Проблемы этиологии и патогенеза гипертрофии миндалин лимфоидного глоточного кольца (ЛГК) остаются актуальными для современной оториноларингологии [1]. С позиции нарушения функционирования мукозальной иммунной системы слизистой оболочки носа и глотки, необходимо остановиться на главных молекулах, регулирующих иммунный ответ на различные ксенобиотики. Такими молекулами являются цитокины, которые относятся к медиаторам межклеточных взаимодействий и тем самым определяют характер иммунного ответа на ксенобиотики, а естественный полиморфизм в их генах детерминирует конституциональные особенности биологической активности и экспрессии этих молекул [2, 3]. Эти свойства могут формировать различные иммунопатологические конституции, такие как атопический марш, лимфопролиферативный синдром и рецидивирующие респираторные инфекции [4, 5]. Под атопическим маршем подразумевается этапность развития аллергической сенсибилизации и трансформация клинических проявлений аллергии в зависимости от возраста детей. Ведущим клиническим проявлением лимфопролиферативного синдрома является гипертрофия миндалин ЛГК и региональная лимфоаденопатия. Рецидивирующие острые респираторные инфекции у детей могут быть следствием длительного аллергического воспаления, вызванного аллергенами условно-патогенной микробиоты глоточного биотопа [6—8].

Цель настоящего исследования — изучение особенностей полиморфизма в генах провоспалительных и проаллергических цитокинов при различной степени выраженности лимфопролиферативного синдрома, включающего гипертрофию миндалин ЛГК и атопическую сенсибилизацию к представителям условно-патогенной микробиоты (УПМ).

Обследованы 129 детей с гипертрофией миндалин ЛГК с частыми (более 5 раз в год) респираторными заболеваниями, а также с атопической сенсибилизацией хотя бы к одному представителю УПМ. Обследован также 101 условно здоровый ребенок. Возраст обследованных детей — от 2 до 6 лет.

Критериями включения в основную группу, наряду с наличием у ребенка гипертрофии миндалин ЛГК II—III степени и рецидивирующих респираторных инфекций с частотой более 5 раз в год, было отсутствие врожденной и хронической патологии (врожденные пороки сердечно-сосудистой, дыхательной, мочеполовой, костно-мышечной систем, множественные пороки и др.); наследственные ферментопатии (муковисцидоз, дефицит α1-антитрипсина и др.); наследственные иммунодефициты (клеточный, гуморальный и др.); хроническая патология легких (бронхоэктатическая болезнь и др.). В группу включались дети с атопической сенсибилизацией хотя бы к одному представителю УПМ глоточного биотопа, которая выявлялась методом иммуноферментного анализа (ИФА) к следующим микроорганизмам: Streptococcus (Str.) pyogenes, Str.pneumoniae, Str. mutans, Staphylococcus (S.) aureus, S. epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Branchamella catarrhalis, Haemophilus influenzae.

Дети основной группы были объединены в 3 подгруппы. В 1-ю подгруппу были включены 43 ребенка с аденоидными вегетациями II—III степени и с региональной лимфоаденопатией. Во 2-ю подгруппу вошли 45 детей с сочетанием гипертрофии глоточной и небных миндалин (II—III степени), а также с региональной и системной лимфоаденопатией. В 3-ю подгруппу объединили 41 ребенка с гипертрофией лимфоидного глоточного кольца, аналогичной II подгруппе, но с обязательным катамнестическим документированием тимомегалии II—III степени.

Представленное деление на подгруппы было необходимо для решения поставленных задач исследования.

В 1-й подгруппе имело место преимущественное поражение лимфоидной ткани глоточной миндалины (изолированные аденоидные вегетации), что могло быть вызвано конституционально обусловленными локальными нарушениями иммунитета. 2-ю подгруппу можно отнести к локальному лимфопролиферативному синдрому или лимфатизму с преимущественным поражением ЛГК, что также может быть отражением определенной конституционально обусловленной иммунопатологии. 3-я подгруппа — системный лимфопролиферативный синдром или системный лимфатизм, для которого тимомегалия является большим диагностическим критерием, она отражает участие тимуса в антенатальных иммунных ответах и, как следствие, патологию клеточного иммунитета. В целом можно утверждать, что у детей основной группы имеет место иммунная недостаточность, которая клинически манифестирует через инфекционный синдром (частая респираторная заболеваемость), через различную степень выраженности лимфопролиферативного синдрома, а также через аллергический синдром, проявляющийся атопической инфекционной сенсибилизацией.

Критерии включения в группу сравнения:

1. Отсутствие у ребенка гипертрофии миндалин глоточного лимфоидного кольца.

2. Наличие у ребенка рецидивирующей респираторной патологии реже 4 раз в год.

3. Отсутствие врожденной и хронической патологии.

4. Отсутствие атопической сенсибилизации к УПМ.

5. Возраст детей от 2 до 6 лет.

Более 95% обследуемых в сравниваемых группах были представлены европеоидами.

У всех обследованных детей забирали венозную кровь для проведения иммуноферментного анализа (ИФА). ДНК получали с помощью метода фенол-хлороформной экстракции, образцы ДНК растворяли в 10 ммоль Tris/1 EDTA, pH 8,0 и хранили при 4 °C.

Типирование генов антагониста рецептора интерлейкина 1 (IL1Ra), гена интерлейкина 4 (IL4), гена интерлейкина 1b (IL1b). Исследование полиморфизма интерлейкинов проводили из полученной ДНК с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с праймерами, фланкирующими искомый полиморфный регион. Для IL1Ra и IL4 — макросателлитный полиморфизм в пределах второго интрона. Для SNP IL1B (+3953, С->T) использовали дополнительно рестрикцию рестриктазой TaqI. Электрофорез продуктов амплификации различных аллелей исследуемых генов представлены на рис. 1—3.

Иммуноаллергологическое исследование проводили с помощью ИФА на наборах фирмы ООО «Иммунотех» (Ставрополь). Исследования проводили согласно прилагаемым инструкциям. Панель аллергенов для выявления атопической сенсибилизации составляла 88 показателей: 11 бытовых аллергенов, 33 пищевых аллергена, 22 пыльцевых аллергена, 11 грибковых аллергенов и 11 инфекционных аллергенов. Инфекционная панель включала Str. pyogenes, Str. pneumoniae, Str. mutans, S. aureus, S. epidermidis, E. coli, P. aeruginosa, Prot. vulgaris, Kl.pneumoniae, Br. catarrhalis, H. influenzae. Уровень сенсибилизации отражали по классам: 0 класс — антитела класса Е (АТЕ) ниже 10 нг/мл, I класс — АТЕ в пределах 11—25 нг/мл, II класс — АТЕ в пределах 26—50 нг/мл, III класс — АТЕ в пределах 51—100 нг/мл, IV класс — АТЕ свыше 100 нг/мл. Выявление у ребенка аллерген-специфических антител класса Е свыше 20 нг/мл считали атопической реакцией на аллерген. При выявлении поливалентной аллергии с очень высокой концентрацией аллерген-специфических антител класса Е проводили повторные исследования на глистную инвазию.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью стандартных генетико-статистических методов, используя пакет прикладных программ Statistica 6.0. В соответствии с равновесием Харди—Вайнберга провели сопоставление частот аллелей и генотипов генов цитокинов в исследуемых подгруппах и группе сравнения с помощью критерия Фишера для малых выборок и поправкой Йетса на непрерывность [9]. По аналогии с исследованиями «HLA и болезни» исследовали положительные и отрицательные ассоциации с отдельными аллелями, генотипами и их сочетаниями. Для каждого полученного достоверно значимого различия рассчитывали относительный фактор риска — ФР и его доверительный интервал (ДИ) при 95% уровне значимости. Считали ассоциацию положительной, если ФР был больше 2. Результаты считали достоверными при ошибке менее 5%, что соответствует медико-биологическим исследованиям [9].

По данным клинического обследования, у всех детей основной группы ведущим был респираторный синдром. Они относились к группе часто болеющих, частота ОРВИ составляла 5—11 раз в год. Кожные проявления пищевой аллергии на первом году жизни (эритема щек и ягодиц, сухость кожи в области икроножных мышц, шелушение заушной области) были выявлены у всех обследованных основной группы. Изучение уровня специфического иммуноглобулина Е в периферической крови выявило сенсибилизацию среднего уровня к бытовым аллергенам у 12 (9,3%) детей. Дети с высоким и очень высоким уровнем сенсибилизации к бытовым аллергенам не встречались. Основным бытовым аллергеном был клещ домашней пыли. Пищевая аллергия присутствовала у всех детей основной группы. Высокий уровень атопии хотя бы к одному аллергену встречался у каждого из 129 детей. Очень высокий уровень атопии хотя бы к одному аллергену был отмечен у 45 (34,9%) детей. Преимущественным был средний уровень сенсибилизации. У 110 (85,3%) детей была отмечена аллергия к антигенам пшеницы, у 61 (47,3%) ребенка — к антигенам картофеля, у 32 (24,9%) обследованных — к антигенам яичного белка и у 27 (21%) пациентов — к антигенам коровьего молока. У всех 129 детей значимых аллергенов было более трех. Сенсибилизация хотя бы к одному представителю УПМ была обнаружена у всех детей (100%). Уровень сенсибилизации в этой группе был средним. Значимыми в отношении формирования атопии были следующие бактерии: Str. pyogenes, Str. pneumoniae, Str. mutans — у 102 детей, P. aeruginosa — у 24 детей, H. influenzae — у 19 детей, E. сoli — у 14 детей. Единичная сенсибилизация была отмечена к грибковым аллергенам, преимущественно к группе Candida и к пыльцевым аллергенам, преимущественно к одуванчику. Сложная микстовая сенсибилизация к нескольким группам аллергенов (преимущественно к пищевым, инфекционным и бытовым) была обнаружена у 19 (14,7%) детей. Представленные данные указывают на формирование атопического марша у детей основной группы.

На первом этапе исследования провели сравнение частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма IL1b+3953 (3-й экзон) в трех основных подгруппах и в группе сравнения (табл. 1).

Рассматривая роль выявленных положительных ассоциаций с позиции детерминирования иммунной недостаточности, можно отметить следующее. Полиморфизм IL1b*+3953 находится в экзоне и тем самым замена одного нуклеотидного основания на другое приводит к изменению структуры молекулы IL1b, а значит и ее функции [2]. Показано, что в популяции доминирует С-аллель и генотип C/C полиморфизма IL1b*+3953, такое доминирование обозначается как мажорный генотип и аллель. Соответственно Т-аллель и генотип Т/Т являются минорными, кроме того, в ряде работ сообщается, что у пациентов, гомозиготных по Т-аллелю, имеет место снижение активности IL1b [10]. Тем самым вполне обоснованным является высокая частота встречаемости пациентов с Т-аллелем в генотипе в основной группе, где, как говорилось выше, манифестирует иммунная недостаточность.

Далее рассмотрели особенности распределения аллелей и генотипов полиморфизма рецепторного антагониста интерлейкина 1 (IL1RaN) в сравниваемых группах. Данный полиморфизм находится во втором интроне и связан с макросателлитными повторами (86 пар нуклеотидных оснований). Описано четыре возможных аллеля с двумя повторами (от англ. «repeat» — 2R), с тремя (3R), с четырьмя (5R) и с пятью (5R) [11]. Частоты данных аллелей в сравниваемых группах достоверно не отличались. Основные отличия были связаны с генотипами. Так, в группе детей с изолированными аденоидными вегетациями достоверно чаше встречался генотип IL1Ra*2R,2R (21,93% против 4,95% в группе сравнения, ФР=3,25; p=0,049). При сравнении особенностей генетического полиморфизма в группах детей с локальным и системным лимфатизмом ЛГК выявлены одинаковые достоверности. Так, в обеих подгруппах достоверно чаще, чем в группе сравнения, встречался генотип IL1Ra*2R,4R (57,78% в группе с локальным лимфатизмом ЛГК, 43,9% в группе с системным лимфатизмом против 27,72% в группе сравнения, ФР=2,51; p=0,025 и ФР=2,11; p=0,048 соответственно). Других достоверных различий не получено (табл. 2).

Механизм влияния интронных макросателлитов на экспрессию гена достаточно широко описан в литературе. Отправной точкой в этих рассуждениях является факт, что интрон с пятью тандемами длиннее интрона с двумя повторами, именно это и лежит в основе регуляции синтеза цитокина. Считается, что «длинный интрон» тормозит сплайсинг гена, а «короткий», наоборот, его активирует. Тем самым трансляция с гена на синтез белка будет замедляться при увеличении кратности пар нуклеоитидных оснований [12]. С этих позиций у лиц, имеющих короткие интроны 2R,2R, активность синтеза рецепторного антагониста IL1 является самой высокой. Если учесть факт, что данный цитокин является основным негативным регулятором IL1b, то вполне понятным является ограничение выработки IL1b у лиц с генотипом IL1Ra*2R,2R. Данный феномен описан в литературе [13]. Тем самым снижение активности IL1b при изолированных аденоидных вегетациях детерминируется сразу по двум генам семейства IL1. Это необходимо учитывать при назначении локальной иммуномодулирующей терапии. Для локального и системного лимфатизма показана положительная ассоциация с гетерозиготой IL1Ra*2R,4R, как и ранее — с гетерозиготой по гену IL1b*C/T. В обеих гетерозиготах присутствовали гены, понижающие выработку IL1b (напрямую аллель T — IL1b; и опосредовано через гиперсинтез IL1Ra — аллель 2R). В то же время гетерозиготные генотипы широко представлены в некоторых популяциях и даже обсуждается эволюционная целесообразность гетерозиготности в целом. С этих позиций локальный и системный лимфатизм навряд ли можно считать состоянием, детерминированным по генам семейства IL1. Вполне возможно, что основную роль в формировании локального и системного лимфатизма оказывает микробное микроокружение матери, плода, новорожденного ребенка. А минорные аллели, входящие в состав гетерозиготных генотипов, лишь усиливают неэффективность первичного иммунного распознавания антигенов условно-патогенных микроорганизмов глоточного биотопа.

При сравнении аллелей и генотипов интронного макросателлитного полиморфизма гена IL4 достоверных различий между сравниваемыми группами не обнаружили.

Как уже говорилось выше, в критерии отбора в основную группу входила атопическая сенсибилизация к представителям УПМ глоточного биотопа. Так, атопическая сенсибилизация к стрептококкам (Str. pyogenes, Str. pneumoniae, Str. mutans) с уровнем специфических антител класса Е в сыворотке крови свыше 25 нг/мл встречалась у 102 (79,1%) пациентов основной группы. Второй по частоте встречаемости была атопическая сенсибилизация к P. aeruginosa — 24 (18,6%) средней и более степени выраженности. Тем самым можно утверждать, что эти возбудители оказывали существенное влияние на формирование частой респираторной заболеваемости не только посредством своего персистирования, но и за счет развития на их антигены атопических реакций, поддерживающих аллергическое воспаление в носоглотке. С этих позиций провели оценку встречаемости аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов среди пациентов основных подгрупп, имеющих атопическую сенсибилизацию к вышеуказанным представителям УПМ. В качестве сравнения использовали детей контрольной группы и представителей основной группы, но без вышеперечисленных атопических сенсибилизаций.

При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов у детей с атопической сенсибилизацией к стрептококкам и синегнойной палочке с детьми без этой атопии были выявлены достоверные различия лишь в частоте встречаемости генотипов полиморфизма IL1b*+3953 (табл. 3).

Как уже говорилось, гетерозиготный генотип IL1b*C/T содержит минорный аллель Т, который оказывает влияние на функциональную активность молекулы IL1b. Этот цитокин является ведущим медиатором иммунного ответа и главной секреторной молекулой в семействе IL1 [2]. Известно, что в данном семействе имеется еще и IL1 альфа (IL1α), который участвует во внутриклеточных регуляциях и поэтому представлен в основном несекреторной формой. Тем самым именно IL1b обеспечивает второй сигнальный импульс после антигенного воздействия (первый сигнальный импульс) на развитие специфического иммунного ответа [4]. Соответственно у лиц, имеющих в генотипе один мажорный аллель (нормальная функция цитокина), а другой минорный аллель (сниженная функция цитокина), активация иммунного ответа против запредельных концентраций представителей УПМ может проходить по аллергическому типу. Первичное сверхпороговое инфицирование детей УПМ, и особенно таким ее представителем, как синегнойная палочка, приходится на интранатальный и ранний постнатальный период. В целом эти данные подтверждают, что формирование иммунной недостаточности и особенно лимфопролиферативного синдрома обусловлено не только генетическими факторами, но и сформированным микробным микроокружением.

Таким образом, полученные результаты показали, что развитие изолированных аденоидных вегетаций имеет положительные ассоциации с гомозиготными генотипами IL1b*T/T и IL1Ra*2R/2R. Оба эти генотипа способствуют ограничению функциональной активности основного медиатора инициации иммунного ответа IL1b. Поэтому патогенетически обусловленным может быть проведение консервативной терапии с применением топического рекомбинантного IL1. Формирование локального и системного лимфатизма связано не только с генетическим детерминированием по генам семейства IL1 (положительные ассоциации с гетерозиготными генотипами IL1b*C/T и IL1Ra*2R/4R), но и с инфекционными факторами, особенно у детей с атопическим маршем. Показано, что с высоким уровнем атопических реакций к антигенам стрептококков (Str. pyogenes, Str.pneumoniae, Str. mutans) и синегнойной палочке были ассоциированы именно эти генотипы (IL1b*C/T и IL1Ra*2R/4R). Соответственно, локальная иммунотерапия гипертрофии миндалин лимфоидного глоточного кольца при лимфатизме должна включать противовоспалительные препараты, в том числе топические стероиды, местные антибактериальные средства, а также мукозальную вакцинацию на фоне адъювантной терапии. В целом проведенное исследование показало, что различные варианты гипертрофии миндалин лимфоидного глоточного кольца имеют свои иммуногенетические особенности, а также могут быть следствием аллергического воспалительного процесса, поддерживаемого атопическими реакциями на антигены стрептококков и синегнойной палочки. Это надо учитывать при определении объема лечения патологии миндалин лимфоидного глоточного кольца.

Работа выполнена по гранту Фонда поддержки медико-биотехнологических исследований.