Шушпанова Т.В.

Лаборатория нейробиологии НИИ психического здоровья Сибирского отделения РАМН, Томск; лаборатория физиологии, молекулярной и клинической фармакологии НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН, Томск

Солонский А.В.

Лаборатория нейробиологии НИИ психического здоровья Сибирского отделения РАМН, Томск; лаборатория физиологии, молекулярной и клинической фармакологии НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН, Томск

Синаптогенез и формирование бензодиазепиновых рецепторов мозга человека в условиях пренатальной алкоголизации

Журнал: Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2012;112(1): 60-67

Просмотров : 1146

Загрузок : 271

Как цитировать

Шушпанова Т. В., Солонский А. В. Синаптогенез и формирование бензодиазепиновых рецепторов мозга человека в условиях пренатальной алкоголизации. Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2012;112(1):60-67.

Авторы:

Шушпанова Т.В.

Лаборатория нейробиологии НИИ психического здоровья Сибирского отделения РАМН, Томск; лаборатория физиологии, молекулярной и клинической фармакологии НИИ фармакологии Сибирского отделения РАМН, Томск

Все авторы (2)

Пренатальное воздействие алкоголя может привести к развитию алкогольного синдрома плода, или фетального алкогольного синдрома (ФАС), проявляющегося комплексом расстройств со стороны соматической и психической сфер, который отражает нарушение развития нервной системы [17, 22, 32]. Было установлено, что развитие этого синдрома связано в большой мере с нарушением развития мозга плода, начиная с самых ранних стадий нейрогенеза и формирования его структур, что ведет к задержке миграции и дифференциации нейронов, а также изменению синаптогенеза [1, 2, 4—6, 12, 19, 21, 24, 35]. Однако влияние алкоголизации матери на развитие эмбрионального мозга человека, возможные механизмы его действия на формирование нервной ткани, развитие синаптических структур и рецепторных систем мозга изучены недостаточно.

Длительное время считалось, что отрицательное действие этанола связано в основном с его влиянием на липидный компонент нейрональной мембраны. В настоящее время принята точка зрения, согласно которой негативное влияние этанола связано также с его взаимодействием со специфическими белками, ионными каналами и рецепторами, что ведет к изменению их функции [13, 14, 20, 27—31]. Так, установлена способность этанола при взаимодействии с рецепторными белками изменять нейрональную возбудимость. Многие авторы предполагают, что в механизмах действия этанола значительную роль играют ГАМК и ГАМКергическая нейромедиаторная передача. Напомним, что ГАМК-рецептор является одним из наиболее широко распространенных ингибиторных рецепторов в ЦНС. Важным в функционировании ГАМК-рецепторного комплекса является то, что этот олигомерный белковый комплекс содержит различные аллостерические места связывания, которые модулируют активность рецептора. Эти аллостерические места связывания являются мишенями для различных препаратов, включая бензодиазепины и этанол. Бензодиазепины, связываясь со специфическими местами — бензодиазепиновыми рецепторами (БДР) на ГАМК-рецепторе, изменяют его конформацию и аффинитет [34]. В связи с этим считают, что в основе седативного и анксиолитического эффектов как алкоголя, так и бензодиазепинов лежит потенциация ингибиторного эффекта ГАМК путем гиперактивации ГАМК-рецепторов. Воздействие алкоголя в условиях острого опыта усиливает ГАМКергическую трансмиссию, повышает сродство бензодиазепиновых рецепторов к [3H]-диазепаму; хроническая алкоголизация повышает селективность связывания обратных агонистов БДР [36, 37].

Приведенные данные указывают на наличие связи между действием этанола и функционированием ГАМК-БД-рецепторного комплекса. Изучение характера этой связи особенно важно в свете алкогольной патологии развивающегося мозга, тем более что ГАМК относится к нейротрофным агентам и является одним из ключевых медиаторов, участвующих в развитии мозга человека и животных, в частности в формировании нервной трубки, миграции и дифференциации нейронов [10, 11, 15—18, 25, 26, 29].

Поскольку процессы развития мозга тесно связаны с функционированием ГАМКергической системы, важно изучить влияние этанола (имеющего выраженное влияние на ГАМК-активное действие) на развитие ЦНС, в частности на синаптогенез и формирование синаптосомальных бензодиазепиновых рецепторов. Пока исследований, касающихся влияния алкоголя на ГАМК- и бензодиазепиновые рецепторы человека, особенно в отношении развивающегося мозга человека, очень мало [7—9, 31, 33].

Цель настоящего исследования — изучение формирования синаптических контактов и бензодиазепиновых рецепторов в процессе развития головного мозга эмбрионов и плодов человека 8—15-й недели развития, полученных от женщин, страдавших алкоголизмом с использованием компьютерной морфометрии синаптических контактов, изучение функции бензодиазепиновых рецепторов и установлением корреляций между ними.

Материал и методы

Изучали головной мозг эмбрионов и плодов человека 8—15-й недели развития, которые были получены в соответствии с требованиями этического комитета с согласия пациенток в процессе проведения операций по прерыванию беременности по медицинским показаниям.

От больных алкоголизмом женщин получено 33 эмбриона и плода, которые составили основную группу.

Возраст больных алкоголизмом женщин — 26—39 лет, длительность заболевания — от 3 до 13 лет. Во всех случаях была диагностирована II стадия алкоголизма (по МКБ-10 рубрики F 10.201; F 10.202). Диагноз алкоголизма был установлен сотрудниками отделения аддиктивных состояний НИИ психического здоровья СО РАМН.

В контрольную группу вошли эмбрионы и плоды от здоровых женщин, не имевших неврологических и психических заболеваний в анамнезе. Женщины контрольной группы были сопоставимы по возрасту с больными алкоголизмом.

Для получения достоверной информации эмбриональный материал для исследования брали только в случаях, когда отсутствовали вредные воздействия, оказывающие дополнительное влияние на развитие мозга эмбрионов (радиация, химические вещества, некоторые лекарственные средства, а также заболевания матери в период беременности — грипп, краснуха, токсоплазмоз и т.д.).

Образцы головного мозга эмбрионов и плодов фиксировали и заливали в аралдит по описанной нами ранее методике [2, 4, 5]. Ультратонкие срезы изготавливали на ультратоме Ultracut-E (Австрия), контрастировали уранил­ацетатом и цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в электронных микроскопах JEM-100B и JEM-100CX. Для исключения возможных ошибок снимки делали с одним и тем же увеличением (36 000 или 48 000). Это связано с такими особенностями эмбриональной ткани, как незначительное количество синапсов на ранних стадиях развития и величиной самих синаптических соединений. Электронно-микроскопически исследовали промежуточный слой стенки переднего мозга, который представляет собой скопление нейро-, глиобластов (включая микроглиальные клетки), между которыми начинают прорастать кровеносные сосуды. Морфометрическому анализу подвергали фотоотпечатки с негативов формата 6 9 см, полученных с помощью электронного микроскопа. Отпечатки с негативов делали контактным способом 1:1, затем изображение сканировали в градациях серого с разрешением 300 dpi, с сохранением в формате TIFF без компрессии. Часть негативов оцифровывали с помощью сканера без промежуточных бумажных фотокопий. На снимках при помощи программы Scion Image for Windows, разработанной в National Institute of Health фирмой «Scion Corporation», были исследованы площадь пресинаптической терминали, ее периметр, а также длина постсинаптического уплотнения.

Для проведения количественной оценки с помощью компьютерно-морфометрического анализа электронные микрофотографии синапсов эмбрионального мозга были подразделены на 4 группы соответственно сроку развития эмбрионов: 7—8, 9—10, 10—11 и 11—12 нед. Соответствующее разделение материала проводили как в основной, так и в контрольной группах (табл. 1).

Для анализа брали по 5 случаев из каждого возрастного периода в контрольной и опытной группах. Из каждого случая использовали по 15—20 микрофотографий различных участков промежуточного слоя. Результаты измерений представлены в относительных значениях, выражающих число пикселов (p), при оценке длины, и число пикселов изображения в квадрате (p2) при оценке площади структурных компонентов синапсов.

БДР исследовали методом радиорецепторного связывания селективного лиганда [3Н]-флунитразепама («Amersham», Ки) с грубой синаптосомальной фракцией ГМ эмбрионов [3], в конечных концентрациях 0,2—10 нМ. Конечная концентрация мембран по белку составила 0,3 мг/мл. Неспецифическое связывание определяли в присутствии нерадиоактивного лиганда в концентрации 10 мкМ. Радиоактивный анализ количества связанного лиганда проводили в сцинтилляционном β-счетчике Rack-beta (LKB). Константу диссоциации (Кд) и максимальное число мест специфического связывания (Вмакс.) определяли методом анализа кривых насыщения в координатах Скэтчарда.

