Саградян Г.В.

ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства», Пятигорск, Россия

Абрамцова А.В.

ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства», Пятигорск, Россия

Череващенко Л.А.

Центральная районная больница Белокалитвинского района, Белая Калитва; Пятигорский НИИ курортологии Федерального медико-биологического агентства

Ахкубекова Н.К.

Пятигорский государственный НИИ курортологии

Урвачева Е.Е.

ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства», Пятигорск, Россия

Овсиенко А.Б.

ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства», Пятигорск, Россия

Терешин А.Т.

Пятигорский государственный НИИ курортологии

Васин В.А.

ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства», Пятигорск, Россия

Оценка эффективности применения желтой глины, модифицированной бишофитом (экспериментальное исследование)

Журнал: Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2018;95(5): 40-48

Просмотров : 50

Загрузок : 2

Как цитировать

Саградян Г. В., Абрамцова А. В., Череващенко Л. А., Ахкубекова Н. К., Урвачева Е. Е., Овсиенко А. Б., Терешин А. Т., Васин В. А. Оценка эффективности применения желтой глины, модифицированной бишофитом (экспериментальное исследование). Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2018;95(5):40-48. https://doi.org/10.17116/kurort20189505140

Авторы:

Саградян Г.В.

ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства», Пятигорск, Россия

Все авторы (8)

Обоснование

Разработка новых, более эффективных технологий восстановительной медицины приобретает особую значимость применительно к проблеме реабилитации пациентов с заболеваниями опорно-двигательного аппарата [1—3]. Снижение запасов традиционно используемых на курорте природных факторов для проведения бальнеопроцедур и пелоидотерапии требует рационального их использования и поиска новых месторождений, в том числе в перспективе, наряду с пелоидами могут применяться глины [4, 5]. Однако весь спектр действия пелоидов нельзя экстраполировать на глины, так как процесс их образования существенно отличается от лечебных грязей [6, 7]. Поэтому актуальной задачей курортологии является разработка и изучение влияния препаратов из желтой глины, обогащенной природным минералом бишофит, в целях улучшения ее терапевтического эффекта [8].

Цель исследования — изучить непосредственные эффекты применения препаратов из желтой глины Пятигорского карьера с добавлением бишофита при адъювантном артрите (АА).

Методы

Дизайн исследования

Проведено интервенционное (экспериментальное), одноцентровое, контролируемое рандомизированное, неослепленное исследование с участием лабораторных животных в соответствии с представленной схемой (рис. 1).

Рис. 1. Дизайн исследования эффектов лечебного применения препаратов из желтой глины с добавлением бишофита при АА. Fig. 1. Design of the study on the effects of the medicinal application of bischofite-containing yellow clay preparations for the treatment of adjuvant arthritis. IL — интерлейкин. IL — interleukin.

Критерии соответствия

Исследование выполнено на крысах-самцах (n=57) линии Вистар, половозрелых, массой 180—200 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария ФГБУ ПГНИИК ФМБА России, регламентируемых СП 2.2.1.3218—14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)»; ГОСТ 33215–2014 Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Животные находились по 4—5 особей в клетках, подстилкой являлись опилки нехвойных пород. Клетки подвергали ежедневной влажной уборке. Корм гранулированный выдавался ежедневно утром, доступ к питьевой воде был свободным. Животных ежедневно осматривали, заболеваний и падежа за время эксперимента не было. Работу проводили по принципам гуманного обращения с животными в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в эксперименте и других научных целях (ETS № 123, Strasbourg, 1986) с изменениями от 22 июня 1998 г.

Условия проведения

Исследование было проведено на базе отдела изучения механизмов действия физических факторов и отдела изучения курортных ресурсов ФГБУ ПГНИИК ФМБА России.

Продолжительность исследования

По плану завершение эксперимента осуществляли на 69—70-й день, через 1—2 дня после окончания курса аппликаций.

