КН — каст-нефропатия
ЛЦ — легкие цепи
ММ — множественная миелома
ПН — почечная недостаточность
УМ — уромодулин
ХПН — хроническая почечная недостаточность
D8C — домен 8 цистеинов
Каст-нефропатия (КН) — наиболее частая причина почечной недостаточности (ПН) при множественной миеломе (ММ). В структуре поражений почек, обусловленных парапротеином, КН составляет 41— 65% [1—3].
Основным звеном патогенеза КН является образование белковых цилиндров в дистальном отделе почечных канальцев вследствие взаимодействия моноклональных легких цепей (ЛЦ) с уромодулином — УМ (белком Тамма—Хорсфалла). Установлено, что ЛЦ связываются с УМ посредством фрагмента СDR3 [4—6]. Обструкция просвета почечных канальцев белковыми цилиндрами приводит в последующем к тубулоинтерстициальному воспалению и острому повреждению почек.
Развитие КН сопряжено с высокой секрецией белка Бенс-Джонса, поэтому содержание моноклональных свободных ЛЦ в сыворотке более 1500 мг/л служит одним из диагностических критериев этого варианта поражения почек [7]. Вместе с тем хорошо известно, что не у всех больных ММ с секрецией ЛЦ развивается КН. В частности, в исследовании M. Drayson и соавт. [8] из 310 больных миеломой Бенс-Джонса только у 42% больных выявлена ПН. В настоящее время нет однозначного ответа на вопрос, почему не у всех больных ММ с секрецией моноклональных ЛЦ развивается КН.
Наибольшее распространение получила концепция о нефротоксичных свойствах ЛЦ у больных КН. В 1991 г. опубликована работа, в которой доказывалась возможность развития КН у подопытных животных при введении им ЛЦ, полученных от больных ММ с П.Н. При этом КН не формировалась, если белок Бенс-Джонса выделен от пациентов ММ без поражения почек [9]. Это исследование послужило толчком к изучению различий физико-химических свойств ЛЦ, которые могли бы объяснить их нефротоксичность [10—13]. Обнаружено множество структурных аномалий ЛЦ в виде изменения аминокислотной последовательности вариабельного региона, длины молекул, нарушения гликозилирования, повышения полимеризации и гидрофобности, что способствует их агрегации в тканях [12, 14—20]. Эти данные получили признание в качестве рабочей теории органных повреждений при AL-амилоидозе и болезни депозитов Л.Ц. Однако попытка выявить различия в строении вариабельного региона ЛЦ и отдельно фрагмента CDR3 у больных ММ с КН и без поражения почек оказалась неудачной. На основании полученных данных сделан вывод, что вероятность развития КН и тяжесть поражения почек невозможно прогнозировать на основании анализа нуклеотидной последовательности вариабельного региона ЛЦ иммуноглобулинов [21].
В то же время показано, что ЛЦ обладают различной способностью связываться с У.М. Аминокислотная последовательность фрагмента CDR3 и вторичная структура ЛЦ являются определяющими в силе этого взаимодействия. Удалось даже синтезировать циклический пептид, который, связываясь с УМ, предотвращал развитие КН у экспериментальных животных [6]. В настоящее время концепция о различной способности ЛЦ связываться с УМ является ведущей в понимании патогенеза К.Н. Вместе с тем это единственное исследование, которое пока не подтверждено в клинических работах.
УМ (белок Тамма—Хорсфалла) секретируется эпителиальными клетками восходящего отдела петли Генле в количестве 20—100 мг/сут [22]. Синтез У.М. кодируется геном, располагающимся на хромосоме 16p12.3. Ген У.М. состоит из 11 экзонов. В 4-м экзоне находится домен 8 цистеинов (D8C), биологическая функция которого неясна. Однако посредством именно этого участка УМ взаимодействует с фрагментом CDR3 ЛЦ при КН. В настоящее время выявлено 113 мутаций в гене У.М. Большинство мутаций обнаружено в 4-м (более 80%) и 5-м (более 11%) экзонах. В D8C известно 35 мутаций [23—28].
Благодаря расшифровке генома человека в последние годы появились данные об ассоциированных с УМ болезнях почек и участии УМ в развитии хронической почечной недостаточности (ХПН). Предполагают, что мутантный УМ задерживается в эндоплазматической сети клеток, что приводит к их повреждению. С внутриклеточной аккумуляцией УМ связывают нарушение концентрационной способности почек, повышение реабсорбции натрия и мочевой кислоты в проксимальном отделе канальцев, а также развитие интерстициального воспаления и фиброза [29]. Фенотипически мутации гена УМ проявляются гиперурикемией, подагрой, образованием кист в почках, хроническим тубулоинтерстициальным нефритом с ранним развитием терминальной стадии ХПН [30].
Несмотря на непосредственное участие УМ в формировании КН, отсутствуют данные о возможных изменениях его структуры, особенно в D8C, при М.М. Нуждается в изучении вопрос о наличии мутаций гена УМ и их значении в развитии КН.
Цель исследования: изучить характер мутаций в 4-м и 5-м экзонах гена УМ у больных ММ с секреций моноклональных ЛЦ и сравнить их частоту при КН и без поражения почек.
Материалы и методы
В исследование включили 24 больных ММ, находящихся в ремиссии. В дебюте заболевания у 5 (21%) больных выявлена секреция PIgG, у 2 (8%) — PIgА, у 1 (4%) — PIgD, у 1 (4%) — PIgM, у 15 (63%) пациентов диагностирована миелома Бенс-Джонса. У всех больных в моче определялся белок Бенс-Джонса. У 17 (71%) пациентов отмечалась секреция ЛЦ κ-типа, у 7 (29%) — λ-типа. Пациентов разделили на 2 группы. В 1-ю группу вошли 14 больных ММ с диализозависимой ПН, обусловленной К.Н. Диагноз К.Н. устанавливали на основании критериев IMWG [4], у 7 пациентов характер нефропатии подтвержден гистологически. Во 2-ю группу (группу сравнения) включили 10 больных ММ, у которых в дебюте заболевания при наличии моноклональной секреции ЛЦ ПН отсутствовала. Критерием включения пациентов в группу сравнения служило наличие одного из следующих критериев: 1) наличие белка Бенс-Джонса в сыворотке по результатам иммуноэлектрофореза и денситометрии или содержание моноклональных свободных ЛЦ в сыворотке более 1500 мг/л; 2) наличие белка Бенс-Джонса в моче более 1 г/сут.
Для исследования мутаций в гене УМ использована геномная ДНК, выделенная из образцов периферической крови пациентов. Амплификацию 4-го и 5-го экзонов гена УМ проводили с помощью праймеров Umod45_for 5’-CTGAAGCTGGGCTTTTCTGT-3’ и Umod45_rev 5’-CTCACAGGGGAGGAATGTGT-3’ с использованием реакционной смеси PCR MasterMix 2X («Promega», США) при следующих условиях: первоначальная денатурация 5 мин; 35 циклов 94 °C — 30 с, 60 °C — 30 с, 72 °C — 90 с; итоговая элонгация 72 °C — 10 мин. Определение нуклеотидной последовательности проводили методом Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI3130 («Termofisher Scientific», Foster City, США) с использованием набора Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit («Termofisher Scientific», Foster City, США) и указанных праймеров и двух дополнительных: Umod45_seq1 5’GCCCTGGCCACATGTGTCAATGTGG 3’ и Umod45_seq4 5’GGGTCACAGGGACAGACAGACAAT 3’.
Результаты
Статистически значимых различий по количеству секретируемых моноклональных ЛЦ в сыворотке и моче не получено, что позволило считать сравниваемые группы сопоставимыми (табл. 1). Результаты исследования мутаций 4-го и 5-го экзонов гена УМ представлены в табл. 2. В результате изучения 4-го и 5-го экзонов гена УМ у больных ММ выявлено пять мутаций: 4 распространенных полиморфизма гетерозиготного характера (rs7193058, rs13335818, rs28544423, rs78691203), не приводящие к замене кодируемой аминокислоты, и одна миссенс-мутация p.142R>R/Q. Частота полиморфизмов гена УМ статистически значимо не различалась в обеих группах и составила 36% у пациентов с КН и 30% без КН (p>0,05). Две мутации (p.142R>R/Q и rs78691203) встречались только у больных с П.Н. Сочетание 2 или 3 полиморфизмов наблюдалось у 4 (29%) больных с КН и у 1 (10%) пациента в группе сравнения. В участке гена, кодирующем связующий с ЛЦ участок УМ — (D8C), выявлены 2 мутации rs13335818 и rs78691203, которые встречались как у больных КН (у 4), так и в группе сравнения (в 1 случае).
Обсуждение
Полиморфизмы гена УМ выявлены у 30% больных М.М. Частота минорного аллеля (MAF — minor allel frequency) полиморфизма rs7193058 в общей популяции составляет 0,419 (т.е. 419 раз на 1000 геномов), у больных ММ — 0,125. MAF rs13335818 составил 0,085 у больных ММ, в общей популяции MAF — 0,326. MAF rs28544423 — 0,105 у пациентов с ММ, в общей популяции MAF rs28544423 — 0,329. Обнаружен лишь один редкий полиморфизм rs78691203, который в общей популяции встречается с частотой 0,0198. Данных о частоте миссенс-мутации p.142R>R/Q в литературе нет [31]. Таким образом, частота выявленных полиморфизмов гена УМ у больных ММ оказалась существенно ниже, чем в общей популяции. Не исключено, что подобное несоответствие обусловлено малой выборкой пациентов.
Различий по частоте мутаций в зависимости от поражения почек не обнаружено. Отсутствие существенных различий в структуре 4-го и 5-го экзонов гена УМ, в том числе в участке, кодирующем D8C, позволяет сделать вывод, что первичная структура УМ у больных КН не имеет характерных особенностей. Соответственно процесс взаимодействия моноклональных ЛЦ с УМ определяется другими факторами, например свойствами самих ЛЦ или количеством секретируемого УМ.
В крупном исследовании, выполненном на выборке из 10 884 человек, выявлены полиморфизмы, влияющие на количество секретируемого УМ: rs12917707 (ген UMOD), rs12446492 (соседний ген PDILT), rs4533720 (соседний ген MARCH), rs6988636 (соседний ген FAM83). Обращает внимание, что 3 из 4 полиморфизмов локализованы вне гена У.М. Обнаружена сильная прямая корреляция между наличием этих полиморфизмов и повышением содержания УМ в моче, а при rs12917707 — с ПН [26].
Не исключено, что дальнейший анализ генома человека и изучение биологии УМ позволит выявить новые звенья в патогенезе поражения почек, в том числе при КН.
Заключение
У больных ММ не найдено статистически значимых различий по частоте и характеру полиморфизмов 4-го и 5-го экзонов гена УМ, в том числе в участке, кодирующем D8C, при КН и без поражения почек. Обнаружена миссенс-мутация p.142R>R/Q в гене УМ, которая ранее не была описана.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.