Микробиом лечебных грязей, применяемых в Татарстане

Лечебное применение грязей (пелоидотерапия), несмотря на недостаточные доказательства эффективности, находит широкое распространение благодаря тому, что в целом снижает уровень стресса, улучшает обмен веществ, оказывает антибактериальный, противовоспалительный и обезболивающий эффекты. В состав лечебных грязей (пелоидов) входят газы, микроэлементы, биологически активные вещества, схожие по структуре с некоторыми гормонами, и микробные метаболиты. По своему происхождению, определяющему особенности их состава и лечебные свойства, пелоиды делятся на 6 типов: торфяные грязи, сапропели, сульфидные иловые грязи, глинистые илы, сопочные и гидротермальные грязи. Считается, что оздоравливающим эффектом обладают именно компоненты, проникающие через кожу. Использование пелоидов для специальных процедур, дополняющих применение минеральных вод, показывает хорошие результаты в лечении ревматических, вертеброгенных заболеваний, болевых синдромов, невралгий разого генеза, инфицированных ран, дерматологических и дермокосметических изменений и др. [1—4]. Предполагают, что механизм уникальных эффектов грязелечения заключается в насыщении организма недостающими микроэлементами и биологически активными веществами.

Точный механизм, обусловливающий полезные свойства лечебных грязей, до сих пор не выяснен. Известно, что вклад в благотворное влияние пелоидов вносят их минералогия, химия, физические и физико-химические свойства [5]. В то же время, по некоторым данным, присутствие микроорганизмов в пелоидах не может не влиять на терапевтические свойства последних [6]. Анализ испанских образцов термальных вод и пелоидов на разных стадиях созревания с использованием платформы секвенирования MiSeq Illumina показал преобладание α- и β-протеобактерий в пробах воды, тогда как в пелоидах преобладали γ-протеобактерии. При этом профили биоразнообразия обнаружили низкий уровень сходства между водой и пелоидами, сообщество которых изменялось на ранних стадиях созревания и достигало стабильности через 2 мес [7]. Следует отметить, что метагеномные исследования пелоидов дают полное представление о имеющемся в образцах биоразнообразии, однако вклад культивируемых микроорганизмов, продуцирующих разные биологически активные метаболиты, в терапевтический эффект пелоидов представляется особенно значимым.

Цель настоящей работы — характеристика микробиома лечебных грязей, применяемых в республике Татарстан, путем идентификации спектра культивируемых микроорганизмов методом времяпролетной масс-спектрометрии, полного анализа бактериальных сообществ с помощью высокопроизводительного секвенирования 16S РНК и определения их биоразнообразия и функционального потенциала на основе выявленных генетических детерминант.

Лечебные грязи с территории Республики Татарстан и поступающие из Республики Крым в лечебно-курортные учреждения Татарстана анализировали на микробиологические показатели, регламентированные «Методическими указаниями по санитарно-микробиологическому анализу лечебных грязей» (утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 11 сентября 1989 г. №143-9/316-17) взамен методических рекомендаций «Оценка санитарно-бактериологического состояния лечебных грязей различных типов» (утв. Минздравом СССР 12 марта 1985 г.). Все образцы грязей имели бальнеологические заключения, выданные на основе протоколов физико-химических, радиологических, санитарно-микробиологических исследований, которые были проведены Российским научным центром медицинской реабилитации и курортологии (ФГБУ «РНЦ МРиК» Минздрава России), архивов документов и банка данных фонда «РНЦ МРиК». Санитарно-микробиологические анализы проводили в ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан» (Казань). Анализ микробных сообществ молекулярно-генетическими методами осуществляли в Казанском (Приволжском) федеральном университете Минобрнауки России.

Дизайн исследования включал анализ пелоидов, используемых в лечебно-профилактических учреждениях (табл. 1) с помощью методов классической микробиологии и молекулярной биологии.

Таблица 1. Учреждения, осуществляющие пелоидотерапию определенными типами грязей

Лечебные грязи, применяющиеся в Республике Татарстан, представляют собой природные коллоидальные органоминеральные образования, которые обладают высокой пластичностью, теплоемкостью и медленной теплоотдачей, содержат биологически активные вещества и живые микроорганизмы. Местные грязи — это сапропели (донные отложения пресных водоемов) и торфяные отложения болот, которые используются соответственно в лечебно-профилактических учреждениях №1 и 2. Учреждения №3—5 пользуются привозными иловыми сульфидными грязями (донные отложения соленых водоемов, бедные органическими веществами и обогащенные сульфидами железа и водорастворимыми солями) южных регионов России (см. табл. 1). Пробы грязей каждого учреждения отбирали от 5 до 12 раз в течение 2021—2022 гг.

В исследование были включены участники, непосредственно проводившие экспериментальные исследования: заведующий лабораторией Центра гигиены и эпидемиологии в Республике Татарстан, аспиранты и сотрудники Казанского федерального университета.

Оценка полученных результатов была проведена на основе экспериментальных данных, полученных при анализе пелоидов в лабораторных условиях, и анализа научной литературы по теме исследования.

Выделение и идентификация культивируемых микробных изолятов (протокол №1). Сразу после доставки образцов грязей в лабораторию осуществляли серию разведений образцов пелоидов и их высев на следующие среды для культивирования микроорганизмов: лактозопептонная среда Эйкмана для первичной идентификации энтеробактерий (ООО «Биотехновация»); мясопептонный агар, неселективная среда для культивирования широкого спектра микроорганизмов («BioMedia»), среда Эндо для выделения и дифференциации грамотрицательных микроорганизмов кишечной группы («Микролаб»); среда Сабуро для культивирования грибов медицинского значения («BioMedia»), желточно-солевой агар для выявления солеустойчивых микроорганизмов, в том числе коагулазоположительных стафилококков (ВНИИМС — филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН) и цетримидный агар для выявления синегнойной палочки («BioMedia»). Таксономическую идентификацию чистых культур выделенных микроорганизмов проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией MALDI-TOF MS (масс-спектрометр MALDI-7090 с программным пакетом MALDI SolutionsTM). При применении этой технологии анализируют спектральные характеристики значительного количества белковых молекул, преимущественно рибосомных белков, являющихся уникальным «отпечатком пальца» конкретного микроорганизма.

Молекулярно-генетический анализ сообщества микроорганизмов проводили согласно следующему протоколу (№2): пробы пелоидов гомогенизировали по прибытии, ~1 г (влажная масса) каждой пробы отбирали стерильным способом для выделения ДНК с помощью набора Miniprep Kit («Axygen», США) согласно протоколу производителя. Концентрацию ДНК определяли и нормализовали до не более чем 10 нг/мкл. Качество выделения ДНК оценивали путем подтверждения амплификации гена 16S рРНК, нацеленного на область V3—V4 гена 16S рРНК бактерий с помощью полимеразной цепной реакции и гель-электрофореза.

Подготовку библиотеки и секвенирование выполняли с помощью Illumina MiSeq. Предварительную обработку и последующий анализ последовательностей проводили с использованием пакета программного обеспечения Mothur [8] на платформе Galaxy [9, 10]. Анализ данных был выполнен в соответствии с учебным руководством Galaxy Training [11]. Выбор оперативной таксономической единицы (OTU) осуществляли при пороге идентичности 97% и классифицировали по справочной базе данных Greengenes 13-8-99 [12]. Показатели α- и β-разнообразия были получены с помощью платформы Galaxy. Оценку функциональных профилей сообществ проводили с использованием инструмента Global Mapper на платформе iVikodak [13].

Исследование не включало проведение медицинских манипуляций. Методика исследования не включала пациентов лечебно-профилактических учреждений и не требовала разрешения Этического комитета. Протоколы исследований соответствовали Методическим указаниям №143-9/316-17 (протокол №1), инструкциям производителя масс-спектрометра MALDI-7090 с программным пакетом MALDI SolutionsTM (протокол №2) и методикам научных статей [9—13].

Обработку данных и построение графиков распределения таксонов среди образцов проводили в стандартной компьютерной программе Excel 7.0. Значения, полученные с помощью Global Mapper платформы iVikodak для функциональных профилей сообществ согласно наличию генетических детерминант, представлены как относительное количество функциональных генов в соответствии с KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов (https://www.genome.jp/ke).

Среди требований, предъявляемых к лечебным грязям, важнейшими являются микробиологические показатели, регламентированные методическими указаниями (МУ 143-9/316-17, утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 11 сентября 1989 г.). В пелоиде на 1 г должно содержаться не более 5∙10⁵ аэробных бактерий. Коли-титр кишечной палочки Escherichia coli (наименьшее количество образца, в котором обнаруживаются жизнеспособные бактерии) — 10 г и более, перфрингенс-титр 0,1 г. Патогенная кокковая флора и Pseudomonas. aeruginosa в 1 г и вирулентная форма Clostridium perfringens должны отсутствовать.

Практически во всех образцах, анализ которых представлен в табл. 2, доминирующими являются непатогенные бациллярные формы культивируемых бактерий, в частности Bacillus megaterium, B. simplex, B. firmus, B. pumilus, B. altitudinis. Также часто встречающимся микроорганизмом филума Actinobacteria оказался Rhodococcus erythropolis. Необходимо отметить, что родококки способны окислять высокомолекулярные алканы и сложные хлорорганические соединения, которые трудно поддаются биодеградации [14]. Представители рода Rhodococcus утилизируют бензол, толуол, нафталин, гербициды и полихлорбифенилы, а также фармацевтические поллютанты [15], что делает эти бактерии важными участниками процессов биоремедиации загрязнений в лечебных грязях и повышения качества и безопасности последних. В минорных количествах были обнаружены Pseudomonas stutzeri, Micrococcus luteus, Acinetobacter lwoffii, Paracoccus yeei и ряд других бактерий (см. табл. 2).

Таблица 2. Таксономическая принадлежность и количественная характеристика культивируемых микроорганизмов микробиома образцов пелоидов

Примечание. * — группы микроорганизмов по количеству колоний на 1 г пелоида: a — до 3; b — 3—30; c — 30—100; d — 100—300; e — 300—1000; ** — в случае сходства спектральных характеристик белков видовую принадлежность обозначали через косую черту.

Наибольшим разнообразием культивируемых микроорганизмов отличалась лечебная грязь санатория «Бакирово», однако при высеве на цитратный и цетримидный агар из исследованных 20 проб в 2 были обнаружены единичные колонии синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa, которая условно-патогенна для человека и является возбудителем нозокомиальных инфекций. В 1 случае P. aeruginosa была выявлена в образце лечебной грязи санатория-профилактория «Балкыш». Однако вследствие того, что P. aeruginosa не образует спор, термическая обработка лечебной грязи допускает ее дальнейшее применение. Таким образом, санитарно-микробиологический анализ лечебных грязей подтверждает их безопасность и вносит вклад в регламенты обработки некоторых образцов грязей.

Метагеномный анализ выявил доминирующие филумы: во всех 5 образцах в разных соотношениях преобладали представители Firmicutes, Proteobacteria и Actinobacteria(см. рисунок, а, на цв. вклейке).

Распределение бактерий по таксономическим группам.

а — распределение по филумам; б — по семействам внутри филума Proteobacteria; в — по семействам внутри филума Firmicutes.

К Proteobacteria в основном относятся грамотрицательные бактерии, среди которых представители семейств псевдомонад, родококков, энтеробактерий (см. рисунок, б, на цв. вклейке). В филум Firmicutes входят грамположительные бактерии, в том числе спорообразующие бациллы (см. рисунок, в, на цв. вклейке). Наличие культивируемых форм, выявленных с применением методов классической микробиологии, было подтверждено на молекулярно-генетическом уровне. В то же время богатый спектр бактерий, которые были выявлены при пиросеквенировании 16S РНК, свидетельствует о том, что исследуемые пелоиды отличаются по микробному составу и процентному содержанию отдельных таксонов: выраженное доминирование одного семейства зафиксировано в образцах 1 (Staphylococcaceae, 62% от общего количества фирмикут), 4 (Sphingomonadaceae, 63% от всех протеобактерий) и 5 (Caldicellulosiruptoraceae, 46% фирмикут). Стафилококки широко распространены в почве, воздухе, в составе нормальной кожной микрофлоры человека и животных. Представители семейства Sphingomonadaceae разлагают ароматические соединения, что обусловливает их значение для восстановления окружающей среды. Семейство Caldicellulosiruptoraceae включает термофильные, анаэробные, грамположительные, неспорообразующие бактерии, которые расщепляют и ферментируют сложные углеводы из растительного сырья, такие как целлюлоза и гемицеллюлоза. Кроме того, были обнаружены бактерии с неопределенным таксономическим положением — особенно много их оказалось в образцах 4 (76% от количества фирмикут) и 5 (86% от количества протеобактерий) (см. рисунок, б, в, на цв. вклейке).

Высокий уровень α-разнообразия, характеризующего наличие в сообществе многих различающихся видов, был установлен для всех образцов (табл. 3). Значительные отличия между исследованными пелоидами были подтверждены с помощью анализа β-разнообразия сообществ (табл. 4).

Таблица 3. Альфа-разнообразие бактериальных сообществ образцов пелоидов

Примечание. * — реальное количество ОТЕ в сообществе; ** — разнообразие и выровненность в структуре сообщества (чем выше, тем больше разнообразие); *** — степень выраженности доминирования определенных видов в структуре сообщества (низкие значения — отсутствие выраженных доминантов).

Таблица 4. Бета-разнообразие сообществ микроорганизмов в образцах пелоидов

Примечание. Значения, возрастающие от 0 к 1, отражают повышение разнообразия при сравнении образцов.

Учитывая совокупность генетических детерминант микробных сообществ пелоидов, определяли относительное количество генов, ответственных за выполнение тех или иных функций. Естественно, что основные функции связаны с метаболизмом питательных субстратов и поэтому представлены значительным количеством генов (табл. 5). В то же время установлено, что все сообщества обладают способностью синтезировать антибиотики, а также разлагать полиароматические углеводороды, циклические соединения — ксилол, толуол, нитротолуол, а также диоксины, являющиеся кумулятивными и наиболее опасными ядами с LD₅₀ в некоторых тестах на животных, измеряемой в пикограммах на 1 г массы тела [16].

Таблица 5. Функциональная активность бактериальных сообществ в образцах пелоидов

Примечание. Интенсивность серого цвета пропорциональна количеству функциональных генов в сообществе.

Интерес к поиску новых пелоидов во всем мире постоянно растет. Особое внимание уделяется отсутствию актуальной информации об отдельных аспектах пелоидотерапии, спорным взглядам на ее применение и механизмы действия [1]. Рассматриваются перспективы приготовления бактерицидных природных глин, искусственно дополненных полезными веществами [17], аспекты безопасности оздоравливающих и даже съедобных пелоидов [18]. В настоящей работе подтверждена безопасность исследуемых пелоидов, проверка которой входит в стандарт бальнеологических заключений. В то же время анализ гигиенических аспектов микробиологии термальных грязей до сих пор остается без должного внимания в плане оценки качества их микробиологической составляющей [19]. В представленной работе установлено, что гигиенические аспекты грязей, применяемых в Республике Татарстан, вполне удовлетворительны и не могут вызывать негативных последствий пелоидотерапии. Состав микробиома пелоидов практически не освещен в современной литературе, что показывает приоритетность полученных в настоящем исследовании результатов.

На территории России выявлено и разведано более 260 месторождений лечебных грязей; используются 4 основные генетические группы пелоидов — торфяная, сапропелевая, иловая сульфидная и сопочная [20]. Месторождения всех этих групп не защищены от антропогенного воздействия в силу своего поверхностного залегания, что обусловливает значимость выявления микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики, обладающие токсическим эффектом. Роль автохтонной микрофлоры в формировании биологической активности и антимикробных свойств пелоидов несомненна [6]. Так, для Эуганского термального района, известного со времен Римской империи лечебными свойствами пелоидов, показан рост зеленой микробной биопленки с цианобактериями и целевыми видами Phormidium sp. ETS-05 в качестве основных компонентов благодаря их способности синтезировать противовоспалительные молекулы [21]. Однако углубленные исследования микробиоты, колонизирующей пелоиды, используемые во всем мире, отсутствуют [21]. В настоящем исследовании установлены доминирующие филумы во всех 5 образцах исследованных пелоидов — это представители Firmicutes, Proteobacteria и Actinobacteria. Показано, что исследуемые пелоиды отличаются по микробному составу и процентному содержанию отдельных таксонов. Известно, что только виды рода Bacillus в общей сложности включают 87 новых метаболитов и являются многообещающим источником для открытия следующих [22]. Ранее было установлено, что комплекс их секретируемых соединений, так называемый бациллярный секретом, обусловливает биологические эффекты и роль в противодействии инфекционным заболеваниям и онкологическим патологиям человека [23]. На сегодня только ограниченные данные свидетельствуют о том, что грязи обладают определенными свойствами, которые могут объяснить их действие на микробиом человека, в частности кожный микробиом, с разным воздействием на комменсальные и патогенные микроорганизмы [24]. В косметической области грязь может усилить активность глутатиона и супероксиддисмутазы в коже, при этом позитивное влияние оказывает химический состав грязей, богатый Ca²⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Na⁺ и другими минеральными элементами, а также органическими веществами (гуминовые кислоты, фульвокислоты, ацетат) [25]. Одной из важнейших задач здравоохранения является обеспечение населения недорогими и эффективными отечественными лекарственными средствами, к которым можно отнести лечебные грязи, высокая лечебная ценность которых подтверждена многолетним положительным опытом пелоидотерапии [26].

Считается, что термическое воздействие всех используемых видов пелоидов примерно одинаково, хотя химическое действие различается [27]. С помощью анализа проб солевого ила из гравитационных кернов юго-западной части суббассейна Восточно-Вьетнамского моря были установлены основные (кварц, иллит, кальцит, хлорит, полевой шпат, каолинит) и второстепенные (галит, смектит, фторапатит, пироксен, амфибол) минералы, что при низком содержании токсичных элементов подтверждает возможность применения этих образцов в пелоидотерапии [28]. Краткая характеристика результатов изучения месторождений лечебных грязей Западного Казахстана, Северного Казахстана и Алматинской области свидетельствует о позитивном эффекте в терапии ряда заболеваний, при которых эффективно применение грязелечения [26]. Однако трансформация и деградация химических соединений в пелоидах осуществляется именно микроорганизмами, чья роль до сих пор остается малоизученной. На основе проведенного в настоящем исследовании анализа функциональных профилей микробных генов впервые было выявлено, что благодаря присутствующим в них микроорганизмам исследуемые пелоиды способны к деструкции опасных ксенобиотиков и синтезу антибиотиков. Таким образом, микроорганизмы вносят вклад как в обезвреживание токсикантов в пелоидах, так и в антибактериальные свойства последних. Полученные приоритетные результаты создают фундаментальный базис для последующего перспективного изучения роли микробиома пелоидов разного происхождения в их оздоравливающем действии.

Состав микробиома пелоидов практически не освещен в современной литературе. Даже анализ гигиенических аспектов микробиологии грязей до сих пор остается без должного внимания в плане оценки качества их микробиологической составляющей. Установлено, что гигиенические аспекты грязей, применяемых в Республике Татарстан, вполне удовлетворительны и не могут вызывать негативных последствий пелоидотерапии. В оздоравливающие эффекты пелоидов вносят вклад не только минералогия и физико-химические свойства, но и функции микробных сообществ. Охарактеризовано биоразнообразие исследуемых образцов пелоидов, показано, что во всех образцах в разных соотношениях преобладали представители филумов Firmicutes, Proteobacteria и Actinobacteria. Среди Firmicutes доминировали представители рода Bacillus. С использованием молекулярной идентификации бактериальных генов определен функциональный профиль сообществ, показавший, что они обладают способностью синтезировать антибиотики, а также разлагать опасные ксенобиотики — полиароматические углеводороды, циклические соединения и диоксины. Полученные результаты и примененный методологический подход обладают практической значимостью, позволяя выявлять ключевые функции микроорганизмов, важные для пелоидотерапии.

Работа выполнена в рамках программы «Приоритет 2030» и поддержана грантом РНФ №22-24-00036.

Участие авторов: дизайн исследования и написание текста — О.Н. Ильинская; сбор материала и экспериментальные методы — Л.Ф. Гафарова; методы биоинформатики — У. Курди; оформление таблиц и статистическая обработка — А.И. Колпаков; анализ полученных данных и редактирование — Г.Ю. Яковлева.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.