 до 14%. Иммунопозитивные нейроны выявляются преимущественно в области медиального эффекторного поля и некоторых ядрах шва, где располагаются относительно равномерно. При этом содержание этих нейронов увеличивается от ростральной к каудальной части ядра, но плотных скоплений в какой-то его части они в большинстве случаев не образуют. Клетки, экспрессирующие СВS, находятся по соседству с NOергическими нейронами, хотя концентрация последних в соответствующих ядрах в 2—3 раза выше, чем H2S-нейронов [6]. Здесь же располагаются нервные клетки, включающие серотонин, норадреналин, ГАМК, глицин и некоторые другие вещества, которые участвуют во многих физиологических процессах нервной системы, включая регуляцию гемодинамики и артериального давления [2, 4]. Ключевую роль в многообразном действии этих веществ современные исследователи отводят NO, способному контролировать их содержание в мозге [9, 21]. Вместе с тем имеются сообщения [22, 23] о нейромодуляторной функции эндогенного H2S, который, так же как и NO, может регулировать в мозге уровень серотонина, нор­адреналина и некоторых других веществ. Отмечено также наличие в мозге тесного функционального взаимодействия нейронов, аккумулирующих оксид азота и сероводород [14, 25]. В отличие от NO, время полужизни которого в среднем составляет 5 с, а расстояние диффузии — 100 мкм, H2S обеспечивает развитие не столь мощного, зато долговременного возбуждения с более широкой зоной воздействия. Вероятно, это свойство сероводорода, впервые установленное в гиппокампе крысы [18], может быть использовано и в других центрах мозга, в том числе участвующих в регуляции вазомоторики. Поскольку при гипертензии как у человека, так и экспериментальных животных содержание NO-нейронов в ядрах бульбарного отдела сердечно-сосудистого центра значительно сокращается [1, 3], то способность сероводорода вызывать длительное возбуждение нейронов в этом случае может оказаться необходимым элементом для стабилизации артериального давления.

При изучении морфометрических параметров, характеризующих состояние H2S-нейронов в ядрах продолговатого мозга и моста при артериальной гипертензии, нами также выявлены изменения в них вначале содержания СВS, а затем и числа иммунопозитивных клеток, выраженность которых зависит от тяжести заболевания. Одновременно установлены отличительные признаки в количественном и пространственном распределении H2S-нейронов по сравнению с NO-позитивными клетками. Прежде всего при гипертензии изменения количественных показателей со стороны H2S-нейронов наступают позднее и выражены в меньшей степени, чем NO-нейронов. Раньше других ядер отмеченные преобразования определяются в дорсальном ядре блуждающего нерва, что, по-видимому, является следствием тесной связи, существующей между этим ядром и ядром одиночного пути, в котором, как известно, большинство афферентов имеет вагусное происхождение. Однако и в других ядрах при АГ II—III степени изменения количественных показателей H2S-нейронов не столь значительны, как NO-позитивных клеток [1, 3]. В результате этого процесса происходят изменения пространственного расположения H2S- и NO-нейронов в ядре. Вероятно, изменения топографии двух типов нейронов внутри ядер отражаются как на характере связей между ядрами, так и организации работы нервного центра в целом. Изменение пространственных взаимоотношений между двумя системами сигнальных молекул на ранних стадиях болезни может привести к компенсаторному замещению недостаточности функции одной газотрансмиттерной системы другой и как следствие к стабилизации артериального давления [27, 28]. Дальнейшее сокращение активности соответствующих ферментов в NO- и H2S-нейронах, а затем и концентрации этих клеток, наблюдающееся при АГ II—III, способствует закреплению стабильной гипертонии.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям. Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (госконтракт №14.740.11.0186).

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail