Специализация больших полушарий мозга обнаружена у многих млекопитающих [1-3]. У человека латерализация мозга наиболее отчетливо проявляется в строении корковых полей и в значительной степени определяет клиническую картину очаговых поражений головного мозга [4]. У лабораторных крыс - животных, наиболее часто используемых для моделирования инсульта, описана межполушарная функциональная асимметрия гиппокампа и медиальной префронтальной коры [5-8]. Аналогом асимметрии использования рук, наблюдаемой у пациентов - правшей и левшей, может служить асимметрия моторики передних лап крыс, которая отмечается в тесте доставания пищи преимущественно левой или правой лапой через отверстие в клетке [9]. Показано существенное влияние межполушарной асимметрии на развитие неврологических нарушений при обширном ишемическом инсульте (ИИ) у крыс [9]. В частности, окклюзия средней мозговой артерии (СМА) в доминантном полушарии вызывала большее повреждение ткани мозга и больший неврологический дефицит, чем при моделировании такого инсульта в недоминантном полушарии. Вместе с тем требует изучения вопрос, чем именно объясняется различие в выраженности нарушений функций ЦНС: размером ишемического повреждения или изначальной функциональной «доминантностью» ипсилатерального полушария. Практически важно, оказывает ли влияние локализация инсульта в доминантном и недоминантном полушариях на скорость и полноту восстановления функций ЦНС.

Для экспериментального решения этих задач наиболее адекватным представляется использование модели одностороннего ИИ в сенсомоторной зоне коры головного мозга, позволяющей четко верифицировать нарушение функций контралатеральной передней лапы и оценить динамику их восстановления [7].

Цель работы - анализ влияния локализации инсульта в правом или левом полушарии и «доминантности» полушария на восстановление моторики передней лапы при моделировании фокального ИИ в сенсомоторной зоне коры мозга.

Эксперименты проведены на 50 белых беспородных крысах - самцах с исходной массой 300-350 г. Животные содержались в клетках «Tecniplast» (Tecniplast, Италия) по 5 особей в условиях с естественным световым циклом и свободным доступом к воде и пище. Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ^[1].

Общая схема эксперимента включала: 1) двукратное тестирование интактных крыс в течение 2 нед на наличие функциональной асимметрии и определение неврологического статуса (цилиндр-тест, плавание и вибрисс-тест), по результатам которых были сформированы группы животных с четкой функциональной асимметрией передних лап (ФАПЛ) и исключены из эксперимента особи с исходными неврологическими (моторными) нарушениями; 2) моделирование одностороннего ИИ в сенсомоторной зоне коры головного мозга у крыс с верифицированной функциональной асимметрией; 3) мониторинг восстановления функций передних лап в течение 2 мес после моделирования инсульта; 4) морфологические исследования повреждения коры головного мозга; 5) анализ параметров восстановления функций передней лапы у крыс с ИИ в доминантном и недоминантном полушариях.

ФАПЛ определяли с помощью теста на захват пищи (reaching-test) [7]. В течение 2 нед до операции моделирования коркового инсульта крыс обучали брать корм лапами и определяли у них моторную асимметрию. Для этого крыс помещали в клетку из прозрачного плексигласа глубиной 45 см, шириной 14 см и высотой 35 см с щелевидным (1 см) вертикальным отверстием высотой 15 см на одной из стенок клетки. Снаружи этой стенки на высоте 3 см располагалась платформа с двумя углублениями на расстоянии 2 см от упомянутой щели. В эти углубления закладывали кусочки корма. Крыса захватывала один из кусков передней лапой и отходила вглубь клетки. В освободившееся углубление вновь закладывали корм. Крыса возвращалась и вновь захватывала один из кусков корма. Эту процедуру повторяли 50 раз за сеанс. В соответствии с методом определения доминантности полушария, основанном на биноминальном распределении [10], в случае, если крыса пользовалась одной лапой более чем в 29 попытках из 50, ее относили к особям, характеризующимся доминантностью соответствующего полушария головного мозга. Крыс, захватывающих корм одной из лап в 22-28 попытках из 50, относили к амбидекстрам и в дальнейших экспериментах не использовали. При формировании экспериментальных групп учитывали данные о доминантности полушарий, полученные непосредственно перед операцией.

Неврологическое тестирование проводили с помощью цилиндр-теста, плавания и вибрисс-теста (в соответствии с описанием, приведенным в статье В. Kolb и соавт. [7], с нашей модификацией) для определения базового уровня моторики передних лап.

Цилиндр-тест. Крысу помещали в прозрачный цилиндр диаметром 20 см и высотой 50 см на 5 мин. Животные исследовали вертикальные стенки цилиндра, поднимаясь на задние лапы и используя передние лапы. Оценивали количество касаний стенок цилиндра правой и левой лапами в течение 5 мин при не менее чем 15 вертикальных подъемах с касанием стенок. Если количество вставаний на задние лапы было меньше, тест повторялся через 30 мин. Количество касаний стенок цилиндра лапами в двух попытках суммировали.

