ГКСФ — гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГСК — гемопоэтические стволовые клетки

КМ — костный мозг

ЛА — лейкаферез

ЛК — лейкоконцентрат

МТ — масса тела

ОЛЛ — острый лимфобластный лейкоз

ЦФ — циклофосфамид

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

AUC — area under curve

CD — cluster of differentiation

FITC — fluorescein isothiocyanate

ISHAGE — International Society of Hematotherapy and Graft Engineering

PE — phycoerythrin

Аутологичные и аллогенные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) CD34⁺ периферической крови наряду с костным мозгом (КМ) широко используются для трансплантации при различных онкогематологических и аутоиммунных заболеваниях. При обычных условиях количество стволовых клеток CD34⁺ в крови крайне мало и составляет 0,01—0,05% от всех лейкоцитов. Для увеличения количества ГСК в крови применяют препараты, стимулирующие пролиферацию клеток CD34⁺ в КМ и усиливающие их миграцию в кровеносное русло. Для этой цели используют ростовой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ). Процесс быстрого увеличения количества стволовых клеток в крови называют мобилизацией [1—3]. Мобилизованные ГСК концентрируют и собирают с помощью процедуры лейкафереза (ЛА). Использование мобилизованных ГСК крови в трансплантации имеет ряд преимуществ: не требуется проведения эксфузии КМ и наркоза, а период восстановления кроветворения у реципиентов более короткий по сравнению с реципиентами, получавшими в качестве трансплантата К.М. При этом в продукте ЛА (лейкоконцентрате — ЛК) содержится большее количество лимфоцитов донора, что повышает риск развития такого опасного осложнения трансплантации аллогенных ГСК, как реакция трансплантат против хозяина. Восстановление гемопоэза при трансплантации аутологичных ГСК происходит быстрее, что уменьшает вероятность развития инфекционных и геморрагических осложнений. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что для наиболее адекватного восстановления кроветворения после высокодозной химиотерапии необходимо введение 2·10⁶ клеток CD34⁺ и более на 1 кг массы тела (МТ) пациента [4, 5].

Мобилизацию стволовых клеток у больных можно проводить по двух схемам: только с помощью ГКСФ при «стабильном кроветворении» или в сочетании с миелосупрессивной химиотерапией (например, циклофосфамидом) и последующим назначением ГКСФ [1]. Применение разных режимов мобилизации приводит к тому, что кинетика «выхода» ГСК в кровь и изменение количества лейкоцитов у больных резко варьирует. Для сбора не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ у пациентов с гемобластозами требуется проведение от одной до четырех процедур Л.А. Принятие решения о времени проведения первой процедуры ЛА является ключевым моментом в мобилизации ГСК. В ряде протоколов начало сбора клеток определяется количеством лейкоцитов в крови или количеством клеток CD34⁺ в крови.

В данной работе мы поставили цель определить параметры, которые коррелируют с количеством собранных клеток CD34⁺ на 1 кг МТ пациента за одну процедуру Л.А. Для этого мы определяли количество лейкоцитов и количество стволовых клеток CD34⁺ в периферической крови непосредственно перед началом процедуры ЛА и подсчитывали количество клеток CD34⁺ на 1 кг МТ в продукте ЛА, проведенного в тот же день.

Пациенты. В период с мая 2015 г. по октябрь 2016 г. проведено 208 исследований у 189 пациентов (100 мужчины, 89 женщин, медиана возраста 51 год, медиана массы тела 75 кг) и у 3 доноров аллогенных ГСК. В исследование включили 98 пациентов с множественной миеломой, 19 — с острым Т-лимфобластным лейкозом, 10 — лимфомой Ходжкина, 53 — с В-клеточными лимфомами, 9 — с Т-клеточными лимфомами. Мобилизацию стволовых клеток проводили в двух режимах: применяли только ГКСФ в дозе 10 мкг/кг/сут в течение 5—6 дней на фоне стабильного состояния кроветворения (17 пациентов, 20 исследований) или использовали химиотерапевтические препараты с последующим введением ГКСФ в дозе 5—10 мкг/кг/сут. В зависимости от примененных химиотерапевтических препаратов выделили 4 группы пациентов: с введением циклофосфамида (ЦФ) в дозе 4 г/м² (85 пациентов, 90 исследований), мобилизация ГСК по протоколу ОЛЛ-2009 после 3-го курса консолидации после восстановления кроветворения (19 пациентов, 19 исследований), использование режима DHAP: дексаметазон 40 мг, цисплатин 100 мг/м², цитарабин 2 г/м² (45 пациентов, 50 исследований) и применение других схем мобилизации ГСК у пациентов с лимфомами: ЛБ-М-04, DA-R-EPOCH, ESGAP, IGEV, NHL-BFM-90, SMILE, TL-REZ-09, R-HMA, R-BAC (26 пациентов, 29 исследований). У каждого пациента непосредственно перед процедурой ЛА определяли содержание лейкоцитов в крови и абсолютное количество CD34⁺ в 1 мкл. Измерение абсолютного количества клеток CD34⁺ при мобилизации ГСК на стабильном кроветворении начинали при количестве лейкоцитов 5·10⁹/л, а при применении комбинированных режимов мобилизации с цитостатическими препаратами — при количестве лейкоцитов не менее 1·10⁹/л. Процедуру Л.А. осуществляли с помощью системы COBE Spectra («Cobe Laboratories, Quedgeley», Великобритания). Анализ данных проводили в зависимости и независимо от схемы мобилизации ГСК.

Подсчет клеток CD34⁺. Абсолютное количество клеток CD34⁺ как в крови, так и в ЛК определяли на основании 2-платформенного алгоритма согласно протоколу ISHAGE методом проточной цитофлуориметрии [6].

Образцы периферической крови с антикоагулянтом ЭДТА и ЛК окрашивали моноклональными антителами анти-CD45 FITC (клон 2D1) и анти-CD34 PE (клон 8G12) и раствором 7-аминоактиномицина D для определения жизнеспособности клеток («Becton Dickinson», США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II («Becton Dickinson», США) с подсчетом доли клеток CD34⁺ от событий CD45⁺, соответствующим лейкоцитам. Кроме того, в образцах периферической крови и ЛК подсчитывали количество лейкоцитов с помощью гематологического анализатора. Абсолютное количество клеток CD34⁺ в мкл в крови рассчитывали по формуле 1.

доля СД34+клеток (%)·количество лейкоцитов в МКЛ

абсолютное содержание СД34+(клеток/мкл) в крови=

Содержание клеток CD34⁺ на 1 кг МТ пациента в заготовленном ЛК рассчитывали по формуле 2.

доля СД34+клеток (%)·количество ядросодержащих клеток в ЛК.

100%)·МТ пациентов (кг)

абсолютное содержание СД34+(клеток/кг) в ЛК=

Статистический анализ. Проводили определение статистически значимых различий между параметрами абсолютного количества лейкоцитов и клеток CD34⁺ в крови перед проведением ЛА, а также количества клеток CD34⁺ на 1 кг МТ в заготовленном ЛК в зависимости от режима мобилизации. Данные представлены в виде среднего ± стандартной ошибки среднего. Проверку нормальности распределения осуществляли с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для распределений, отличных от нормального, определение различий проводили, используя критерий Манна—Уитни.

Выполняли регрессионный анализ — поиск линейной зависимости между количеством заготовленных в ЛК клеток CD34⁺ на 1 кг МТ и количеством лейкоцитов, а также абсолютным количеством CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови непосредственно перед проведением первой процедуры ЛА с определением коэффициента детерминации (R²). Статистически значимыми признавали различия при р<0,05. Проводили ROC-анализ для определения количества лейкоцитов, а также абсолютного количества CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови непосредственно перед проведением первой процедуры ЛА, при которой наиболее вероятно за одну процедуру собрать не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг М.Т. Статистический анализ выполнен с помощью программного дополнения XLSTAT 2015.1 для Microsoft Excel.

По результатам 208 исследований, количество лейкоцитов в крови перед проведением ЛА варьировало от 1,10·10⁹ до 63,00·10⁹/л, среднее (14,66±0,94)·10⁹/л; абсолютное содержание клеток CD34⁺ варьировало от 1,79 до 1341,05 в 1 мкл, среднее — 63,59±8,43 в 1 мкл. Количество собранных за одну процедуру ЛА клеток CD34⁺ варьировало от 0,13·10⁶ до 88,40·10⁶ на 1 кг МТ, среднее — 5,04·10⁶±0,57·10⁶ на 1 кг МТ.

Данные по количеству лейкоцитов и клеток CD34⁺ в периферической крови до сбора ГСК и количестве собранных за одну процедуру ЛА клеток CD34⁺ в зависимости от примененного режима мобилизации ГСК представлены в таблице.

Так как выборки не соответствовали нормальному распределению (р<0,05), то для нахождения достоверных отличий применяли критерий Манна—Уитни. Установлено, что на стабильном кроветворении количество лейкоцитов в крови после мобилизации достоверно выше, чем при применении цитостатических препаратов до введе-ния ГКСФ: ЦФ (р<0,0001), ОЛЛ-2009 (р=0,047), DHAP (р<0,0001), а также других схем (р=0,035). Однако количество мобилизованных клеток CD34⁺ в крови при стабильном кроветворении достоверно меньше, чем при приме-нении цитостатических режимов мобилизации: ЦФ (р=0,001), ОЛЛ-2009 (р=0,032), DHAP (р=0,002) и другие схемы (р=0,031), как и количество собранных клеток CD34⁺ в заготовленном ЛК (рис. 1). Среди режимов с использованием различных химиотерапевтических препаратов для мобилизации ГСК достоверно меньшее количество лейкоцитов характерно для режимов ЦФ и DHAP по сравнению с ОЛЛ-2009 (р=0,001 и р=0,000 соответственно). Достоверных различий по абсолютному числу клеток CD34⁺ в крови до сбора ГСК и количеству заготовленных клеток CD34⁺ в ЛК между различными режимами с цитостатическими препаратами не выявлено. Достоверно меньшая доля ЛА, при которых собрано ≥2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ в одном ЛК, характерна только для мобилизации при стабильном кроветворении по сравнению с режимами мобилизации с применением ЦФ и DHAP (см. таблицу; р=0,001 и 0,030 соответственно).

Для определения оптимального порогового абсолютного числа клеток CD34⁺ и абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови перед проведением ЛА, при котором наиболее вероятен успешный сбор не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ за одну процедуру, нами проведен ROC-анализ для различных режимов мобилизации (рис. 2). Анализ ROC-кривых показал, что количество лейкоцитов в крови до ЛА не является параметром, определяющим эффективность сбора при большинстве типов мобилизации ГСК. Только для режимов мобилизации ЛБ-М-04, DA-R-EPOCH, ESGAP, IGEV, NHL-BFM-90, SMILE, TL-REZ-09, R-HMA и R-BAC площадь под ROC-кривой достоверно больше 0,5 и составила 0,776. Для этих режимов оптимальное пороговое количество лейкоцитов в крови, при котором удается собрать не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ, составило 11·10⁹/л (чувствительность 75% и специфичность 75%).

Для всех режимов мобилизации абсолютное количество клеток CD34⁺ в периферической крови предопределяло количество собранных ГСК за одну процедуру Л.А. Однако мы выявили минимальные различия в оптимальном пороговом количестве клеток CD34⁺ в крови для разных режимов мобилизации, которое при стабильном кроветворении составило 25 в 1 мкл (чувствительность 100% и специфичность 93%), при мобилизации с помощью ЦФ — 22 в 1 мкл (чувствительность 94% и специфичность 83%), на протоколе ОЛЛ-2009 — 25 в 1 мкл (чувствительность 100% и специфичность 88%), при применении режима DHAP — 25 в 1 мкл (чувствительность 93% и специ-фичность 95%), а при мобилизации клеток у пациентов с лимфомами по другим режимам, отличным от DHAP, — 21 в 1 мкл (чувствительность 100% и специфичность 92%; см. таблицу).

При анализе данных вне зависимости от схемы мобилизации ГСК выявлено наличие тесной связи между количеством заготовленных в одном ЛК клеток CD34+ на 1 кг МТ и абсолютным количеством CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови непосредственно перед проведением процедуры ЛА (R²=0,831; р<0,0001; рис. 3, а). Между количеством лейкоцитов в периферической крови перед сбором ГСК и количеством заготовленных клеток CD34⁺ на 1 кг МТ корреляции не найдено (R²=0,000; р=0,816; рис. 3, б). Это указывает на то, что именно количество клеток CD34⁺ в крови определяет количество собранных клеток CD34⁺ на 1 кг МТ в ЛК, а не количество лейкоцитов в периферической крови.

ROC-анализ показал, что сбор не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ не зависит от количества лейкоцитов в периферической крови перед Л.А. Площадь под ROC-кривой (AUC) составила 0,517 (рис. 4, а), и достоверных отличий от AUC = 0,5 не выявлено (р=0,690).

Для абсолютного содержания клеток CD34⁺ площадь под кривой AUC составила 0,954 (рис. 4, б) и достоверно отличалась от 0,5 (р<0,0001). В ходе ROC-анализа выявлено, что оптимальным пороговым количеством клеток CD34⁺ в крови, при котором удается собрать 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ и более, является 20 клеток CD34⁺ в 1 мкл непосредственно перед сбором ГСК. В 79 ЛА не удалось собрать 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ за одну процедуру, и среди них только в 13 (16,4%) случаях перед процедурой ЛА у пациента имелось более 20 клеток CD34⁺ в 1 мкл. В результате исследований 128 ЛА собрано 2·10⁶ и более клеток CD34⁺ на 1 кг МТ за одну процедуру ЛА, среди которых только в 5 (3,9%) случаях имелось менее 20 клеток CD34⁺ в 1 мкл в крови перед процедурой. Таким образом, чувствительность выбранного порогового количества составила 96,1%, а специфичность — 83,6%. Из 207 исследований в 136 количество клеток CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови составило 20 и более, из них в 123 (90,4%) случаях удалось выполнить сбор 2·10⁶ и более клеток CD34⁺ на 1 кг МТ за одну процедуру ЛА.

Для трансплантации аллогенных и аутологичных ГСК часто используют мобилизованные стволовые клетки периферической крови. После проведения режима кондиционирования необходимо переливание хотя бы 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ для успешного восстановления кроветворения и уменьшения риска развития геморрагических и инфекционных осложнений. Вследствие применения разных режимов мобилизации число процедур ЛА необходимых для сбора достаточного количества стволовых клеток варьирует. Вычисление оптимального параметра, позволяющего определить время начала сбора ГСК, является важным для их мобилизации и заготовки. Оптимальным является сбор 2·10⁶ и более клеток CD34⁺ на 1 кг МТ всего за одну процедуру Л.А. Это не только способствует экономической выгоде, но и уменьшает объем заготовленного ЛК, содержащего, в частности, криопротекторы, например диметилсульфоксид, который может вызывать побочные реакции у больных в момент введения стволовых клеток. Самым простым параметром, который часто используют для определения времени начала ЛА, является абсолютное содержание лейкоцитов в периферической крови [7]. И этим параметром иногда продолжают пользоваться в гематологических клиниках. В связи с этим мы провели работу по выявлению основного параметра, определяющего эффективность мобилизации и сбора ГСК.

В данном исследовании мы проанализировали количество лейкоцитов и клеток CD34⁺ в периферической крови до сбора ГСК, количество заготовленных клеток CD34⁺ на 1 кг МТ за одну процедуру ЛА, а также долю успешных сборов в зависимости от примененных режимов мобилизации ГСК. Доказано, что, несмотря на статистически значимое большее количество лейкоцитов в периферической крови у пациентов с мобилизацией ГСК на стабильном кроветворении, достоверно большее количество клеток CD34⁺ в периферической крови и заготовленных клеток CD34⁺ в ЛК было у пациентов с применением цитостатических препаратов до введения ГКСФ. Доля успешных сборов (при которых заготовлено не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ) статистически значимо меньше среди пациентов, у которых проводили мобилизацию ГСК на стабильном кроветворении. Достоверных различий по количеству клеток CD34⁺ в крови до сбора, количеству собранных клеток CD34⁺ за одну процедуру ЛА, а также доле успешных сборов ГСК при применении разных режимов мобилизации, включающих цитостатические препараты, не найдено.

В нашем исследовании мы показали отсутствие связи между количеством лейкоцитов в периферической крови до сбора ГСК и количеством собранных ГСК.

Показана зависимость между абсолютным количеством клеток CD34⁺ в крови до сбора и количеством клеток CD34⁺ на 1 кг МТ в полученном ЛК, и индекс R² составил 0,831. Согласно ROC-анализу оптимальным количеством, при котором необходимо начинать процедуру ЛА независимо от режима мобилизации, является 20 клеток CD34⁺ в 1 мкл. В 90,4% случаях при количестве 20 и более клеток CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови, удалось собрать за одну процедуру ЛА не менее 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг М.Т. При анализе данных в зависимости от используемых режимов мобилизации мы показали, что абсолютное содержание клеток CD34⁺ в крови до ЛА является параметром, определяющим эффективность сбора ГСК для всех типов мобилизации ГСК. Мы установили оптимальное пороговое количество клеток CD34⁺ в крови для разных режимов мобилизации: на стабильном кроветворении оно составило 25 в 1 мкл, при мобилизации с помощью ЦФ — 22 в 1 мкл, на протоколе ОЛЛ-2009 — 25 в 1 мкл, при применении режима DHAP — 25 в 1 мкл, а при мобилизации клеток у пациентов с лимфомами по другим режимам — 21 в 1 мкл.

Исследования других авторов показали, что существует корреляция между абсолютным количеством клеток CD34⁺ в крови перед ЛА и количеством собранных стволовых клеток [8—11].

В работах S. Armitage и соавт. [12] и C. Elliott и соавт. [13] также получено пороговое количество 20 в 1 мкл, в исследовании M. Boulassel [14] — 26 в 1 мкл для сбора 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ. В работах T. Demirer и соавт. [15] выявлено, что необходимо 34 стволовых клетки в 1 мкл в крови; N. Schwella и соавт. [16] — 40 в 1 мкл для сбора 2,5·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ. В работе Л.П. Менделеевой и соавт. [1] показано, что сбор в количестве (2—5)·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ за одну процедуру ЛА может быть выполнен при 40 клетках CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови в день проведения Л.А. Различия в рассчитанных пороговых значениях клеток CD34⁺ в периферической крови перед сбором, полученные разными авторами, могут быть обусловлены величиной выборок, разными режимами мобилизации, а также разными технологиями и оборудованием для проведения ЛА.

В данной работе подтверждено, что абсолютное количество клеток CD34+ в периферической крови коррелирует с количеством собранных стволовых клеток в Л.К. Установлено, что количество лейкоцитов не коррелирует с количеством собранных стволовых клеток, а первая процедура ЛА может быть проведена при любом количестве лейкоцитов в крови. Учитывая полученные данные, можно рекомендовать при применении мобилизации ГСК с цитостатическими препаратами начинать подсчет клеток CD34+ в периферической крови при увеличении количества лейкоцитов в периферической крови до 1·10⁹/л с дальнейшим каждодневным мониторингом абсолютного количества клеток CD34⁺ в крови. Достижение количества 20 и более клеток CD34⁺ в 1 мкл в периферической крови позволяет с высокой вероятностью за одну процедуру заготовить 2·10⁶ клеток CD34⁺ на 1 кг МТ независимо от режима мобилизации ГСК.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.