Описание медицинского вмешательства

В качестве экспериментального воспроизведения воспалительно-дегенеративных заболеваний суставов животным моделировали АА однократным введением полного адъюванта Фрейда субплантарно в задние лапы по 0,1 мл.

В работе изучали лечебное действие желтой глины Пятигорского карьера, модифицированной бишофитом Волгоградского месторождения. В условиях лаборатории изучения курортных ресурсов ФГБУ ПГНИИК ФМБА России приготовляли образцы препаратов из желтой глины однократно на весь период проведения лечебного курса. Основными этапами в технологии подготовки глины для проведения процедур были ее механическое очищение от крупных примесей, затем разведение путем добавления воды или бишофита в двух концентрациях — 10 и 20%.

Животных декапитировали под эфирным наркозом. Проводили забор крови для получения сыворотки, исследования клинических показателей крови животных (морфологическое определение общего количества лейкоцитов и их состава) и иммунофенотипирования лимфоцитов в периферической крови. Извлекали тимус и селезенку для определения их клеточности.

Основной исход исследования

Учитывая, что при АА развитие хронического воспаления сопровождается системными реакциями со стороны иммунокомпетентных органов, в оценке непосредственных эффектов применения препаратов из желтой глины Пятигорского карьера с добавлением бишофита изучали их влияние на основной популяционный и субпопуляционный составы лимфоцитов в периферической крови и общее количество лимфоцитов в тимусе.

Дополнительные исходы исследования

В регуляции активности воспалительного процесса участвуют IL и гормоны, преимущественно глюкокортикоиды, в связи с этим в сыворотке крови животных определяли уровень кортизола, IL-1β и IL-6 методом иммуноферментного анализа.

Анализ в подгруппах

Согласно условиям эксперимента, животные методом простой рандомизации были распределены на 5 групп. В 1-ю (контрольную) группу были включены здоровые животные без воздействия (n=5). В 4 опытные группы вошли животные с воспроизведением модели А.А. Во 2-й опытной группе (n=8) моделировали АА, лечебных воздействий не проводили. В 3—5-й опытных группах при достижении хронической стадии АА на 38-й день животным проводили лечебный курс из желтой глины и препаратов, приготовленных из нее и бишофита. Воздействия осуществляли наружно в виде аппликаций на задние лапы животных. Курс составлял 12 процедур через 1—2 дня, препараты из глины нагревали на водяной бане до 42ºС, экспозиция аппликаций составляла 15 мин. В соответствии со схемой эксперимента 3-я опытная группа (n=14) с 38-го дня АА получала лечебный курс аппликаций желтой глины без добавок, 4-я опытная группа (n=15) — аппликации желтой глины с 10% бишофитом, 5-я опытная группа (n=15) — аппликации желтой глины с 20% бишофитом.

Методы регистрации исходов

Регистрацию исходов проводили методом проточной цитофлуориметрии на двухлазерном проточном цитометре Cytomics FC-500 («Beckman Coulter», США), для определения субпопуляционного состава лимфоцитов использовали следующие реактивы: Anti-Rat CD3 FITC, Anti-Rat CD4 PE, Anti-Rat CD8α PE, Anti-Rat CD45R-PE, Anti-Rat CD5 FITC, I-Ek МНС II-PE («eBioscience», США).

Определение содержания кортизола, IL-1β и IL-6 в крови животных проводили на иммуноферментном автоматизированном анализаторе (Chem Well, Software Version 6.3, США) с использованием набора реагентов для количественного определения кортизола (ООО «Компания Алкор Био», Россия) и наборы для количественного определения крысиного IL-1β и IL-6 («eBioscience», США).

Подсчет общего содержания лейкоцитов в периферической крови и тимусе проводили по общепринятой унифицированной методике в камере Горяева, результаты исследования вносили в протоколы и формировали электронную базу для дальнейшего статистического анализа.

Этическая экспертиза

Протокол исследования одобрен на заседании комиссии по биоэтике ФГБУ ПГНИИК ФМБА России (протокол № 1 от 25.02.16).

Статистический анализ

Для оценки результатов исследования использовали пакет программ Statistica 6.0 (США). Полученные данные оценивали с применением критерия Ньюмана—Кейсла для множественных межгрупповых сравнений и многофакторного дисперсионного анализа. Показатели представлены в виде медианы (Ме) и 25-го и 75-го процентилей (25—75‰). Различия считали достоверными при минимальном уровне значимости p<0,05.

Результаты

Объекты (участники) исследования

В качестве объектов исследования использовали крыс-самцов линии Вистар, половозрелых, массой тела 180—200 г, а также препарат из желтой глины Пятигорского карьера, модифицированной бишофитом Волгоградского месторождения.

Основные результаты исследования

Лечебные эффекты модифицированной бишофитом желтой глины изучали на модели А.А. Содержание лейкоцитов в периферической крови в опытных группах не отличалось от контрольных животных: в 1-й группе — 9,8 (5,8—12‰)·109/л, во 2-й — 6 (5—9,5‰)·109/л, в 3-й — 7,8 (6—8,4‰)·109/л, в 4-й — 10 (8—11‰)·109/л, в 5-й — 8,8 (7—10‰)·109/л. Во всех группах определяли лимфоцитарный профиль лейкоцитов. Поэтому дальнейший анализ иммунологической реактивности проводили по оценке пролиферации иммунокомпетентных органов и субпопуляционному составу лимфоцитов в периферической крови наряду с профилем провоспалительных цитокинов.

К завершению эксперимента возраст животных составил 6 мес, в этот период отмечают проявления акцидентальной инволюции тимуса [9]. Показатели масс тимуса и селезенки, а также их клеточность (общее количество лейкоцитов в тимусе) к концу эксперимента у животных с моделью АА не отличались от таковых у контрольных животных (табл. 1).

Таблица 1. Показатели массы и клеточности иммунокомпетентных органов у крыс линии Вистар (Me (25—75‰)) Table 1. Mass and cellularity indices of the immunocompetent organs of Wistar rats (Me (25—75‰)) Примечание.* — достоверные различия между контрольной и опытными группами с лечебным курсом аппликаций бальнеофакторов (р<0,05); # — достоверные различия между группой с АА без бальнеотерапии и опытными группами с лечебным курсом аппликаций бальнеофакторов (р<0,05). Note. * — significant differences between the control and study groups of the animals treated by applications of the balneofactors (р<0.05); # — significant differences between the group of the animals with adjuvant arthritis in the absence of balneotherapy and the study groups of the animals treated by the application of balneofactors (р<0.05).
Под влиянием курса аппликаций наблюдалась тенденция к снижению масс тимуса по сравнению с показателями животных с АА без лечебного воздействия. Наиболее значимыми оказались различия по клеточности тимуса, увеличение которой произошло в группах, получающих процедуры с использованием как нативной желтой глины, так и модифицированной 10 и 20% бишофитом в 1,8—2 раза.

Дальнейшую оценку эффекторного звена клеточного иммунитета проводили по содержанию основных субпопуляций лимфоцитов в периферической крови (табл. 2).

Таблица 2. Показатели субпопуляционного состава лимфоцитов (в %) в периферической крови у крыс линии Вистар (Me (25—75‰)) Table 2. Characteristics of the sub-population composition of lymphocytes in the peripheral blood of Wistar (Me (25—75‰)) Примечание.* — достоверные различия между контрольной и опытными группами (р<0,05); # — достоверные различия между группой с АА без лечения и опытными группами с использованием бальнеотерапии (р<0,05). Note. * — significant differences between the control and study groups (р<0.05); # — significant difference between the group of the animals with adjuvant arthritis in the absence of balneotherapy and the study groups of the animals treated by the application of balneofactors (р<0.05).
У животных с моделью АА по сравнению с интактной группой повышалось содержание В-клеток (р<0,05) и отмечалась тенденция к снижению T-клеток (р≤0,05). Изменения в Т-клеточном звене связаны с понижением T-хелперов (р<0,01) при относительно неизмененном составе цитотоксических T-лимфоцитов и значительном увеличении активированных T-клеток в 2—2,5 раза, а также уменьшением иммунорегуляторного индекса (ИРИ) (соотношение T-хелперов и цитотоксических T-лимфоцитов (р<0,05)). В группах животных, получавших бальнеопроцедуры, количество В-клеток уменьшалось и изменялся субпопуляционный состав в Т-клеточном звене по сравнению с животными с моделью АА без лечения. Однако количество T-хелперов оставалось сниженным во всех группах по сравнению с данным показателем интактной группы и не отличалось от животных с моделью АА, не получавших бальнеотерапию. Вследствие снижения цитотоксических T-лимфоцитов в группах с бальнеовоздействием восстанавливался ИРИ. Под действием бальнеопроцедур снизилось и достигло значений у интактных животных содержание активированных T-клеток в периферической крови.

Дополнительные результаты исследования

Кроме того, при анализе влияния бальнеофакторов на течение АА оценивали уровень провоспалительных цитокинов (IL-1β и IL-6), которые отражают направленность системного и локального течения воспаления [10].

Содержание IL в контрольной и опытных группах достоверно не различалось. Отмечена высокая дисперсия IL у животных в опытных группах, что свидетельствует о влиянии других факторов на их содержание в периферической крови. Одним из них может являться уровень кортизола в крови, спектр действия этого гормона реализуется в регуляции функциональной активности лейкоцитов, в том числе провоспалительного профиля цитокинов. Так, уровень кортизола в группе животных с АА (184 (169—197‰) нмоль/л) снижался по сравнению с его содержанием у животных контрольной группы (205 (183—229‰) нмоль/л; р<0,1). Животные опытных групп с АА, получавшие бальнеопроцедуры, по уровню кортизола не различались между собой: в 3-й группе 180 (165—364‰) нмоль/л, в 4-й 285 (259—346‰) нмоль/л, в 5-й 221 (177—298‰) нмоль/л. Однако у части животных в опытных группах наблюдалось увеличение уровня кортизола на 50—150% по сравнению с животными с АА, не получавшими наружные лечебные курсы в виде аппликаций препаратов из желтой глины (бальнеопроцедуры). Учитывая системное действие кортизола, в каждой опытной группе были выделены две подгруппы, критерием разделения являлся уровень гормона (ниже или выше 200 нмоль/л). Так, в 1-й подгруппе содержание кортизола не превышало 200 нмоль/л, а во 2-й подгруппе было выше данного значения. Таким образом, для оценки влияния бальнеофакторов на уровень цитокинов в группах введен фактор содержания кортизола в крови животных (рис. 2).

Рис. 2. Аппроксимация различий между группами по содержанию в крови животных IL-1β в зависимости от уровня кортизола и используемых бальнеофакторов (F=4,9; р=0,016). Fig. 2. Approximation of the differences between the study groups in terms of blood IL-1β content in the experimental animals depending on the cortisol level and the applied balneofactors (F=4.9; р=0.016). ЖГ — желтая глина; Б — бишофит. YC — yellow clay; B — bischofite.
Оказалось, что содержание IL-1β снижено у животных при меньшем уровне кортизола под влиянием бальнеофактора (желтая глина с концентрацией бишофита 20%), а у животных с высоким уровнем кортизола, напротив, IL-1β оказался выше (F=4,9; р=0,01). Уровень IL-6 не зависел от содержания кортизола в крови, его динамика подвержена влиянию бальнеофакторов (F=5,2; р=0,01) (рис. 3).
Рис. 3. Аппроксимация различий между группами по содержанию в крови животных IL-6 в зависимости от используемых бальнеофакторов (F=5,2; р=0,01). Fig. 3. Approximation of the differences between the study groups in terms of blood IL-6 level in the experimental animals depending on the applied balneofactors (F=5.2; р=0.01). ЖГ — желтая глина; Б — бишофит. YC — yellow clay; B — bischofite.

Кроме того, у животных с моделью АА установлена положительная связь между клеточностью тимуса и IL-1β (r=0,6; p=0,08), а также прослеживается функциональная взаимосвязь между уровнем кортизола и клеточностью тимуса в виде обратной корреляционной связи (r= –0,8; p<0,03). По-видимому, бальнеопроцедуры при хроническом системном воспалении изменяют межсистемные гормонально-иммунные взаимодействия, изменяя при этом и пролиферативную функцию тимуса.

После бальнеопроцедур установлены прямые связи между уровнем IL и ИРИ. Так, после использования нативной желтой глины установлена связь между IL-1β и ИРИ (r=0,8; p=0,03), после желтой глины с 10% бишофитом — между IL-6 и ИРИ (r=0,8; p=0,03) и после желтой глины с 20% бишофитом — между IL-6 и ИРИ (r=0,8; p=0,004). Данные взаимосвязи подтверждают преобладающее влияние IL-6 в регуляции снижения напряжения в клеточном звене иммунного ответа под влиянием модифицированной 20% бишофитом желтой глины.

Нежелательные явления

При проведении экспериментального исследования никаких нежелательных явлений не наблюдалось.

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

Таким образом, в результате исследования курсового наружного применения аппликаций желтой глины при АА установлено увеличение клеточности тимуса, сниженной вследствие его возрастной инволюции, у животных контрольной группы и опытной группы с моделью АА без лечения. Развитие А.А. сопровождалось нарушением в соотношении популяционного состава лимфоцитов с увеличением В-клеток, снижением T-клеток, ИРИ за счет уменьшения T-хелперов в периферической крови и повышением активированных T-клеток. Под воздействием лечебных процедур изменения лимфоцитов в периферической крови направлены на восстановление их состава, что, по-видимому, связано с системной иммунной реакцией, учитывая увеличение пролиферативной активности тимуса.

Обсуждение основного результата исследования

В работе изучали лечебное действие наружного применения препаратов из желтой глины, обогащенной бишофитом, на экспериментальной модели АА в стадии хронического воспаления, курс 12 процедур (с 38-го до 69—70-го дня АА). Содержание лейкоцитов в крови животных подтверждает хроническую стадию воспалительного процесса. Так, их количество в опытных группах не превышает значений в контрольной группе. Установлено, что к моменту завершения эксперимента у животных контроля и опытной группы с АА без лечения определяется снижение клеточности тимуса, характерное для акцидентальной инволюции тимуса (см. табл. 1). В то же время животные 3—5-й группы, получавшие лечебные курсы препаратов из желтой глины, характеризуются однонаправленным влиянием на тимус исследуемых факторов в виде увеличения их клеточности. Это свидетельствует о стимуляции механизмов пролиферации во время акцидентальной инволюции, что не противоречит данным других исследований. Так, использование иммуномодуляторов, а именно полиоксидония, приводило к увеличению лимфоидных клеток в тимусе и изменяло их соотношение с тимикоэпителиальным окружением у крыс 6—7-месячного возраста [11].

Однако в периферической крови не происходило полного восстановления клеточного звена иммунного ответа, а наблюдалось снижение содержания Т-лимфоцитов преимущественно за счет T-хелперов (см. табл. 2). Существенный положительный эффект лечебного действия наружного применения препаратов из желтой глины связан с восстановлением активированных T-клеток в периферической крови, свидетельствующим о снижении иммунологической компоненты в реализации воспаления при АА.

В нашем исследовании воздействие бальнеофакторов осуществляли наружно, очевидным является неспецифическое их действие, по-видимому, опосредованное через системные механизмы, активирующие адаптационные реакции. Известны механизмы влияния бальнеопроцедур на кору надпочечников. Умеренная их стимуляция приводит к реализации эффектов глюкокортикоидов, в том числе и на тимикоэпителиальное окружение, а именно созревание и дифференцировку лимфоцитов в тимусе [12].

Оценка основных провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6) с учетом влияния кортизола позволила не только систематизировать результаты по подгруппам в зависимости от уровня кортизола и связанного с ним содержания IL-1β, но и выявить особенности реагирования на лечебные курсы с использованием желтой глины в зависимости от концентрации бишофита (см. табл. 3).

Таблица 3. Показатели IL (в пг/мл) в сыворотке крови у крыс линии Вистар (Me (25—75‰)) Table 3. Serum IL levels in the Wistar rats (Me (25—75‰))
Эти данные могут стать обоснованием для исследования системных механизмов лечебного действия препаратов наружного применения, приготовленных на основе природных материалов и предназначенных для снижения локальных воспалительных процессов.

Заключение

Определяются общие признаки восстановления пролиферативной активности тимуса и относительного содержания как популяций, так и субпопуляций лимфоцитов периферической крови. Выявленные противовоспалительный и иммуномодулирующий эффекты препаратов из желтой глины с добавлением бишофита свидетельствуют о реализации механизмов саногенеза на модели АА.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа проведена при поддержке ФГБУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства».

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: концепция и дизайн исследования — Г.В. Саградян, А.В. Абрамцова; сбор и обработка материала — Л.А. Череващенко, Е.Е. Урвачева, А.Б. Овсиенко, А.Т. Терешин, В.А. Васин; написание текста — Л.А. Череващенко, В.А. Васин; редактирование — Г.В. Саградян, А.В. Абрамцова, Н.К. Ахкубекова. Все авторы внесли существенный вклад в исследование, прочли и одобрили финальную версию статьи.

Сведения об авторах

Саградян Гаянэ Валерьевна, к.фарм.н. [Gayane V. Sagradyan, PhD]; адрес: Россия, 357501, Пятигорск, просп. Кирова, 30 [address: 30 Kirova Prosp., 30, 357501 Pyatigorsk, Russia]; http://orcid.org/0000-0001-7970-1958; eLibrary SPIN: 9629-5773; е-mail: oimdff@gniik.ru

Абрамцова Анна Викторовна, к.м.н. [Anna V. Abramtsova, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0001-7435-6286; eLibrary SPIN: 9608-8004; е-mail: abramtsovaav@ngs.ru

Череващенко Любовь Анатольевна, д.м.н., профессор [Lyubov A. Cherevashchenko, MD, PhD, Professor]; http://orcid.org/0000-0001-9246-5582; eLibrary SPIN: 5520-9799; е-mail: elenasoboleva2005@yandex.ru

Ахкубекова Нелли Катмурзаевна, д.м.н. [Nelli K. Ahkubekova, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0001-7881-7916; eLibrary SPIN: 3008-8175; е-mail: mail@pk.gniik.ru

Урвачева Екатерина Евгеньевна, д.м.н. [Ekaterina E. Urvacheva, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0002-9672-4016; е-mail: mail@ek.gniik.ru

Овсиенко Анна Борисовна, д.м.н. [Anna B. Ovsienko, MD, PhD]; http://orcid.org/0000-0002-1451-0795; eLibrary SPIN: 5144-1073; е-mail: ovsienko.anna@list.ru

Терешин Анатолий Тимофеевич, д.м.н., профессор [Anatolii T. Tereshin, MD, PhD, Professor]; http://orcid.org/0000-0002-3034-9479; eLibrary SPIN: 5939-1461; е-mail: atereshin2018@list.ru

Васин Валентин Алексеевич, д.м.н., профессор [Valentin A. Vasin, MD, PhD, Professor]; http://orcid.org/0000-0001-9277-1248; eLibrary SPIN: 3463-3389; е-mail: orgotdel@gniik.ru

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail