АГ — артериальная гипертония

ГН — гломерулонефрит

ГУ — гематурия

ДАД — диастолическое артериальное давление

ИЛ-10 — интерлейкин-10

ИЛ-6 — интерлейкин-6

ИСТ — иммуносупрессивная терапия

НС — нефротический синдром

п.н. — пар нуклеотидов

ПУ — протеинурия

ПЦР — полимеразная цепная реакция

САД — систолическое артериальное давление

СКФ — скорость клубочковой фильтрации

ССЗ — сердечно-сосудистые заболевания

ТПН — терминальная почечная недостаточность

ФСГС — фокально-сегментарный гломерулосклероз

ХБП — хроническая болезнь почек

ХГН — хронический гломерулонефрит

ЦФ — циклофосфан

ЭУ — эритроцитурия

IL13 — ген интерлейкина-13

IL1A — ген интерлейкина-1

IL1R — ген антагониста рецептора интерлейкина-1

Неуклонный рост заболеваемости хронической болезнью почек (ХБП) и связанных с ней инвалидностью и смертностью представляет собой серьезную медико-социальную проблему во всем мире. В связи с этим по-прежнему актуален поиск новых факторов риска возникновения и прогрессирования почечной недостаточности. В структуре ХБП особое место занимает хронический гломерулонефрит (ХГН) как одна из причин терминальной стадии почечной недостаточности (ТПН). Несмотря на то что в последние годы достигнут значительный прогресс в понимании механизмов возникновения и прогрессирования этого многофакторного заболевания, молекулярно-генетические основы, определяющие разнообразие его клинических проявлений, различия в исходах и эффективности терапии, окончательно не установлены. Их изучение имеет не только теоретическое, но и большое практическое значение, поскольку создает подходы для разработки персонифицированной тактики лечения больных ХГН.

В последние годы особое внимание уделялось изучению роли воспалительного ответа, опосредуемого провоспалительными цитокинами и хемокинами, в поражении почек. В ряде исследований уточнены характеристики основных про- и противовоспалительных цитокинов и механизмы их действия, приводящие к формированию склероза клубочкового аппарата и интерстициальной ткани [1—8]. Это позволило рассматривать кодирующие их гены в качестве возможных генов-кандидатов, полиморфные маркеры которых могут быть ассоциированы с предрасположенностью к развитию и прогрессированию ХГН, определять особенности его клинического течения и ответ на терапию.

Опубликованы единичные работы, посвященные изучению ассоциаций полиморфных маркеров генов цитокинов с транскрипционной активностью и уровнем цитокинов, а также клиническими проявлениями заболеваний почек, в том числе гломерулонефритов (ГН), эффективностью иммуносупрессивной терапии (ИСТ). Так, обнаружена ассоциация полиморфных маркеров C-889T гена интерлейкина-1 (IL1A) и A-4257G гена интерлейкина-13 (IL13) с выраженностью протеинурии [9]. В другой работе генотип АА полиморфного маркера A-4257G гена IL13 был ассоциирован с развитием нефротического синдрома с минимальными изменениями (НСМИ) у детей [10]. Получены данные о влиянии ряда полиморфных маркеров генов провоспалительных цитокинов интерлейкина-4 (IL4), интерлейкина-6 (IL6) и фактора некроза опухоли-α (TNF) на чувствительность к ИСТ при НСМИ у детей [11]. Для полиморфных маркеров С-592С гена интерлейкина-10 (IL10) и VNTR гена — антагониста рецептора интерлейкина-1 (IL1R) описана ассоциация с клиническими вариантами ХГН [12]. В то же время в ряде работ [13—15] подобные ассоциации отсутствовали, что объясняется, по-видимому, малым числом исследований, различием изучаемых популяций, в том числе неоднородностью групп по клиническим и морфологическим формам ХГН.

Цель работы состояла в изучении ассоциации полиморфных маркеров G (–238)A гена TNF, G (–174)C гена IL6 и G (–1082)A IL10 с клиническими особенностями ХГН и ответом на ИСТ.

Обследовали 102 больных ХГН (47 мужчин и 55 женщин), наблюдавшихся в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева УКБ № 3 ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Клинические особенности ХГН на момент постановки диагноза проанализировали у всех больных. У 38,8% больных протеинурия (ПУ) не превышала 1 г/сут, у 16,3% наблюдалась выраженная (более 1 г/сут) ПУ, но без нефротического синдрома (НС), у 44,9% имелся Н.С. Прогностически наиболее неблагоприятное сочетание НС и артериальной гипертонии (АГ) отмечалось у 21,1% обследованных больных. Гематурия (ГУ) на момент постановки диагноза наблюдалась у 61% больных ХГН. Синдром А.Г. (систолическое артериальное давление — САД ≥140 и/или диастолическое артериальное давление — ДАД ≥90 мм рт.ст.) отмечался у 30 (35,7%) больных, в том числе у 13 тяжелая АГ (АД >160/110 мм рт.ст.). Нарушение функции почек (скорость клубочковой фильтрации — СКФ CKD-EPI <60 мл/мин/1,73 м²) на момент установления диагноза ХГН наблюдалось у 19 пациентов, из них у 12 это расценивали как проявление активности нефрита.

На основании совокупности клинических данных на момент постановки диагноза ХГН выделены 4 степени активности ХГН. Минимальную активность ХГН констатировали при ПУ <1 г/сут, эритроцитурии (ЭУ) <30 в поле зрения, нормальном или стойко повышенном (выше верхней границы нормы для конкретной лаборатории) уровне креатинина (n=45). Умеренной активности ГН соответствовала ПУ от 1 до 3 г/сут в сочетании с сохранной функции почек. Высокую активность ГН диагностировали при ПУ ≥3 г/сут или наличии НС и сохранной функцией почек. Очень высокая степень активности характеризовалась наличием ПУ ≥3 г/сут, НС либо ПУ 1—3 г/сут и ЭУ ≥30 в поле зрения в сочетании с нарушением функции почек в рамках активности нефрита.

У 56 пациентов диагноз ХГН подтвержден морфологически. Мезангиопролиферативный Г.Н. выявлен у 17 больных, мезангиокапиллярный — у 5, мембранозная нефропатия — у 11, минимальные изменения — у 10, фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) — у 5, фибропластический гломерулонефрит — у 2, нефросклероз — у 5 больных и у 1 пациентки диагностирована С3-нефропатия. На момент проведения биопсии почки средний возраст больных составил 37,1±17,0 года; длительность ХГН — 3,2±5,1 года.

ИСТ проводилась у 62 больных с активными формами нефрита. Возраст начала ИСТ составил 35,3 (25,7; 52,7) года, длительность ХГН — 6,1 (1,3; 14,3) мес. Большинство пациентов получали стандартную ИСТ, которая включала прием преднизолона у 14 больных в виде монотерапии, у 32 в сочетании с пульс-терапией преднизолоном и циклофосфаном (ЦФ), у 7 в сочетании с приемом цитостатиков (ЦФ принимали 2 пациента, азатиоприн — 2 и препараты микофеноловой кислоты — 3), 9 пациентам назначали циклоспорин А.

Эффективность ИСТ оценивали к 12-му месяцу лечения после достижения полного ответа, которым у пациентов с НС считали купирование его со снижением ПУ до <0,5 г/сут (при полном восстановлении или сохранении функции почек), а у больных с активным ХГН без НС — снижение ПУ до <0,5 г/сут с полным восстановлением или сохранением функции почек. Частичным ответом считали уменьшение признаков НС или купирование НС с персистированием ПУ >0,5 г/сут с улучшением или сохранением функции почек (для больных с НС) и снижение ПУ не менее чем на 50% с сохранением или восстановлением функции почек (для больных с активным ХГН без НС). Сохранение или нарастание выраженности НС и/или нарушения функции почек, персистирование ПУ >0,5 г/сут рассматривали как отсутствие ответа.

Данные об ответе на ИСТ получены у 35 больных: полный ответ к 12-му месяцу лечения достигнут у 31,4% пациентов, частичный — у 31,4% и ответ на ИСТ к 12-му месяцу отсутствовал у 37,1% больных.

Аллели полиморфных маркеров G (–238)A гена TNF, G (–174)C гена IL6 и G (–1082)A гена IL10 идентифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим анализом длин рестрикционных фрагментов.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследованных осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции после инкубации образцов крови с протеиназой К в 0,1% растворе SDS. Термостабильная ДНК-полимераза Taq получена от фирмы «Диалат» (Москва, Россия), протеиназа К — от фирмы «Диа-М» (Москва, Россия). Фрагменты геномной ДНК, содержащие полиморфные участки генов-кандидатов, амплифицировали с помощью ПЦР на термоциклере ABI 7500 Fast.

Амплификацию полиморфного участка G (–238)A (rs361525) гена TNF проводили с помощью ПЦР в реальном времени на термоциклере CFX96 («BioRad», США) в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (FJ, 5′-CCTACACACAAATCAGTCA 3′ и RJ, 5′-CAAGCATCAAGGATACCC-3′), 100 нМ зондов (FAM, FAM-5′-ctGcTcCgAtTccg-3′-BHQ1 и VIC, VIC-5′-ctGcTcTgAtT ccg-3′-BHQ2) 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 60 °C/60 с — 40 циклов. Размер продукта амплификации 90 пар нуклеотидов (п.н.). Анализ продуктов амплификации проводили методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии BioRad CFX Manager 3.0.

Амплификацию полиморфного участка G (–174)C (rs1800795) гена IL6 осуществляли с помощью ПЦР на основе аллельспецифичной ПЦР с использованием 3 пар праймеров (F-внеш., GACTTCAGCTTTACTCTTTGTCAAGACA R-внеш., GCACACA CAGAAGGCACTTGAATAGA, R-внутр., GAATGAGCCTCAGA CATCTCCAGTCCTA) в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 92 °C/10 с, 62 °C/15, 72 °С/20 — 35 циклов. Размер продукта амплификации 326 и 205 и/или 176©. Анализ продуктов амплификации проводили методом электрофоретического разделения.

Амплификацию полиморфного участка G (–1082)A (rs1800896) гена IL10 выполняли с помощью ПЦР в реальном времени на термоциклере ABI 7500 Fast («Applied Biosystems», США) в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01% твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров (FJ, 5′-GGAAGAAGTTGAAATAACAAG-3′ и RJ, 5′-CCAAGAC AACACTACTAAG-3′), 100 нМ зондов (FAM, FAM-5′-acttcCcc CtcCcaaa-3′-BHQ1 и VIC, VIC-5′-acttcCccTtcCcaaa-3′-BHQ2) 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °C/2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 60 °C/60 — 40 циклов. Размер продукта амплификации 126 п.н. Анализ продуктов амплификации проводили методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

При статистической обработке данных для протяженных переменных рассчитывали среднее значение и стандартное отклонение (mean ± SD) или медиану, 25-й и 75-й квартили — Me (25%; 75%) в зависимости от соответствия данных нормальному распределению. Достоверность различий оценивали с помощью критерия U Манна—Уитни. Для проверки статистической значимости различий частотных показателей использовали критерий χ² по Пирсону. Достоверными считали различия при р<0,05; 0,05≤р<0,1 рассматривали как тенденцию к различию.

Генотипы исследуемых полиморфных маркеров генов распределялись следующим образом: частота генотипа GG полиморфного маркера G (-238)A гена TNF составила 72,5%, генотипа GA — 24,5%, генотипа AA — 3%. Генотип GG полиморфного маркера G (–74)C гена IL6 выявлен у 72,5% больных, генотип GC — у 10,8% и генотип СС — у 16,7%. Генотип GG полиморфного маркера G (–1082)A гена IL10 идентифицирован в 9,8% случаев, генотип GA — в 50% и генотип AA — в 40,2%.

В связи с малым количеством гомозигот по минорным аллелям исследуемых генов дальнейший анализ проводили в следующих группах: для гена TNF в группах GG и A (объединявшей носителей генотипов GA и AA); для гена IL6 в группах GG и С (включавшей больных с генотипами GC и CC); для гена IL10 в группах G (в которую объединили гомозигот GG с гетерозиготами GА) и AA.

Ассоциации исследуемых полиморфных маркеров с возрастом начала ХГН не обнаружено. Соотношение мужчин и женщин в выделенных группах также было сопоставимым.

При изучении особенностей клинической картины на момент диагностики ХГН в зависимости от полиморфного маркера G (-238)A гена TNF достоверных различий между группами не обнаружено.

Выявлена тенденция к различиям активности ХГН в зависимости от генотипов полиморфного маркера G (–174)C гена IL6: в группе больных с генотипом GG частота развития активного ГН (выраженная ПУ/НС с сохранной функцией почек) выше, чем у носителей аллеля С (41,9 и 25% соответственно; р=0,088), в то время как у носителей аллеля С чаще обнаруживали очень высокую активность ХГН (выраженная ПУ/НС с нарушением функции почек) по сравнению с группой GG (21,4 и 8,1% соответственно; р=0,069). Кроме того, в целом у носителей аллеля С гена IL6 по сравнению с больными, гомозиготными по аллелю G, на момент постановки диагноза ХГН чаще отмечалось нарушение функции почек (в 35,7 и 13% случаев соответственно; р=0,014).

У носителей генотипа АА полиморфного маркера G (–1082)A гена IL10 чаще обнаруживали АГ в дебюте ХГН (у 56,3% по сравнению с 32,2% носителей аллеля G; р=0,023). У них же наблюдалась тенденция к более частому сочетанию НС и АГ в начале заболевания (29,7% по сравнению с 15,5% у больных из группы IL10G; р=0,082).

В зависимости от результатов морфологического исследования биоптата почки пациентов объединили в 2 группы. В 1-ю группу включили больных с пролиферативными вариантами ХГН (22 с мезангиопролиферативным и мембранопролиферативным ГН), а во 2-ю группу — 26 пациентов с непролиферативными формами (мембранозной нефропатией, ФСГС, болезнью минимальных изменений); больных с нефросклерозом и фибропластическим ГН из этой части анализа исключили, поскольку на этой стадии определить первичную форму нефрита не представлялось возможным. Обнаружена тенденция к более высокой распространенности пролиферативных вариантов ХГН у больных с генотипом GG (ген TNF) по сравнению с носителями аллеля, А (46,3 и 20% соответственно; р=0,067), тогда как у лиц с генотипом GG (ген IL6) несколько чаще наблюдались непролиферативные формы нефрита (53,7%) по сравнению с носителями аллеля С (26,7%; р=0,067).

При изучении ответа на ИСТ обнаружено, что у носителей аллеля С гена IL6 и генотипа GG гена IL10 частота достижения полного ответа к 12-му месяцу лечения достоверно выше (см. таблицу).

Полиморфный маркер G (-238)A гена TNF, кодирующего фактор некроза опухоли-α, — мощный провоспалительный цитокин, продуцируемый активированными макрофагами, при заболеваниях почек практически не изучен. Мы обнаружили только две работы, в которых обследуемые группы включали пациентов с ТПН в исходе различных первичных и вторичных нефропатий. В одной из этих работ ассоциация данного полиморфного маркера с предрасположенностью к почечной недостаточности и развитием сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) при ТПН отсутствовала [16], в то время как в другой носительство генотипа АА полиморфного маркера G (–238)A было ассоциировано с повышенным риском развития ТПН [17]. В нашем исследовании не обнаружена ассоциация данного полиморфного маркера с клиническими проявлениями ХГН. Однако выявлена тенденция к более высокой частоте выявления пролиферативных вариантов ХГН у больных с генотипом GG по сравнению с носителями аллеля, А (46,3 и 20% соответственно; р=0,067). Вероятно, это может отражать более выраженное стимулирующее влияние TNF-α на пролиферацию мезангиальных клеток у носителей данного генотипа.

Ассоциация с поражением почек полиморфного маркера G (–174)C гена IL6, кодирующего другой медиатор воспаления — интерлейкин-6 (ИЛ-6), также изучена недостаточно. По данным одних исследований, с более высокими уровнями ИЛ-6 в крови ассоциировано носительство аллеля С [18], а по другим — аллеля G [19]. В нескольких работах носительство аллеля С ассоциировано с худшим прогнозом (например, более низкой выживаемостью почечного трансплантата [20]) и предрасположенностью к развитию ССЗ [21,22], в том числе при заболеваниях почек. Так, у пациентов, получающих диализную терапию, носительство аллеля С ассоциировано с высоким АД, гипертрофией левого желудочка и снижением функционального статуса [23]. По нашим данным, «неблагоприятным» оказалось носительство аллеля С, которое ассоциировано с более частым нарушением функции почек в дебюте ХГН. Однако при изучении ответа на ИСТ, оказалось, что у носителей аллеля С частота достижения ремиссии к 12-му месяцу терапии выше, чем у гомозигот GG. Этот результат отчасти согласуется с результатами исследования S. Agrawal и соавт. [11], которые обнаружили более высокую распространенность генотипа GG у детей со стероидрезистентным НС, что свидетельствовало об ассоциации между данным полиморфным маркером и ответом на стероиды. Поскольку мы не исследовали корреляции между носительством различных генотипов исследуемого полиморфного маркера и уровнем ИЛ-6 в крови, механизмы, лежащие в основе выявленных ассоциаций, нуждаются в уточнении.

Активно изучаются ассоциации полиморфных маркеров гена IL10, кодирующего основной противовоспалительный цитокин — интерлейкин-10 (ИЛ-10), который угнетает секрецию Th1-клетками ИЛ-1, α-ФНО, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 [24—26] и снижает активность макрофагов. Ген IL10, кодирующий синтез ИЛ-10, состоит из 5 экзонов и содержит 3 однонуклеотидных полиморфизма: С (–592)A, C (–819)T и G (–1082)A [27, 28]. Из них наиболее исследован полиморфизм G (–1082)A; обнаружено, что носительство генотипа АА ассоциировано с низким уровнем ИЛ-10 и повышенной смертностью, связанной с ССЗ, у больных с ТПН [28, 29]. Полученные нами результаты свидетельствуют об ассоциации генотипа АА с АГ на момент диагностики ХГН, а также о тенденции к более частому сочетанию НС и АГ в начале заболевания. Кроме того, мы обнаружили ассоциацию между данным полиморфным маркером и эффективностью ИСТ: пациенты с генотипом АА гена IL10 хуже отвечали на ИСТ по сравнению с носителями аллеля G (положительный ответ наблюдался в 12,5 и 47,4% случаях соответственно; р=0,029). В мировой литературе связь данного полиморфного маркера с ответом на ИСТ при первичном ГН не отражена. В работе Т.Н. Красновой и соавт. [30], оценивавших взаимосвязь данного полиморфного маркера с течением волчаночного нефрита, носительство аллеля, А оказалось связано с лучшим ответом на лечение. Таким образом, выявленная нами ассоциация между полиморфным маркером G (–1082)A гена IL10 и эффективностью ИСТ нуждается в уточнении в последующих исследованиях, равно как и механизмы влияния ИЛ-10 на клинические особенности ХГН.

На основании полученных результатов можно сделать вывод об ассоциации полиморфных маркеров G (–238)A гена TNF, G (–174)C гена IL6 и G (–1082)A гена IL10 с клиническими и морфологическими особенностями ХГН, а также ответом на ИСТ. Однако необходимы дальнейшие исследования в более крупных выборках, в том числе с использованием подходов, позволяющих уточнить совокупный вклад данных (и других) генов в развитие заболевания, персонифицировать прогноз и терапевтическую тактику.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 14−04−01819).

Конфликт интересов отсутствует.