Распределение признаков достоверно не отличалось от нормального, поэтому для статистической обработки данных применяли параметрический метод вариационной статистики (критерий Стьюдента) с использованием программы Statistica 8.0, различия считали значимыми (p<0,05). Для изучения корреляционных связей применяли анализ Спирмена.

Результаты и обсуждение

class="title" style="clear: both">Морфометрическое исследование синапсов

Анализ морфометрических показателей синапсов был начат с общей оценки основной и контрольной групп без разделения материала по срокам развития. Было обнаружено достоверное (p<0,01) снижение всех параметров развивающихся синаптических структур в опытной группе по сравнению с группой контроля.

Затем был произведен более детальный анализ параметров синапсов с учетом срока развития эмбрионов и плодов (рис. 1—3).

Рис. 1. Морфометрические показатели периметра пресинаптических терминалей в контрольной и основной группах по неделям развития.

]]>
Рис. 2. Морфометрические показатели площади пресинаптических терминалей в контрольной и основной группах в динамике развития.

]]>
Рис. 3. Морфометрические показатели длины постсинаптических уплотнений в контрольной и основной группах в динамике развития.

]]>

Период в 7—8 нед развития оказался наиболее трудным для анализа, поскольку к этому сроку развития количество синаптических соединений весьма невелико. Результаты исследования показали, что на 7—8-й неделе развития длина постсинаптического уплотнения была меньше, чем в контроле, но различия статистически недостоверны (p>0,1). Недоступными для анализа в этом периоде оказались периметр пресинаптической терминали и ее площадь, так как к этому сроку развития пресинаптический отдел синаптических соединений локализуется, как правило, на крупных дендритах. Таким образом, на стадии 7—8 нед развития нами выявлено незначительное уменьшение длины постсинаптического уплотнения в опытной группе, но эти различия не достигают уровня значимости.

Период 9 нед развития характеризовался бо`льшим развитием синаптических соединений, особенно на верхней границе промежуточного слоя. Длина постсинаптического уплотнения и периметр пресинаптических терминалей в основной группе и площадь пресинаптической терминали были достоверно меньше (p<0,01), чем в контроле.

Период 10 нед также характеризовался отклонениями в сторону уменьшения значений некоторых морфометрических параметров в основной группе по сравнению с контрольной, т.е. имелось уменьшение длины постсинаптических уплотнений и площади пресинаптических терминалей (p<0,01), но количественные параметры периметра пресинаптических терминалей от контроля не отличались.

В группе 11—12 нед развития были выявлены достоверные отличия от контроля всех морфометрических параметров — длины постсинаптических уплотнений синаптических контактов (p<0,01), уменьшения площади пресинаптической терминали в основной группе исследования (p<0,01), а также периметра пресинаптических терминалей (p<0,01).

Дополнительно к приведенным количественным показателям было отмечено, что большинство проанализированных синапсов в сроки развития 11—12 нед были представлены аксодендритическими положительно изогнутыми синапсами с небольшим количеством синаптических пузырьков и одиночными митохондриями в пресинаптических отделах синапсов.

Таким образом, морфометрический анализ показал, что мозг эмбрионов и плодов от больных алкоголизмом женщин характеризуется задержкой развития синапсов, отражающей их структурную незрелость. Она может быть связана с прямым эффектом алкоголя на нервные клетки, в первую очередь за счет его мембранотропного действия.

class="title" style="clear: both">Бензодиазепиновые рецепторы мозга

Исследование свойств БДР головного мозга человека при сроке развития 8—9 нед показало, что плотность мест специфического связывания [3Н]-флунитразепама (Вмакс.) была выше в основной группе, чем в контрольной (табл. 2, рис. 4).

]]>
Рис. 4. Показатели плотности связывания [3H]-флунитразепама с синаптосомальными мембранами эмбрионального мозга человека в динамике в контрольной и основной группах соответственно неделям развития.

]]>
Отмечалось снижение аффинности рецепторов или их сродства к селективному лиганду [3Н]-флунитразепаму в основной группе, что выражалось в увеличении абсолютных значений показателя Кд (константа диссоциации лиганд-рецепторного комплекса) (см. табл. 2, рис. 5).
Рис.5. Показателиаффинностисвязывания [3H]-флунитразепама с синаптосомальными мембранами эмбрионального мозга человека в динамике в контрольной и основной группах соответственно неделям развития.

]]>
Величина, характеризующая аффинность рецепторов, является обратной константе диссоциации лиганд-рецепторного комплекса — 1/Кд. Это свидетельствует о снижении аффинности рецепторов, т.е. сродства БДР и увеличении их числа в головном мозге эмбрионов человека под влиянием алкоголизации матери.

При сроке развития 10—11 нед в контрольной группе плотность бензодиазепиновых рецепторов (Вмакс.) повышалась с увеличением срока развития эмбрионов, в то же время отмечалось снижение сродства (аффинности) рецепторов к своему лиганду, что выражалось в увеличении абсолютных значений Кд (см. табл. 2, рис. 4, 5). Полученные данные свидетельствуют об изменении аффинности и плотности рецепторов по мере роста и развития нервной ткани головного мозга эмбрионов. В основной группе на этом сроке развития сохранялась та же тенденция, что и при более ранней стадии развития плода, что выражалось в повышении плотности рецепторов и снижении их аффинности по сравнению с контролем. Однако следует отметить, что динамика изменений плотности рецепторов носит нелинейный характер. На 10-й неделе развития отмечаются незначительные изменения показателей характеристик связывания [3Н]-флунитразепама в контрольной и опытной группах. Плотность рецепторов увеличивается незначительно между 9-й и 10-й неделями развития плода, причем в основной группе под влиянием алкоголя на развивающийся мозг не выявлено достоверных различий плотности БДР при этом сроке развития. Отмечается некоторое отставание увеличения плотности рецепторов (см. табл. 2, рис. 4), особенно в основной группе. Это коррелирует с показателями морфометрической оценки синапсов: уменьшением площади пресинаптических терминалей и длины постсинаптических уплотнений (см. табл. 1, рис. 2, 3) в основной группе по сравнению с контрольной (табл. 3).

]]>
Алкоголь уже в этот самый ранний период развития (8—9-я неделя, по нашим данным) нарушает формирование межклеточных контактов и рецепторов и соответственно их функциональной и нейромедиаторной активности.

Из изложенного видно, что изменение плотности БДР между сроками 8—9 и 10—11 нед незначительно и только на 12—13-й и 14—15-й неделях развития наблюдался более выраженный рост абсолютных значений показателя Вмакс., что подтверждает значительное повышение плотности синаптических БДР в этот период. Увеличение плотности рецепторов в контрольной группе с 8—9 до 14—15 нед развития происходит почти на 200%, с некоторым замедлением на 10-й неделе.

Плотность рецепторов в основной группе оказалась выше, чем в контрольной при соответствующих сроках развития, при этом наибольшие различия с контрольной группой отмечены на более поздних сроках развития — 12—13 и 14—15 нед, что коррелирует с морфометрическими показателями синапсов — длиной постсинаптических уплотнений синаптических контактов, площадью пресинаптической терминали, а также периметром пресинаптических терминалей (p<0,01).

Полученные данные подтверждают общую закономерность, заключающуюся в повышении числа рецепторов по мере возрастания срока развития эмбрионов и плодов человека в онтогенезе. Аффинность БДР также изменяется, отражая тенденцию к снижению по мере увеличения срока развития. Следовательно, сродство рецепторов к лиганду, характеризующее их чувствительность, оказывается максимальным на самых ранних сроках развития и самыми чувствительными и уязвимыми к действию алкоголя являются ранние стадии развития мозга человека.

Динамика изменения аффинности, или сродства, БДР к селективному лиганду в головном мозге эмбрионов и плодов человека в онтогенезе в контрольной группе имеет характер роста, близкий к линейному (см. рис. 5), и выражается в снижении сродства рецепторов с увеличением срока развития эмбрионов и плодов и приближением к показателям взрослого мозга. В зрелом мозге сродство рецепторов к лиганду несколько ниже по сравнению с выявляемой аффинностью на самых ранних сроках развития. В нашем исследовании выявленная аффинность рецепторов головного мозга у эмбрионов и плодов в период развития от 8—9 до 14—15 нед понижалась, т.е. значения показателя Кд увеличивались от 1,5 до 2,12 нМ.

В основной группе выявленная аффинность БДР в синаптосомальных мембранах, выделенных из головного мозга эмбрионов и плодов человека, полученных от матерей, страдавших алкоголизмом, была ниже на каждой изучаемой нами стадии развития, чем в контрольной группе, что выражалось в повышении абсолютных значений показателя Кд в период от 8—9 до 14—15 нед и составила от 1,59 до 2,45 нМ соответственно. Кроме того, динамика изменения имела несколько иной характер и в более поздние сроки развития — 14—15 нед — показатель Кд превысил таковой в контрольной группе: 2,12 и 2,45 нМ соответственно (см. табл. 2). Рецепторы головного мозга плодов в основной группе в нашем исследовании при сроке развития 14—15 нед оказались менее аффинными, чем рецепторы зрелого мозга взрослого человека в норме [7].

Снижение способности рецептора связываться с лигандами-агонистами, нарушает соотношение лиганд—рецепторный белок, что приводит к снижению связывания основного нейромедиатора ГАМК и нарушению синаптической передачи. Снижение аффинности рецепторов можно рассматривать как результат частичного ингибирования бензодиазепиновых рецепторов за счет образования пептида DBI (diazepam binding inhibitor — ингибитор синтеза диазепама) и его метаболитов. Воздействие алкоголя может привести к изменению конформации БДР с увеличением аффинности к обратным агонистам. Кроме того, показано, что эндогенный пептид DBI обладает анксиогенным действием, т.е. является обратным агонистом БДР [23]. Возможно, алкоголь стимулирует синтез эндогенного полипептида, взаимодействующего с БДР и снижающего аффинность связывания их с агонистом ГАМК — [3Н]-флунитразепамом.

На фоне выявленного нами снижения образования синаптических структур в головном мозге плода на разных стадиях развития под влиянием материнского алкоголизма по сравнению с нормой (по данным морфометрической оценки) и одновременного снижения аффинности синаптосомальных БДР тенденцию увеличения плотности рецепторов можно оценить как компенсаторную реакцию, направленную на адаптацию нервной системы эмбриона и плода в условиях функциональной недостаточности ГАМКергической нейротрансмиссии.

Полученные результаты подтверждают, что употребление матерями алкоголя, который оказывает влияние на процессы синаптогенеза и формирование синаптосомальных БДР, модулирующих функцию ГАМК-рецепторов, нарушает развитие мозга эмбриона и плода и может приводить к различным соматическим и психическим нарушениям, включая развитие алкогольного синдрома плода.

? нейромедиатора ГАМК и нарушению синаптической передачи. Снижение аффинности рецепторов можно рассматривать как результат частичного ингибирования бензодиазепиновых рецепторов за счет образования пептида DBI (diazepam binding inhibitor — ингибитор синтеза диазепама) и его метаболитов. Воздействие алкоголя может привести к изменению конформации БДР с увеличением аффинности к обратным агонистам. Кроме того, показано, что эндогенный пептид DBI обладает анксиогенным действием, т.е. является обратным агонистом БДР [23]. Возможно, алкоголь стимулирует синтез эндогенного полипептида, взаимодействующего с БДР и снижающего аффинность связывания их с агонистом ГАМК — [3Н]-флунитразепамом.

На фоне выявленного нами снижения образования синаптических структур в головном мозге плода на разных стадиях развития под влиянием материнского алкоголизма по сравнению с нормой (по данным морфометрической оценки) и одновременного снижения аффинности синаптосомальных БДР тенденцию увеличения плотности рецепторов можно оценить как компенсаторную реакцию, направленную на адаптацию нервной системы эмбриона и плода в условиях функциональной недостаточности ГАМКергической нейротрансмиссии.

Полученные результаты подтверждают, что употребление матерями алкоголя, который оказывает влияние на процессы синаптогенеза и формирование синаптосомальных БДР, модулирующих функцию ГАМК-рецепторов, нарушает развитие мозга эмбриона и плода и может приводить к различным соматическим и психическим нарушениям, включая развитие алкогольного синдрома плода.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail