Ремиттирующий рассеянный склероз (РРС) — аутоиммунное заболевание центральной нервной системы, приводящее к появлению очагов демиелинизации в разных отделах головного и спинного мозга и проявляющееся рассеянной неврологической симптоматикой. В большинстве случаев заболевание поражает лиц молодого возраста и может вызывать нарушения мышечного контроля, зрения, координации, чувствительности и функций тазовых органов. Это неизлечимое хроническое расстройство, которое протекает с ремиссиями и обострениями и в итоге своем ведет к стойкой инвалидизации больного, значительно влияющей на его качество жизни.

Аутоиммунная патология развивается вследствие патологической выработки аутоиммунных антител или пролиферации аутоагрессивных клонов киллерных клеток против антигенов собственных тканей организма, в результате чего развивается иммунный дисбаланс, который приводит к нарушению механизмов аутотолерантности.

Механизмы иммуносупрессии в организме обеспечивают регуляторные Т-клетки (Трег), которые контролируют иммунный ответ на аутоантигены и ограничивают ответ на чужеродные антигены, таким образом препятствуя развитию аутоиммунных заболеваний. Среди нескольких субпопуляций Т-клеток с регуляторной активностью выявлены хелперные CD4+ Т-клетки со стабильными маркерными характеристиками CD4+CD25+Foxp3+CD127low, которые играют важную роль в поддержании иммунной толерантности в организме человека.

У больных с аутоиммунными заболеваниями снижено количество циркулирующих Трег и нарушена их функция. Такие нарушения выявлены у больных ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, диабетом 1-го типа, псориазом, рассеянным склерозом [1—6]. Показано также, что Трег могут быть нестабильны на периферии, в очагах воспаления, где они должны проявлять супрессорную активность [7]. Продукция Трег и их функционирование связаны с активностью гена Foxp3, расположенного на Х хромосоме. Потеря супрессорной функции Трег коррелирует со снижением уровня экспрессии гена Foxp3 [8]. Повреждение этого гена в эксперименте влечет за собой массивное аутоиммунное воспаление паренхиматозных органов [9].

Иммунофенотипически Трег можно отличить по их характерным маркерам CD25hi и Foxp3+. Негативный маркер CD127low обратимо коррелирует с экспрессией Foxp3+. Это альфа-цепь рецептора ИЛ-7 (интерлейкин-7), который никогда не экспрессируется на Трег [10, 11]. Напротив, маркер CD25hi, альфа-цепь ИЛ-2, интенсивно экспрессируется на поверхности Трег и играет важную роль в их пролиферации и дифференцировке [12].

Трег появляются в тимусе, и в первые 2—3 дня неонатального развития расселяются в кровь и периферические лимфоидные органы [13]. В экспериментах на мышиных моделях с аутоиммунными заболеваниями было показано, что адоптивный перенос Трег, взятых от здоровых животных, редуцирует тяжесть клинических проявлений, предотвращает возникновение заболевания и может излечивать или замедлять его развитие [14]. Предположительно, адоптивная иммунотерапия может компенсировать дефект регуляторной функции иммунной системы и у больных РРС. В связи с этим становится актуальным поиск модельной системы для выделения и культивирования Трег, взятых из периферической крови больного. Принимая во внимание законы гистосовместимости, следует учитывать, что для этой цели могут быть использованы только аутологичные (собственные) Т-клетки.

В литературе описано несколько методов культивирования Трег, основанных на стимуляции СD4+CD25+CD127low Трег анти-CD3 и анти-CD28 антителами и ИЛ-2 [15]. Нами разработана уникальная методика экспансии Трег ex vivo (культивирование), эффективность которой была продемонстрирована на образцах крови 14 больных РРС и 17 донорах, которая позволила в течение 5—7 дней культивирования клеток-предшественников, выделенных из крови больного, в 30—40 раз увеличить количество Трег. Ранее мы провели комплексное клинико-иммунологическое исследование 52 больных с достоверным диагнозом РРС. В динамике были обследованы 19 пациентов из этой группы в стадии обострения и стадии ремиссии заболевания после частичного или полного регресса неврологической симптоматики. В ходе исследования в целом по группе было выявлено сниженное количество циркулирующих периферических Трег с фенотипическими характеристиками CD4+CD25+Foxp3+ в крови больных РРС. Отмечено, что больший количественный дефект Трег имеет место у больных в стадии обострения РС, а при переходе в стадию ремиссии число Трег возрастает. Проведя сопоставление клинических и иммунологических данных, была установлена обратная зависимость между содержанием Трег в крови больных и длительностью РРС, а также тяжестью РРС, выраженной в баллах инвалидизации. Более того, с помощью теста на иммуносупрессию нам удалось показать нарушенную супрессорную (функциональную) активность Трег вне зависимости от стадии заболевания [16, 17].

Цель настоящего исследования — оценка безопасности и клинико-иммунологической эффективности аутологичных (собственных) Трег CD4+CD25+Foxp3+CD127low, полученных методом краткосрочного культивирования клеток-предшественников, выделенных из периферической крови больного РРС (далее — вакцин Трег). Кроме того, была поставлена задача определить количество и функциональную активность Трег, экспрессирующих новый негативный маркер этих клеток CD127low. В связи с этим была набрана новая группа больных РРС для иммунофенотипирования лимфоцитов и определения уровня подавления пролиферации обычных CD4+CD25- Т-леток в присутствии Трег.

Проведено иммунофенотипирование образцов крови 30 больных РРС, 12 мужчин и 18 женщин в стадии ремиссии. Их возраст был от 19 до 47 лет. По расширенной шкале оценки степени инвалидизации EDSS их состояние соответствует 2,6±1,1 (1,5; 5,5) балла.

Диагноз был поставлен на основании критериев McDonald (2010) [18].

В течение 30 дней до забора крови с целью определения количества Трег больным не проводилась терапия метилпреднизолоном. Пациенты не получали ранее и не получают в настоящее время терапии препаратами, изменяющими течение рассеянного склероза (ПИТРС).

В группу сравнения вошли 23 здоровых, сопоставимых с больными по полу и возрасту.

В исследовании безопасности и клинико-иммунологической эффективности выращенных ex vivo Трег приняли участие 14 больных с достоверным диагнозом РРС. Среди них были 10 женщин и 4 мужчины в возрасте от 19 до 52 лет, с длительностью болезни с момента появления первых симптомов 4,1±2,1 (1,5; 8,3) года; исходный уровень инвалидизации у них, оцененный в баллах по расширенной шкале инвалидизации EDSS, составил 2,82±1,15 (1,5; 4,5). Все пациенты за год до включения в исследование имели 1—2 обострения РРС. Подробно характеристика больных этой группы представлена в таблице.

Клиническая часть исследования осуществлялась на базе Научного центра неврологии РАН и включала: набор пациентов для участия в исследовании, проведение оценки соответствия критериям включения и исключения.

Так, критериями включения были: диагноз ремиттирующего рассеянного склероза (McDonald, 2010); подписанная форма информированного согласия; не менее 1 обострения РРС за последние 12 мес до включения в исследование (визит 1); возраст 18—55 лет; неврологический дефицит по шкале EDSS от 0 — 5,5 балла. Критерии исключения: активные системные бактериальные, вирусные или грибковые инфекции; СПИД, гепатит B, гепатит C или положительные результаты тестов на антитела к ВИЧ, поверхностный антиген вируса гепатита B и антитела к вирусу гепатита C; лечение кортикостероидами в течение 1 мес до исходного уровня; лечение иммуносупрессивными препаратами (азатиоприн, метотрексат, кладрибин, циклофосфамид, митоксантрон) и иммуноглобулинами и/или моноклональными антителами (включая натализумаб) и финголимодом; одновременное применение препаратов, изменяющих течение РС (препараты интерферонов-β, глатирамера ацетат) и введение вакцины Трег; прием препаратов интерферона-β и глатирамера ацетата менее чем за 2 мес до визита скрининга; наличие какого-либо аутоиммунного заболевания кроме РС; прогрессирующая форма РС; злокачественное новообразование в любых системах органов или тканей; уровень печеночных ферментов в 2,5 раза выше верхней границы нормы; тяжелые или острые сердечно-сосудистые заболевания; почечная недостаточость (клиренс креатинина [eGFR] <60 mL/min/1,73 m2; тяжелые болезни легких, туберкулез; неконтролируемый сахарный диабет (уровень гликемии более 8,5 ммоль/л); выраженная депрессия или попытки суицида; любое медицинское нестабильное состояние, которое может помешать способности пациента сотрудничать с исследователем и выполнять процедуры исследования, что оценивается лечащим врачом; период беременности и лактации.

В ходе визитов пациента к лечащему врачу проводилась оценка соматического состояния, неврологического статуса, нежелательных явлений, регистрация рецидивов РРС, контроль за применением стероидных препаратов для купирования обострений и сопутствующей терапии.

Проводился забор образцов крови для оценки иммунофенотипа и культивирования Трег и однократное введение вакцины Трег, доставленной из лаборатории при комнатной температуре в течение 2—3 ч с момента ее изготовления.

Периферическую кровь больных РРС и здоровых забирали в пробирки с антикоагулянтом K3EDTA («Greiner Bio One», Austria). Разрушение эритроцитов проводили при помощи лизирующего буфера Red Blood Cell Lysis Buffer («Life Technologies», США) по протоколу производителя. 5·106 клеток из осадка ресуспендировали в 200 мкл DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline — сбалансированный солевой раствор без кальция и магния, «Life Technologies») и выполняли мечение Трег при помощи Treg Detection Staining Cocktail («Miltenyi Biotec», Германия) по протоколу производителя. Подсчет количества Трег проводили методом проточной цитометрии на цитометре MACS Quant («Miltenyi Biotec»). Для выделения клеток, экспрессирующих FoxP3 из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC, peripheral blood mononuclear cells), полученных из 1 мл цельной крови, использовали метод градиентного центрифугирования на Фиколе Lympholite-H, («Cedarlane», Canada) по протоколу производителя. 1 млн PBMC ресуспендировали и выполняли мечение CD4-FITC, CD25-APC антителами («Miltenyi Biotec»). Далее проводилась фиксация и пермобилизация клеток при помощи Transcription Factor Buffer Set («BD Pharmingen», США), мечение FoxP3-PE или Helios-PE Antibodies («BD Pharmingen») и последующий анализ на проточном цитометре. Анализ количества Трег в крови больных осуществлялся при визите отбора больных и через 4 нед после введения аутологичных Трег.

Исследование супрессорной активности Трег периферической крови больных РРС и здоровых проводили при помощи их смешивания с эффекторными (аутоагрессивными) клетками. Выделение Трег из периферической крови осуществляли методом магнитной сепарации с использованием Treg CD4+CD25+ Isolation Kit («Miltenyi Biotec»). В качестве эффекторных клеток использовали аутологичные CD4+CD25— клетки, содержащиеся в негативной фракции при магнитной сепарации Трег. Данные клетки были помечены витальным красителем CFSE (Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester, «Life Technologies») по протоколу производителя. Для активации CD4+CD25– клеток проводили их стимуляцию 5 мкг/мл анти-CD3 антителами и аллогенными PBMC, обработанными митомицином С (Mitomycin C, «Kyowa Hakko Kogyo», Япония). В 96-луночный планшет («Corning-Costar») вносили 5·104 СD4+CD25+ Трег клеток, 5·104 СD4+CD25- эффекторных клеток и 5·104 аллогенных PBMC, обработанных митомицином С в 200 мкл культуральной среды RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой («Life technologies»). Инкубация клеток длилась в течение 5 дней в СО2-инкубаторе при 37 °C, 5% СО2 и влажности 90%. Супрессорную активность Трег определяли методом проточной цитометрии по количеству делящихся клеток, детектированных по снижению интенсивности сигнала CFSE красителя. Индекс пролиферации вычисляли по следующей зависимости: индекс пролиферации = [CD4+CD25+:CD4+CD25–/CD4+CD25–].

Кровь для получения аутологичной сыворотки забирали в пробирки с активатором свертывания крови Vacuette Z Serum Clot Activator Collection Tubes («Greiner Bio One», Austria), центрифугировали при 400 × g 20 мин, отбирали сыворотку и инактивировали ее нагреванием на водяной бане в течение 40 мин при 56 °C. Образцы крови для культивирования Трег забирали в пробирки с антикоагулянтом K3EDTA. Далее выделяли PBMC методом градиентного центрифугироавния на Фиколе Lympholite-H и ресуспендировали клетки в раствор ACD-A USP, Anticoagulant Citrate Dextrose Solution — A («Cytosol Laboratories Inc.», США) с 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA PBS PН=7,2 MACS BSA Stock Solution, «Miltenyi Biotec»). Выделение фракции CD4+ клеток выполнялось методом магнитной сепарации с использованием CD4 MicroBeads Human Isolation Kit («Miltenyi Biotec») по протоколу производителя. Полученные CD4+ клетки высевали в 25 см² культуральные флаконы («Corning-Costar», США) в концентрации 5×105 клеток на 1 мл среды. Использовали культуральную среду RPMI-1640 («Life technologies») с 10% аутологичной инактивированной сывороткой, стимуляторами роста 100 U/мл ИЛ-2, TGF-beta (оба от «R&D Systems», США), 5 мкг/мл анти-CD3 («MedBioSpectr», Россия), 2 мкг/мл анти-CD28 («eBiosciences», США), а также антибиотиками 50 U/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина (оба от «Sigma», США). Культивацию проводили в СО2-инкубаторе при 37 °C, 5% СО2 и влажности 90% в течение 7 дней. На 3-й день культивации клетки рассеивали до концентрации 5×105 клеток на 1 мл среды и рестимулировали полной средой. По завершении процесса культивации производили подсчет количества выросших и живых клеток с помощью окрашивания трипановым синим Trypan Blue Solution 0,4% («Life Technologies»).

Для создания вакцины Трег полученный осадок Трег подсчитывали и отмывали от культуральной среды повторным центрифугированием в стерильном DPBS. Клетки ресуспендировали в 0,6% стерильном растворе реополиглюкина («Белмедпрепараты», Беларусь) до концентрации 1×108 клеток/мл и забирали в одноразовый медицинский шприц объемом 2 мл, который помещали в стерильную упаковку и в специальный контейнер для переноса клеток. Готовая и упакованная вакцина Трег незамедлительно транспортировалась для введения больному РРС. Специальной подготовки больного для введения вакцины Трег не требовалось. Инъекция осуществлялась в область передней брюшной стенки, подкожно. Предварительно место инъекции обрабатывалось спиртовым раствором согласно правилам антисептики.

Все больные подписали информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено этическим комитетом Научного центра неврологии РАН.

В литературе существуют противоречивые данные о количестве и функциональной активности циркулирующих Трег у больных РРС. Одни из них [19] установили снижение супрессорной активности и отсутствие изменения количества циркулирующих Трег по сравнению со здоровыми, тогда как другие [20, 21] продемонстрировали, что подавление функции Трег коррелирует со снижением количества этих клеток в периферическом русле. Мы провели иммунофенотипический анализ процентного содержания Трег в крови больных РРС с одновременным определением абсолютного количества этих клеток. Наши результаты показали, что содержание Tрег в крови больных составляет 5,6±2,1% (2,3; 12,4) от общего количества CD4±клеток, что достоверно ниже, чем в крови доноров 10,3±2,3% (7,1; 15,5) (p=0,0001) (рис. 1, а). Абсолютное число Трег в 1 мкл крови больных равно 26,3±19,2 (4,2; 75,4 Ме =27,7), в то время как у здоровых оно существенно выше и составляет 55,8±19,5 (23,4; 99,0 Ме =55,2) (p=0,0005). После проведения корреляционного анализа по Спирману между количественным и процентным содержанием Tрег нами была получена прямая значимая корреляция (см. рис. 1, б). Анализ супрессорной активности Трег показал снижение их регуляторной функции у больных РРС (см. рис. 1, в).

Как указывалось выше, по нашему предположению, и по мнению других авторов, заместительная терапия дефицита Трег выращенными вне организма клетками больного могла бы компенсировать количественный и качественный недостаток этих клеток [14, 22].

Нами разработана простая и эффективная методика получения больших количеств Трег клеток ex vivo. Так, из 10—15 млн клеток-предшественников CD4+, выделенных из небольшого количества периферической крови пациента, можно вырастить 300—400 млн Трег. Иммунофенотипический анализ выращенных ex vivo клеток показывает, что суспензия представляет собой однородную популяцию, которая на 97,3±2,1% состоит из клеток CD4+, 95±3,0% из которых имеют маркеры CD25+, 91,2±3,4% — экспрессируют Foxp3, и 90,7±4,0% являются негативными по CD127. Один типичный эксперимент представлен на рис. 2 (всего их более 30).

Дизайн проведенного нами пилотного исследование оценки безопасности и клинико-иммунологической эффективности применения аутологичной клеточной вакцины Трег для иммунотерапии РРС представлен на рис. 3.

Результаты исследования показали, что если исходное среднее процентное содержание Трег в крови больных РРС составляло 5,1±1,7% (2,6; 8,1) от общего количества CD4±клеток, то через 4 нед после введения вакцины Трег количество циркулирующих в крови больных Трег выросло и в среднем достигло уровня 8,2±2,0% (5,0; 11,1), р=0,001 (рис. 4).

Та же картина наблюдалась и при подсчете абсолютного числа Трег в крови больных РРС. Так, до применения вакцины Трег количество клеток было равно 39,7±9,2 (22,7; 52,2) в 1 мкл крови, после лечения количество Трег у больных достоверно увеличилось до 59,4±10,1 (42,8; 77,4) (p=0,0001).

Следующим этапом исследования явилось изучение клинической эффективности терапии вакциной Трег. На этапе отбора в группе у больных, включенных в исследование, имелись как минимум 1—2 обострения за год, предшествующих лечению, и индекс инвалидизации, в среднем равный 2,8±1,1 (1,5; 5,0). Клиническое состояние больных РРС контролировалось в течение 12 мес, и за этот период было отмечено сокращение процента больных, имеющих обострения РРС со 100 до 36% и стабилизация балла инвалидизации по шкале EDSS, который к 12-му месяцу наблюдения составил 2,7±1,1 (1,5; 5,0) (рис. 5).

Одним из ключевых моментов исследования явилось наблюдение за безопасностью применения вакцины Трег у больных РРС. С этой целью регистрировались местные и системные нежелательные явления, возникающие во время, сразу после и в течение 2 ч после инъекции вакцины Трег. Местные нежелательные явления с большей частотой возникали через 1—2 мин после введения в виде покраснения, припухлости и болезненности при пальпации в месте инъекции, которые самостоятельно регрессировали в течение 0,5—2 ч и не имели клинической значимости. С целью оценки системных нежелательных явлений регистрировались пульс, артериальное давление и температура тела, которые не имели значимого отклонения от нормы ни у одного из пациентов.

В настоящее время с открытием факторов роста Трег, созданием рекомбинантных препаратов ИЛ-2 и трансформирующего ростового фактора β, появлением методик сепарации отдельных субпопуляций Т-клеток появились возможности культивирования Трег с целью вырастить ex vivo достаточное количество этих клеток, чтобы компенсировать их дефицит в организме больного.

Существуют многочисленные исследования в моделях на животных, где показана эффективность применения этих клеток. Адоптивно перенесенные Tрег компенсируют аутоиммунный колит [23], диабет 1-го типа [24], подавляют экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит [25], замедляют прогрессию коллаген-индуцированного артрита в эксперимерте [26], предотвращают развитие реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) [27] и отторжение трансплантата [28].

Основываясь на полученных данных о дефиците периферических Трег в крови больных РРС и проведенных опытах, показывающих возможность экспансии линии аутологичных Трег, идентичных нативным Трег, взятым у одного и того же больного, мы предположили, что введение выращенных ex vivo аутологичных Трег больным РРС с целью восстановления количества циркулирующих в крови периферических Трег до уровня нормы, может использоваться для коррекции нарушенного клеточного взаимоотношения при аутоиммунном процессе. Нами проведено пилотное исследование, результаты которого показывают, что однократный адоптивный перенос выращенных ex vivo аутологичных Трег 14 больным РРС, имеющим изначально низкий уровень периферических Трег, позволяет увеличить количество этих клеток в крови в 1,5—2 раза.

Первичной конечной точкой оценки результата исследования являлось определение профиля безопасности введения вакцины Трег больным РРС как в момент инъекции, так и отсроченно. Детальный осмотр больных РРС непосредственно во время, сразу после и в течение последующих 2 ч введения выращенных ex vivo Трег выявил клинические незначимые изменения в месте инъекции, проявляющиеся в основном локальным покраснением, уплотнением и припухлостью, которые регрессировали в течение 0,5—1,5 ч. За весь период дальнейшего наблюдения, который составил 12 мес, не было зафиксировано других местных и соматических реакций.

Следующим важным этапом исследования явилась оценка клинических показателей. В связи с тем, что основными маркерами течения заболевания являются частота обострений и скорость нарастания инвалидизации больных, эти показатели мы выбрали в качестве вторичных конечных точек исследования. В результате было зафиксировано сокращение числа больных, имеющих обострения РРС по сравнению с исходным уровнем. Кроме того, регулярная оценка больных по расширенной шкале инвалидизации EDSS продемонстрировала отсутствие нарастания балла инвалидизации в течение 12 мес.

Таким образом, исследование показало, что лечение вакциной Трег безопасно, имеет не только иммунологическую, но и клиническую эффективность, из чего можно заключить, что индукция Трег ex vivo с последующим их введением больным РРС с целью коррекции дефицита регуляторного звена иммунитета может рассматриваться как новое направление в терапии РРС. Кроме того, полученные ранее данные позволяют расширить диагностические возможности иммунофенотипического анализа лимфоцитов, в том числе и определения количества Трег, используя последний в качестве прогностического показателя наступления обострения или стабилизации состояния при РРС.

Полученные в ходе исследования результаты являются не только многообещающими, но и ставят перед нами новые задачи, которые должны заключаться в накоплении клинического опыта и разработке плана управления рисками. С этой целью необходимым является инициация более крупномасшабных исследований с включением большего числа больных, проведение сравнительного анализа эффективности вакцины Трег с подтвердившими в настоящее время свою эффективность препаратами. Целесообразно в ходе следующих исследований уточнить длительность иммунологического эффекта после введения вакцины Трег и необходимую частоту инъекций выращенных ex vivo Трег. С клинической точки зрения, в дальнейшие исследования следует включить анализ не только частоты, но и тяжести обострений РРС. Кроме того, клинические показатели будут иметь большее значение при одновременной оценке нейровизуализационной картины с помощью магнитно-резонансной томографии. С научной точки зрения, следует продолжать изучение механизма действия выращенных ex vivo Трег на аутоагрессивные клетки, оценивая цитокиновый профиль нативных и культивированных Трег, анализируя межклеточные взаимодействия, что поможет в будущем влиять на нарушенную супрессорную активность Трег у больных РРС.