АБТ — антибактериальная терапия

БИК — бактериологическое исследование крови

ИЭ — инфекционный эндокардит

ПЦР — полимеразная цепная реакция

Инфекционный эндокардит (ИЭ) относится к опасным для жизни и трудно излечимым заболеваниям [1]. Основу диагностики ИЭ в настоящее время составляют модифицированные критерии Duke, обновленные в 2015 г. [2—4]. Наиболее достоверным и прогностически значимым критерием ИЭ является положительная культура крови, определяющая выбор эффективной антибактериальной терапии (АБТ). К сожалению, установить этиологический фактор удается не всегда. В странах Европы культуронегативный ИЭ встречается у 2,5—31% больных [2, 4], в Африке у 40—69,7% [5, 6], а в России у 31,7—87% [7, 8]. «Золотым стандартом» диагностики ИЭ остается патогистологическое исследование резецированных тканей клапанов или эмболических фрагментов. Для усовершенствования этиологической диагностики, особенно при культуронегативном ИЭ, предлагается применение иммунохимических (реакция непрямой иммунофлюоресценции или иммуноферментный анализ) и молекулярно-биологических методов (полимеразная цепная реакция — ПЦР, реакция циклического секвенирования), что нашло отражение в рекомендациях Европейского общества кардиологов 2015 г., в которых по сравнению с аналогичным документом 2009 г., значительно расширены показания к применению ПЦР [2, 3, 9—11].

Большинство исследований по использованию ПЦР для этиологической диагностики ИЭ основаны на исследовании тканей иссеченных пораженных клапанов во время операции [5, 6]. Исследования по прямому сравнению культуры крови и ПЦР крови практически не встречаются или они небольшие. Так, по данным M. Kemp и соавт. [12], положительные результаты бактериологического исследования крови (БИК) получены у 43 (77%) из 56 человек, ПЦР — у 42 (75%), из них только 5 — при отрицательных посевах крови. По данным C. Kühn и соавт. [13], положительные посевы крови имелись у 9 (30%) из 30, ПЦР — у 23 (77%), из них 16 при культуронегативном И.Э. По данным A. El-Kholy и соавт. [5], положительные результаты БИК получены у 40 (30,3%) из 132 больных, ПЦР — у 52 (39,4%), из них 9 при культуронегативном И.Э. Во всех исследованиях обращали внимание ложноотрицательные результаты ПЦР при положительных результатах БИК: в первом исследовании в 6 случаях, во втором исследовании — в 2, в третьем — в 8, что объяснялось авторами наличием ингибиторов ПЦР в крови, погрешностью забора материала (на фоне АБТ) [5, 12, 13]. Исследования также показали, что бактериальные и грибковые ДНК/РНК могут сохраняться в течение нескольких месяцев или лет после перенесенного ИЭ в крови и тканях клапана [14, 15], а интерпретация полученных результатов ПЦР должна проводиться с большой осторожностью в связи с необходимостью выделения из спектра полученных возбудителей только этиологически значимых организмов [16, 17]. В связи с изложенным представляет интерес прямое сравнение бактериологического и молекулярно-биологического методов для этиологической диагностики ИЭ как в крови, так и в ткани резецированного сердечного клапана.

Целью исследования являлось одновременное изучение традиционных бактериологических и молекулярно-биологических методов исследования в этиологической диагностике ИЭ.

Обследовали 53 больных ИЭ, находившихся на лечении в Городской клинической больнице № 64 с сентября 2012 г. по январь 2015 г. Диагноз И.Э. устанавливали на основании модифицированных критериев Duke (2009). Всем пациентам проводили одновременное одномоментное бактериологическое и молекулярно-биологическое (ПЦР или ПЦР с последующим секвенированием) исследования. Все процедуры по забору крови выполняли в стерильных условиях и до назначения антибиотикотерапии. У каждого пациента брали образцы крови в объеме 20 мл, троекратно, с интервалом 20—30 мин, из 3 разных периферических вен. Кровь по 10 мл распределяли во флаконы с питательной средой: VersaTREKREDOX1 (аэробная среда) и REDOX2 (анаэробная среда) и инкубировали в автоматическом бактериологическом анализаторе VersaTREK 528 Galen (Россия) в течение 5 дней. Положительную культуру высевали на дифференциально-диагностические среды с последующей идентификацией возбудителя по общепринятой методике с определением антибиотикочувствительности. Средняя продолжительность бактериологического исследования составляла 5—7 дней.