Активность лапы, контралатеральной повреждению мозга, определяли в % по формуле: Активность лапы (правой или левой) = количество касаний лапой (правой или левой)/количество касаний правой лапой + количество касаний левой лапой ×100%.

Плавание (forepaw inhibition test). Крыс обучали плыть в сторону платформы, расположенной на противоположной стороне бассейна прямоугольной формы (длиной 120 см, шириной 40 см). Обученные интактные животные плывут прямолинейно, не касаясь стенок бассейна. При этом они держат передние лапы на поверхности воды и не используют их для гребли. Учитывали активность включения передних лап в процесс плавания в баллах: 0 - крыса совершает активные гребки лапой, контралатеральной повреждению мозга (другая лапа не совершает гребков); 1 - крыса активно гребет одной лапой, однако кратковременно способна удержать лапу в неподвижном положении; 2 - лапа удерживается в неподвижном положении, но совершает 1-2 гребка за дистанцию; 3 - крыса проплывает дистанцию, не совершая гребков; при легком удерживании крысы во время плавания, животное совершает активные гребки одной лапой; 4 - крыса не использует передние лапы для гребли как при свободном плавании, так и при легком удерживании в процессе плавания.

Каждое тестирование состояло из 3 сессий с перерывом в 3 мин. Рассчитывали среднее количество баллов двух последних сессий. На дооперационном этапе проводили 4 сеанса обучения по 5 сессий в течение 2 нед.

Вибрисс-тест (limb placing test) оценивает реакцию поиска опоры лапой в ответ на раздражение вибриссов. Крыса, удерживаемая на весу, подносится к краю стола. В ответ на прикосновение вибриссов в течение 3 с к столу животное ставит на него лапу. Оценка выполнения теста осуществлялась в баллах: 0 - крыса не тянется лапой к столу в ответ на стимуляцию вибриссов в течение 5 с; 0,5 - крыса ставит лапу, но после раздражения вибриссов в течение более 3 с, или животное тянется лапой, но не касается стола; 1 - нормальное выполнение теста. Учитывали общее количество баллов в 10 сеансах тестирования с каждой стороны.

По результатам неврологического тестирования в дальнейшие эксперименты включали только тех крыс, у которых отсутствовал неврологический дефицит: выполнение вибрисс-теста с оценкой 10 баллов правой и левой лапой; в тесте плавания крыса плывет прямолинейно в сторону платформы, не касаясь стенок бассейна и не совершая гребков передними лапами; в цилиндр-тесте активность правой или левой лапы не менее 40%.

Моделирование ИИ в сенсомоторной зоне коркового представительства передней лапы проводили по методу В. Kolb и соавт. [7]. Крыс наркотизировали (кетамин 120 мг/кг и седуксен 10 мг/кг внутрибрюшинно), выполняли краниотомию по координатам +4; –5 мм от брегмы и 1,5; 4,5 мм слева или справа от средней линии. Прямоугольный костный фрагмент удаляли. По периметру костного окна вскрывали твердую и паутинную мозговые оболочки u-образно, оставляя нетронутой латеральную сторону. Образовавшийся лоскут отгибали свободным концом кнаружи. Далее удаляли мягкую мозговую оболочку с сосудами, питающими кору мозга, с помощью стерильного ватного тампона, смоченного физиологическим раствором. После тщательного гемостаза оставшийся лоскут твердой мозговой оболочки возвращали на прежнее место. Рану ушивали. Антибиотики не использовали.

В качестве контроля использовали животных (6 крыс), которым были выполнены все этапы операции, за исключением удаления мягкой мозговой оболочки («ложный инсульт»).

Оценку постинсультных морфологических изменений мозга проводили через 1 и 3 суток (по 3 крысы в каждый срок) и через 56 суток после операции (24 крысы - все животные, прошедшие тестирование). Животных глубоко наркотизировали (кетамин 200 мг/кг внутрибрюшинно). Перфузию мозга выполняли трансаортально 150 мл раствора фосфатного буфера с pH 7,4, после чего 600 мл 4% нейтрального фиксирующего раствора параформальдегида, охлажденного до 4оС. Крыс декапитировали, головной мозг извлекали, готовили замороженные серийные коронарные срезы (толщиной 80 мкм). Срезы окрашивали по методу Ниссля.

Статистическая обработка данных выполнялась с помощью программы Statistica 6.0 (Statsoft).

Для определения достоверности различия количества крыс-левшей и правшей в исследуемой популяции использовался критерий χ². Оценка различий относительных показателей функциональных тестов в группе с корковым инсультом и «ложным инсультом» проводилась с помощью критерия Манна-Уитни. Анализ различий относительных показателей функциональных тестов в группах крыс в зависимости от локализации инсульта и «доминантности» полушария проводился с использованием критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони для двух пар сравнений.

Предоперационному отбору было подвергнуто 50 крыс. У 41 особи выявлена доминантность: 16 (32%) крыс захватывали пищу преимущественно правой лапой, 25 (50%) - левой (p<0,05), 9 (18%) крыс отнесены к амбидекстрам. Среди крыс с верифицированной доминантностью полушарий из эксперимента исключены 11 особей из-за наличия неврологического и моторного дефицита по данным вибрисс-теста, цилиндр-теста и плавания (не обучились плыть в бассейне прямолинейно в сторону платформы, не касаясь стенок бассейна; крысы совершали гребки передней лапой). Из 30 животных с ФАПЛ и прошедших неврологический отбор у 24 было проведено моделирование коркового инсульта, 6 особей составили группу с «ложным инсультом», операция в данном случае проводилась на правом полушарии.

При последующем анализе функционального восстановления передней лапы после воспроизведения коркового инсульта в соответствующей зоне коры головного мозга были сформированы группы в соответствии с локализацией инсульта (правое/левое полушарие) и доминантностью (табл. 1).

Гибели животных после моделирования инсульта и в группе контроля («ложный инсульт») не было. Морфологические исследования выявили формирование и последующую организацию инфаркта коры, не выходящего за пределы зоны удаления мягкой мозговой оболочки. Это соответствует данным, полученным в других лабораториях [7, 11, 12]. Через 1 сутки после операции определялись зоны паннекроза и перифокального отека. Через 3 суток вокруг зоны инфаркта имело место скопление клеток глии и лейкоцитов (глиомезодермальный вал). Через 56 суток визуализировали кисту или рубец с деформацией близлежащих структур полушария.

Моделирование ИИ в сенсомоторной зоне коры мозга вызвало развитие стойких нарушений моторики передней лапы, достоверно регистрируемых в цилиндр-тесте, плавании и вибрисс-тесте (табл. 2, рис. 1).

Результаты сравнения исследованных показателей моторики передней лапы у животных с инсультом, разделенных на группы в зависимости от поврежденного полушария и «доминантности» полушария (см. табл. 1), представлены на рис. 2.

В многочисленных экспериментальных исследованиях на моделях фокальных повреждений мозга было показано, что неврологический дефицит различается в зависимости от того, на каком полушарии производилась операция [13-18]. В частности, в исследовании [9] у крыс-правшей при окклюзии СМА в левом полушарии отмечались бульшие размеры инфаркта и регистрировались более выраженные нарушения функций ЦНС, чем в правом. Однако не ясно, чем обусловлено наблюдаемое различие: неодинаковыми размерами инфаркта в правом и левом полушариях или функциональным значением левого полушария в анализируемой популяции животных. Кроме того, не известно, связан ли неврологический дефицит с доминантностью полушария, выявленной в тесте захвата пищи лапой. Не исключено, что более тяжелое течение инсульта в левом полушарии характерно для всей популяции исследованных крыс.

Для того, чтобы ответить на поставленные вопросы, мы провели исследования на модели инсульта, размеры которого заранее установлены пределами удаления фрагмента мягкой мозговой оболочки в сенсомоторной зоне коры. Животных включали в экспериментальные группы таким образом, чтобы исследовать асимметрию полушарий с учетом фактора «доминантности» (то есть деления крыс на «правшей» и «левшей») и без учета такового (то есть моделирование инсульта на правом или левом полушарии). Полученные данные показали, что именно «доминантность» полушария, выявленная в тесте захвата пищи, определяет различия в восстановлении функций ЦНС после инсульта, причем лучшие результаты были получены при инсульте в доминантном полушарии. Исследованный нами феномен доминантности в тесте захвата пищи, по данным других авторов, ассоциирован с латерализацией восприятия тактильных раздражений [19] и асимметрией мозгового кровотока [20, 21]. Последнее может объяснять различие размеров инфаркта в правом и левом полушарии, выявленное в упомянутой выше работе [9]. По-видимому, с этим связано и расхождение полученных результатов о лучшем восстановлении функций при инсульте в доминантном полушарии с результатами этого исследования (более выраженный неврологический дефицит при окклюзии СМА в доминантном полушарии).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что при интерпретации результатов исследований модели инсульта, затрагивающего сенсомоторные зоны коры мозга, должны учитываться особенности восстановления функций ЦНС, связанные с функциональной асимметрией полушарий мозга. Определение асимметрии полушарий с помощью теста захвата пищи передней лапой позволяет осуществлять дооперационный отбор животных с прогнозируемой динамикой восстановления функций. Это расширяет возможности моделирования инсульта с вовлечением сенсомоторной коры в исследовании эффективности терапевтических средств.