Бактерии, представленные в составе нормальной микрофлоры, играют важную роль в возникновении патологических процессов различной локализации [1]. Сохранение и распространение среди этих бактерий генов антибиотикоустойчивости потребовало детального изучения и идентификации состава нормальной микрофлоры человека (микробиоты).

Известно, что представители микрофлоры ротовой полости являются возбудителями заболеваний ЛОР-органов [2]. Плохое состояние полости рта, болезни зубов и десен увеличивают риск возникновения поражений различных органов. Пародонтит служит причиной возникновения фарингита, тонзиллита, паратонзиллярных абсцессов и ринита [3, 4].

Бактерии, обитающие в организме человека, несмотря на очевидную значимость для медицины, остаются недостаточно изученными. Считается, что идентифицировано от 5 до 30% микроорганизмов нормальной микрофлоры. Трудности в изучении микробиоты связаны с отсутствием методов культивирования большинства бактерий. Согласно нашим данным, это связано с организацией жизни бактерий в составе устойчивых сообществ - биопленок, которая подразумевает гораздо бо`льшую взаимозависимость микроорганизмов и создает им условия, пока не воспроизводимые в лаборатории [5-8]. Изучение генов микробиоты показало, что неизученными и практически не известными являются различные бактерии, археи, грибы и вирусы, получившие обозначение «пока не культивируемые».

Цель настоящей работы - выделение и идентификация в нормальной микрофлоре ротовой полости малоизученных или не известных ранее аэробных условно-патогенных бактерий, которые могут вызвать поражение различных ЛОР-органов.

Материал для исследования: слюна людей в возрасте от 19 до 60 лет. Слюну собирали в стерильные пробирки и в течение 1 ч после забора материала делали высевы.

Культивирование. Для выделения бактерий использовали жидкие и агаризованные питательные среды: бруцелла агар, эндо, кровяной агар, агаризованная среда LВ (bioMerie). Колонии анализировали по характеру роста, морфологии и изменениям свойств среды. Для изучения бактерий использованы методы окраски по Граму и световой микроскопии: микроскоп Olympus BX51TF (Japan); Digital Microscope Camera ProgRes CF. Программа для компьютера - ProgRes MACCaptureProVersion 2.7.6 Jenoptic (Germany), Camera adapter (Projectionlens) U-TV0.63X-C, SensorCCD, Color 2/3". Чистые культуры идентифицировали по биохимической активности с помощью автоматической системы Vitec-2 (BioMerie). Чувствительность к антибиотикам определяли с использованием панели Vitec-2 (BioMerie).

Метод выделения ДНК и сиквенс

Выделение ДНК проводили фенол-хлороформным методом [9]. Нуклеотидную последовательность генов определяли с использованием набора для термоциклического секвенирования BigDyeTMTerminatorv.3.1 Cycle Sequencing («Applied Biosystem», США) согласно рекомендациям производителя. Продукты реакции анализировали с использованием автоматического секвенатора ABIPrismGeneticAnalyzer 3730XL («Applied Biosystem», США, «Hitachi», Япония). Конверсию исходных хроматографических данных в формат *txt и *AB осуществляли с использованием программного пакета Sequencing Analysis 5.3.1 («Applied Biosystems», США). Анализ данных осуществляли с использованием программного пакета Sequence Scaner («Applied Biosystems», США).

Дерево строили с использованием программы ARB [10].

Высевы исследуемого материала использованным методом позволили получить смешанные биопленки, напоминающие обычные колонии, образованные бактериями одного вида (рис. 1 на цв. вклейке).

По организации выявленные биопленки идентичны смешанным микробным сообществам, полученным нами ранее экспериментально [11, 12].

В результате рассевов на разные среды часть смешанных биопленок удалось разделить и получить из них чистые культуры бактерий, пригодные для идентификации. В то же время большинство смешанных биопленок разделить в использованных условиях не удалось. Они оказались устойчивыми сообществами, которые выдерживали многократные (больше 10) пересевы на аналогичные среды. Образование на питательных средах большого числа разнообразных смешанных биопленок свидетельствует о существовании в микробиоте тесного взаимодействия между различными неродственными бактериями. Устойчивое воспроизведение смешанных бактериальных биопленок и невозможность получения на использованных средах чистых культур указывает на выраженный мутуализм бактерий нормальной микрофлоры. В этом типе взаимодействия каждая из бактерий дает другой какие-то факторы, которые сам получатель синтезировать не может. Очевидно, что эти факторы отсутствуют и в использованных нами питательных средах.

Часть бактерий, изолированных из смешанных биопленок в виде чистых культур и идентифицированных по биохимическим тестам, с достоверностью 98-99% принадлежат к известным родам и видам, представители которых являются возбудителями заболеваний человека различной локализации. Вместе с тем они не описаны или малоизвестны как представители нормальной микрофлоры ротовой полости человека.

Среди грамположительных бактерий обнаружен Aerococcus viridans, микроорганизм, относящийся к возбудителям оппортунистических инфекций. Известны некоторые заболевания, которые может вызвать A. viridans: менингит, инфекции мочевыделительной системы и эндокардит у детей и взрослых, септический артрит и бактериемия. Данный микроорганизм способен распространяться в госпиталях и считается возбудителем внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций [13]. Другими грамположительными бактериями оказались различные стафилококки: недавно обнаруженные в ротовой полости Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdunensis и Staphylococcus warneri, [14], а также Staphylococcus pasteuri и S. hominis spp. novobiosepticus, которые ранее в слюне практически не выявлялись. Все эти кокки относятся к возбудителям оппортунистических и нозокомиальных инфекций [15]. Среди стафилококков, выделенных в смешанных биопленках из ротовой полости, S. hominis subsp. novobiosepticus характеризуется выраженной устойчивостью к новобиоцину, налидиксовой кислоте, пенициллину, оксациллину, канамицину и стрептомицину. Известно, что у этого вида также часто встречаются штаммы, устойчивые к эритромицину, клиндамицину, хлорамфениколу, сульфаниламидам и ципрофлоксацину [16]. Устойчивость к азалидам (азитромицин), макролидам (эритромицин) и клиндамицину показал S. hominis. Другой стафилококк, ранее не описанный в микрофлоре ротовой полости - Staphylococcus pasteuri показал устойчивость к эритромицину.

Из слюны были также изолированы чистые культуры грамотрицательных аэробных бактерий. Так, была идентифицирована Pseudomonas putida, известная как представитель микрофлоры воды, почвы и некоторых животных [17]. Описаны случаи заболеваний людей, вызванные P. putida, однако в составе нормальной микрофлоры человека эта бактерия ранее не описана. Другая выявленная псевдомонада - Pseudomonas oryzihabitans - обитает в сточных водах и недавно была обнаружена на поверхности языка [18]. Грамотрицательная бактерия Klebsiella oxytoca, известная как условно-патогенный микроорганизм, не является типичным представителем нормальной микрофлоры ротовой полости человека и описана как возбудитель оппортунистических инфекций [15]. Выявленные псевдомонады показали устойчивость к нитрофуранам (нитрофурантоин) и цефалоспоринам (цефазолин), пенициллинам (ампициллин и амоксициллин/клавулонат), фосфомицину, триметоприм/сульфаметоксазолу, хлорамфениколу и клиндамицину.

Из ротовой полости были также выделены микробы, которые по морфологии похожи на известные бактерии, но по биохимической активности не могли быть достоверно отнесены к представителям идентифицированных родов и видов (сходство не превышало 85%). Бактерии, имеющие сходство с Micrococcus luteus, отличались от известного вида характером роста, размером и формой клеток, пигментом и другими признаками. Часть бактерий по биохимической активности не могла быть идентифицирована автоматической системой Vitec-2 с последней версией базы данных и отнесена к категории «Unidentified organism».

Отсутствие полного сходства биологических свойств бактерий, идентифицированных автоматической системой Vitec-2 как Micrococcus luteus, а также присутствие в ротовой полости некоторых бактерий, и прежде всего Pseudomonas oryzihabitans, вызывало сомнение в точности их идентификации. В связи с этим был проведен анализ последовательности нуклеотидов гена, кодирующего 16S рибосомальной ДНК этих бактерий. Полученные сиквенсы ДНК бактерий были сравнены с данными, суммированными в базах (BLAST и HOND). Установлено, что бактерии, первоначально идентифицированные как Micrococcus luteus, по составу нуклеотидов гена 16 S рибосомальной РНК больше похожи на бактерии вида Rothia mucilaginosa (рис. 3, а).

Таким образом, генетический анализ свидетельствует, что некоторые выделенные бактерии (Micrococcus luteus и Pseudomonas oryzihabitans) скорее всего представляют собой новые, ранее не известные виды микроорганизмов.

Полученные данные указывают на очень важный факт присутствия в нормальной микрофлоре пока неизвестных и неизученных условно-патогенных микроорганизмов, выделение и правильная идентификация которых в лабораторных условиях пока невозможна.

Носительство условно-патогенных бактерий в ротовой полости считается важным фактором в появлении различных соматических заболеваний [1]. Практически все выделенные и идентифицированные бактерии способны вызывать гнойно-воспалительные процессы и являются потенциальными возбудителями различных поражений ЛОР-органов. С наличием таких бактерий, не дающих рост в стандартных лабораторных тестах, может быть связана часть случаев неэффективной лабораторной диагностики заболеваний. Обращает на себя внимание устойчивость выделенных штаммов к различным антибиотикам, что повышает потенциальную опасность этих микроорганизмов.

Таким образом, в ходе исследования выделены смешанные микробные биопленки, из которых изолированы бактерии, не известные ранее как представители микробиоты ротовой полости и способные вызывать заболевания, актуальные для оториноларингологии.