Разработка новых, более эффективных технологий восстановительной медицины приобретает особую значимость применительно к проблеме реабилитации пациентов с заболеваниями опорно-двигательного аппарата [1—3]. Снижение запасов традиционно используемых на курорте природных факторов для проведения бальнеопроцедур и пелоидотерапии требует рационального их использования и поиска новых месторождений, в том числе в перспективе, наряду с пелоидами могут применяться глины [4, 5]. Однако весь спектр действия пелоидов нельзя экстраполировать на глины, так как процесс их образования существенно отличается от лечебных грязей [6, 7]. Поэтому актуальной задачей курортологии является разработка и изучение влияния препаратов из желтой глины, обогащенной природным минералом бишофит, в целях улучшения ее терапевтического эффекта [8].

Цель исследования — изучить непосредственные эффекты применения препаратов из желтой глины Пятигорского карьера с добавлением бишофита при адъювантном артрите (АА).

Проведено интервенционное (экспериментальное), одноцентровое, контролируемое рандомизированное, неослепленное исследование с участием лабораторных животных в соответствии с представленной схемой (рис. 1).

Исследование выполнено на крысах-самцах (n=57) линии Вистар, половозрелых, массой 180—200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБУ ПГНИИК ФМБА России, регламентируемых СП 2.2.1.3218—14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)»; ГОСТ 33215–2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Животные находились по 4—5 особей в клетках, подстилкой являлись опилки нехвойных пород. Клетки подвергали ежедневной влажной уборке. Корм гранулированный выдавался ежедневно утром, доступ к питьевой воде был свободным. Животных ежедневно осматривали, заболеваний и падежа за время эксперимента не было. Работу проводили по принципам гуманного обращения с животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте и других научных целях (ETS № 123, Strasbourg, 1986) с изменениями от 22 июня 1998 г.

Исследование было проведено на базе отдела изучения механизмов действия физических факторов и отдела изучения курортных ресурсов ФГБУ ПГНИИК ФМБА России.

По плану завершение эксперимента осуществляли на 69—70-й день, через 1—2 дня после окончания курса аппликаций.

В качестве экспериментального воспроизведения воспалительно-дегенеративных заболеваний суставов животным моделировали АА однократным введением полного адъюванта Фрейда субплантарно в задние лапы по 0,1 мл.

В работе изучали лечебное действие желтой глины Пятигорского карьера, модифицированной бишофитом Волгоградского месторождения. В условиях лаборатории изучения курортных ресурсов ФГБУ ПГНИИК ФМБА России приготовляли образцы препаратов из желтой глины однократно на весь период проведения лечебного курса. Основными этапами в технологии подготовки глины для проведения процедур были ее механическое очищение от крупных примесей, затем разведение путем добавления воды или бишофита в двух концентрациях — 10 и 20%.

Животных декапитировали под эфирным наркозом. Проводили забор крови для получения сыворотки, исследования клинических показателей крови животных (морфологическое определение общего количества лейкоцитов и их состава) и иммунофенотипирования лимфоцитов в периферической крови. Извлекали тимус и селезенку для определения их клеточности.

Учитывая, что при АА развитие хронического воспаления сопровождается системными реакциями со стороны иммунокомпетентных органов, в оценке непосредственных эффектов применения препаратов из желтой глины Пятигорского карьера с добавлением бишофита изучали их влияние на основной популяционный и субпопуляционный составы лимфоцитов в периферической крови и общее количество лимфоцитов в тимусе.

В регуляции активности воспалительного процесса участвуют IL и гормоны, преимущественно глюкокортикоиды, в связи с этим в сыворотке крови животных определяли уровень кортизола, IL-1β и IL-6 методом иммуноферментного анализа.

Согласно условиям эксперимента, животные методом простой рандомизации были распределены на 5 групп. В 1-ю (контрольную) группу были включены здоровые животные без воздействия (n=5). В 4 опытные группы вошли животные с воспроизведением модели А.А. Во 2-й опытной группе (n=8) моделировали АА, лечебных воздействий не проводили. В 3—5-й опытных группах при достижении хронической стадии АА на 38-й день животным проводили лечебный курс из желтой глины и препаратов, приготовленных из нее и бишофита. Воздействия осуществляли наружно в виде аппликаций на задние лапы животных. Курс составлял 12 процедур через 1—2 дня, препараты из глины нагревали на водяной бане до 42ºС, экспозиция аппликаций составляла 15 мин. В соответствии со схемой эксперимента 3-я опытная группа (n=14) с 38-го дня АА получала лечебный курс аппликаций желтой глины без добавок, 4-я опытная группа (n=15) — аппликации желтой глины с 10% бишофитом, 5-я опытная группа (n=15) — аппликации желтой глины с 20% бишофитом.

Регистрацию исходов проводили методом проточной цитофлуориметрии на двухлазерном проточном цитометре Cytomics FC-500 («Beckman Coulter», США), для определения субпопуляционного состава лимфоцитов использовали следующие реактивы: Anti-Rat CD3 FITC, Anti-Rat CD4 PE, Anti-Rat CD8α PE, Anti-Rat CD45R-PE, Anti-Rat CD5 FITC, I-Ek МНС II-PE («eBioscience», США).

Определение содержания кортизола, IL-1β и IL-6 в крови животных проводили на иммуноферментном автоматизированном анализаторе (Chem Well, Software Version 6.3, США) с использованием набора реагентов для количественного определения кортизола (ООО «Компания Алкор Био», Россия) и наборы для количественного определения крысиного IL-1β и IL-6 («eBioscience», США).

Подсчет общего содержания лейкоцитов в периферической крови и тимусе проводили по общепринятой унифицированной методике в камере Горяева, результаты исследования вносили в протоколы и формировали электронную базу для дальнейшего статистического анализа.

Протокол исследования одобрен на заседании комиссии по биоэтике ФГБУ ПГНИИК ФМБА России (протокол № 1 от 25.02.16).

Для оценки результатов исследования использовали пакет программ Statistica 6.0 (США). Полученные данные оценивали с применением критерия Ньюмана—Кейсла для множественных межгрупповых сравнений и многофакторного дисперсионного анализа. Показатели представлены в виде медианы (Ме) и 25-го и 75-го процентилей (25—75‰). Различия считали достоверными при минимальном уровне значимости p<0,05.

В качестве объектов исследования использовали крыс-самцов линии Вистар, половозрелых, массой тела 180—200 г, а также препарат из желтой глины Пятигорского карьера, модифицированной бишофитом Волгоградского месторождения.

Лечебные эффекты модифицированной бишофитом желтой глины изучали на модели А.А. Содержание лейкоцитов в периферической крови в опытных группах не отличалось от контрольных животных: в 1-й группе — 9,8 (5,8—12‰)·10⁹/л, во 2-й — 6 (5—9,5‰)·10⁹/л, в 3-й — 7,8 (6—8,4‰)·10⁹/л, в 4-й — 10 (8—11‰)·10⁹/л, в 5-й — 8,8 (7—10‰)·10⁹/л. Во всех группах определяли лимфоцитарный профиль лейкоцитов. Поэтому дальнейший анализ иммунологической реактивности проводили по оценке пролиферации иммунокомпетентных органов и субпопуляционному составу лимфоцитов в периферической крови наряду с профилем провоспалительных цитокинов.

К завершению эксперимента возраст животных составил 6 мес, в этот период отмечают проявления акцидентальной инволюции тимуса [9]. Показатели масс тимуса и селезенки, а также их клеточность (общее количество лейкоцитов в тимусе) к концу эксперимента у животных с моделью АА не отличались от таковых у контрольных животных (табл. 1).

Дальнейшую оценку эффекторного звена клеточного иммунитета проводили по содержанию основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови (табл. 2).

Кроме того, при анализе влияния бальнеофакторов на течение АА оценивали уровень провоспалительных цитокинов (IL-1β и IL-6), которые отражают направленность системного и локального течения воспаления [10].

Содержание IL в контрольной и опытных группах достоверно не различалось. Отмечена высокая дисперсия IL у животных в опытных группах, что свидетельствует о влиянии других факторов на их содержание в периферической крови. Одним из них может являться уровень кортизола в крови, спектр действия этого гормона реализуется в регуляции функциональной активности лейкоцитов, в том числе провоспалительного профиля цитокинов. Так, уровень кортизола в группе животных с АА (184 (169—197‰) нмоль/л) снижался по сравнению с его содержанием у животных контрольной группы (205 (183—229‰) нмоль/л; р<0,1). Животные опытных групп с АА, получавшие бальнеопроцедуры, по уровню кортизола не различались между собой: в 3-й группе 180 (165—364‰) нмоль/л, в 4-й 285 (259—346‰) нмоль/л, в 5-й 221 (177—298‰) нмоль/л. Однако у части животных в опытных группах наблюдалось увеличение уровня кортизола на 50—150% по сравнению с животными с АА, не получавшими наружные лечебные курсы в виде аппликаций препаратов из желтой глины (бальнеопроцедуры). Учитывая системное действие кортизола, в каждой опытной группе были выделены две подгруппы, критерием разделения являлся уровень гормона (ниже или выше 200 нмоль/л). Так, в 1-й подгруппе содержание кортизола не превышало 200 нмоль/л, а во 2-й подгруппе было выше данного значения. Таким образом, для оценки влияния бальнеофакторов на уровень цитокинов в группах введен фактор содержания кортизола в крови животных (рис. 2).

Кроме того, у животных с моделью АА установлена положительная связь между клеточностью тимуса и IL-1β (r=0,6; p=0,08), а также прослеживается функциональная взаимосвязь между уровнем кортизола и клеточностью тимуса в виде обратной корреляционной связи (r= –0,8; p<0,03). По-видимому, бальнеопроцедуры при хроническом системном воспалении изменяют межсистемные гормонально-иммунные взаимодействия, изменяя при этом и пролиферативную функцию тимуса.

После бальнеопроцедур установлены прямые связи между уровнем IL и ИРИ. Так, после использования нативной желтой глины установлена связь между IL-1β и ИРИ (r=0,8; p=0,03), после желтой глины с 10% бишофитом — между IL-6 и ИРИ (r=0,8; p=0,03) и после желтой глины с 20% бишофитом — между IL-6 и ИРИ (r=0,8; p=0,004). Данные взаимосвязи подтверждают преобладающее влияние IL-6 в регуляции снижения напряжения в клеточном звене иммунного ответа под влиянием модифицированной 20% бишофитом желтой глины.

При проведении экспериментального исследования никаких нежелательных явлений не наблюдалось.

Таким образом, в результате исследования курсового наружного применения аппликаций желтой глины при АА установлено увеличение клеточности тимуса, сниженной вследствие его возрастной инволюции, у животных контрольной группы и опытной группы с моделью АА без лечения. Развитие А.А. сопровождалось нарушением в соотношении популяционного состава лимфоцитов с увеличением В-клеток, снижением T-клеток, ИРИ за счет уменьшения T-хелперов в периферической крови и повышением активированных T-клеток. Под воздействием лечебных процедур изменения лимфоцитов в периферической крови направлены на восстановление их состава, что, по-видимому, связано с системной иммунной реакцией, учитывая увеличение пролиферативной активности тимуса.

В работе изучали лечебное действие наружного применения препаратов из желтой глины, обогащенной бишофитом, на экспериментальной модели АА в стадии хронического воспаления, курс 12 процедур (с 38-го до 69—70-го дня АА). Содержание лейкоцитов в крови животных подтверждает хроническую стадию воспалительного процесса. Так, их количество в опытных группах не превышает значений в контрольной группе. Установлено, что к моменту завершения эксперимента у животных контроля и опытной группы с АА без лечения определяется снижение клеточности тимуса, характерное для акцидентальной инволюции тимуса (см. табл. 1). В то же время животные 3—5-й группы, получавшие лечебные курсы препаратов из желтой глины, характеризуются однонаправленным влиянием на тимус исследуемых факторов в виде увеличения их клеточности. Это свидетельствует о стимуляции механизмов пролиферации во время акцидентальной инволюции, что не противоречит данным других исследований. Так, использование иммуномодуляторов, а именно полиоксидония, приводило к увеличению лимфоидных клеток в тимусе и изменяло их соотношение с тимикоэпителиальным окружением у крыс 6—7-месячного возраста [11].

Однако в периферической крови не происходило полного восстановления клеточного звена иммунного ответа, а наблюдалось снижение содержания Т-лимфоцитов преимущественно за счет T-хелперов (см. табл. 2). Существенный положительный эффект лечебного действия наружного применения препаратов из желтой глины связан с восстановлением активированных T-клеток в периферической крови, свидетельствующим о снижении иммунологической компоненты в реализации воспаления при АА.

В нашем исследовании воздействие бальнеофакторов осуществляли наружно, очевидным является неспецифическое их действие, по-видимому, опосредованное через системные механизмы, активирующие адаптационные реакции. Известны механизмы влияния бальнеопроцедур на кору надпочечников. Умеренная их стимуляция приводит к реализации эффектов глюкокортикоидов, в том числе и на тимикоэпителиальное окружение, а именно созревание и дифференцировку лимфоцитов в тимусе [12].

Оценка основных провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6) с учетом влияния кортизола позволила не только систематизировать результаты по подгруппам в зависимости от уровня кортизола и связанного с ним содержания IL-1β, но и выявить особенности реагирования на лечебные курсы с использованием желтой глины в зависимости от концентрации бишофита (см. табл. 3).

Определяются общие признаки восстановления пролиферативной активности тимуса и относительного содержания как популяций, так и субпопуляций лимфоцитов периферической крови. Выявленные противовоспалительный и иммуномодулирующий эффекты препаратов из желтой глины с добавлением бишофита свидетельствуют о реализации механизмов саногенеза на модели АА.

Источник финансирования. Работа проведена при поддержке ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Г.В. Саградян, А.В. Абрамцова; сбор и обработка материала — Л.А. Череващенко, Е.Е. Урвачева, А.Б. Овсиенко, А.Т. Терешин, В.А. Васин; написание текста — Л.А. Череващенко, В.А. Васин; редактирование — Г.В. Саградян, А.В. Абрамцова, Н.К. Ахкубекова. Все авторы внесли существенный вклад в исследование, прочли и одобрили финальную версию статьи.

Сведения об авторах

Саградян Гаянэ Валерьевна, к.фарм.н. [Gayane V. Sagradyan, PhD]; адрес: Россия, 357501, Пятигорск, просп. Кирова, 30 [address: 30 Kirova Prosp., 30, 357501 Pyatigorsk, Russia]; http://orcid.org/0000-0001-7970-1958; eLibrary SPIN: 9629-5773; е-mail: oimdff@gniik.ru

Абрамцова Анна Викторовна, к.м.н. [Anna V. Abramtsova, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0001-7435-6286; eLibrary SPIN: 9608-8004; е-mail: abramtsovaav@ngs.ru

Череващенко Любовь Анатольевна, д.м.н., профессор [Lyubov A. Cherevashchenko, MD, PhD, Professor]; http://orcid.org/0000-0001-9246-5582; eLibrary SPIN: 5520-9799; е-mail: elenasoboleva2005@yandex.ru

Ахкубекова Нелли Катмурзаевна, д.м.н. [Nelli K. Ahkubekova, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0001-7881-7916; eLibrary SPIN: 3008-8175; е-mail: mail@pk.gniik.ru

Урвачева Екатерина Евгеньевна, д.м.н. [Ekaterina E. Urvacheva, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0002-9672-4016; е-mail: mail@ek.gniik.ru

Овсиенко Анна Борисовна, д.м.н. [Anna B. Ovsienko, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0002-1451-0795; eLibrary SPIN: 5144-1073; е-mail: ovsienko.anna@list.ru

Терешин Анатолий Тимофеевич, д.м.н., профессор [Anatolii T. Tereshin, MD, PhD, Professor]; http://orcid.org/0000-0002-3034-9479; eLibrary SPIN: 5939-1461; е-mail: atereshin2018@list.ru

Васин Валентин Алексеевич, д.м.н., профессор [Valentin A. Vasin, MD, PhD, Professor]; http://orcid.org/0000-0001-9277-1248; eLibrary SPIN: 3463-3389; е-mail: orgotdel@gniik.ru