При одновременном молекулярно-биологическом исследовании выполняли троекратный забор крови по 5 мл в стерильные пробирки с ЭДТА, которые доставляли в течение 24 ч в отдел молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (зав. — к.м.н. Г. А. Шипулин). Спектр возбудителей, определяемый при помощи молекулярно-биологического метода, включал следующих представителей: ДНК чувствительного и резистентного к метициллину Staphylococcus aureus, резистентных к метициллину коагулазонегативных Staphylococcus spp., ДНК энтеробактерий (семейства Enterobacteriaceae, включая Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteusspp. и др.), Staphylococcusspp., Streptococcusspp., ДНК Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, ДНК Streptococcus agalactiae, ДНК Streptococcus pyogenes, ДНК грибов рода Candida (C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis и C. tropicalis), ДНК энтерококков (включая E. faecium, E. faecalisи др.). Средняя продолжительность выполнения ПЦР составляла 4—6 ч, ПЦР с секвенированием — 1—2 дня. В случае летального исхода осуществляли бактериологическое и молекулярно-биологическое исследования резецированного пораженного клапана (всего 8).

Математическую и статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакетов прикладного программного обеспечения Statistica for Windows 6.0 и Excel 7.0 (Microsoft, США), Statistica 6.0 (StatSoft, США). Статистическую гипотезу проверяли с помощью критерия χ². Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Включили в исследование 53 больных ИЭ (Duke, 2009) c медианой возраста 62 (34—73) года, среди которых мужчины составили 31 (58,5%), женщины — 22 (41,5%). Первичная форма ИЭ имелась у 32 (60,4%), вторичная форма — у 21 (39,6%). Последняя представлена неревматическими поражениями клапанов сердца (у 6; или 11,3%), ревматическими пороками (у 2; или 3,8%), ИЭ на фоне перенесенного ранее ИЭ (у 2; или 3,8%), ИЭ протеза клапана (у 10; или 18,9%) и ИЭ кардиостимулятора (у 1; или 1,9%). Преобладало поражение одного клапана (у 47; или 88,7%) с локализацией вегетаций на аортальном клапане (у 21; или 39,6%), несколько реже встречался ИЭ трикуспидального (у 15; или 28,3%) и митрального (у 11, или 20,8%) клапанов. Многоклапанная локализация вегетаций имелась у 6 (11,3%) обследованных. Употребление внутривенных наркотиков выявлено у 17 (32,1%) пациентов, алкоголя — у 14 (26,4%). Из сопутствующих заболеваний наиболее часто встречалась артериальная гипертония (у 31; или 58,5%), реже — фибрилляция предсердий (у 18; или 34%), ишемическая болезнь сердца (у 12; или 22,6%), церебральные заболевания (у 12; или 22,6%), сахарный диабет (у 9; или 17%), цирроз печени (у 4; или 7,5%). Благоприятный исход наблюдался у 33 (62,3%) обследованных, протезирование клапана выполнено 8 (15,1%) пациентам, умерли 12 (22,6%) больных. Согласно модифицированным критериям диагностики ИЭ DUKE (2009 г.) достоверный диагноз установлен у 47 (88,7%) пациентов, вероятный — у 6 (11,3%).

Одновременное сравнительное исследование бактериологического и молекулярно-биологического методов. Положительные результаты БИК по традиционной методике получены у 28 (52,8%) пациентов, представленные Staphylococcusspp.(у 16, или 57,1%), Enterococcus spp. (у 4, или 14,3%), Streptococcus spp. (у 2, или 7,1%), K. pneumoniae (у 1, или 3,5%)и E. coli (у 1, или 3,5%).Полифлора выявлена у 4 (14,3%) обследованных, у 25 (47,1%) рост отсутствовал.

Положительные результаты выявления ДНК методом ПЦР с секвенированием получены в 34 (64,2%) случаях, при этом конкордантные результаты с БИК имелись в 21 из 28 случаев положительной культуры крови традиционным методом, а дискордантные — в 7 (25%) из 28 (табл. 1). Из них в 3 случаях отмечено полное несоответствие результатов двух сравниваемых методов: в образцах крови при БИК определялся рост Enterococсus spp., а молекулярно-биологическим методом выявлены ДНК иных возбудителей. У оставшихся 4 обследованных при положительных результатах БИК идентифицировать ДНК возбудителя методом ПЦР не удалось. Отмечено, что среди этих 4 пациентов у 3 проводилась предшествующая длительная массивная АБТ (более 3 мес), а в одном случае отмечено недавнее употребление внутривенных наркотических препаратов.

Отрицательные результаты БИК наблюдались у 25 (47,2%) обследованных, из них положительные результаты ПЦР получены у 10 (см. табл. 1).

Исследование образцов тканей пораженных резецированных клапанов обоими методами выполнено у 8 пациентов (табл. 2). У 3 (37,5%) больных отмечено полное совпадение результатов по этиологическому агенту ИЭ как в крови, так и в аутопсийном материале. В 2 случаях получен более широкий спектр возбудителей методом ПЦР как в крови, так и при исследовании тканей клапана. В одном случае молекулярно-биологическим методом не удалось идентифицировать ДНК C. albicansв крови (выявленную позже в ткани клапана), а у одного пациента результаты обоих исследований разошлись полностью. Выявлен один случай доказанной контаминации венозной крови при исследовании традиционным способом. В крови бактериологическим методом прижизненно определялся рост Gemellahaemolysans (облигатная флора ротовой полости, дыхательного и желудочно-кишечного тракта), а молекулярно-биологическим методом идентифицирована ДНК S. constellatus, подтвержденная при исследовании образцов тканей резецированного пораженного клапана. При этом помимо S. constellatus обоими методами также обнаружены рост и ДНК иных бактерий, за исключением G. haemolysans.

При одновременном сравнении бактериологических и молекулярно-биологических методов идентификации этиологического агента ИЭ в венозной крови положительные результаты бактериологического исследования получены у 28 (52,8%) из 53 пациентов с конкордантными результатами у 21 (36,9%) обследованного, дискордантными — у 7 (13,2%), а положительные результаты ПЦР при отрицательном БИК (у 25; или 47,2%) имелись у 10 (18,9%) пациентов. Таким образом, конкордантные результаты в целом имелись у 36 (67,9%) человек, что согласуется с результатами ранее проведенных исследований — 67,5% [6], 61,7% [18], 53,5% [19] и 48% [20].

В нашем исследовании 7 положительных случаев бактериологического исследования не совпали с результатами ПЦР-метода. При этом в 3 из них бактериологическим методом обнаружены представители энтерококков, а методом ПЦР выявлены ДНК возбудителей, представленных другой кокковой флорой. Данный феномен K. Harris и соавт. [18] связывали с возможностью неточной идентификации микроорганизма фенотипическими методами, что мы также считаем наиболее очевидным и в нашем исследовании, в связи с этим при назначении АБТ мы в первую очередь ориентировались на результаты ПЦР. В отношении случаев отрицательной ПЦР при положительной культуре крови традиционным методом (у 4; или 14,3%), представленной стафилококками (у 3) и энтерококками (у 1), следует отметить, что аналогичные результаты получены C. Lamas и соавт. [6], которые объяснены техническими особенностями, связанными с трудностью разрушения клеточной стенки кокковых возбудителей в процессе экстракции ДНК. Нам также не представляется возможным полностью исключить контаминацию культуры крови при использовании бактериологических методов диагностики [6, 18, 21].

Наибольшую диагностическую ценность представляет возможность идентификации возбудителя молекулярно-биологическими методами при отрицательных результатах бактериологического исследования, на долю которых согласно зарубежным данным приходится 31—60% [3, 18], а в России 31,7—87% [7, 8]. В нашей работе отрицательные результаты исследования венозной крови традиционными методами определены у 25 (47,2%) обследованных, при этом у 10 (40%) пациентов удалось установить этиологический агент методом ПЦР прижизненно, что позволило с успехом назначить соответствующую АБТ у 8 больных, 2 пациента умерли.

Особенностью нашего исследования явилась высокая частота выявления полифлоры молекулярно-биологическими методами — 14 (26,4%), что ставит вопрос о назначении рациональной АБТ с учетом чувствительности всех возбудителей. В аналогичных исследованиях сообщается о единичных случаях смешанной инфекции [6, 18, 22, 23], однако все исследования были небольшими и основаны на изучении методом ПЦР только тканей клапанов. При определении этиологически значимой флоры для назначения АБТ мы в первую очередь ориентировались на концентрацию ДНК возбудителя. АБТ, назначаемая в зависимости от чувствительности возбудителя согласно рекомендациям Европейского общества кардиологов по диагностике и лечению ИЭ (2009—2015), как правило, перекрывает более широкий спектр микроорганизмов. Полученные данные оставляют открытыми для обсуждения ряд вопросов и обусловливают необходимость дальнейших исследований в этом направлении.

Проведение молекулярно-биологического исследования тканей резецированного пораженного сердечного клапана имеет особенное значение как для установления этиологии при культуронегативном ИЭ, так и для возможности объективного контроля эффективности этиологической диагностики в целом [18, 24]. Изучение тканей резецированного пораженного сердечного клапана выполнено у 8 пациентов, при этом выявленная флора представлена более широким спектром возбудителей, чем при изучении образцов венозной крови, что наиболее вероятно связано с образованием бактериальных пленок на структурах пораженного сердечного клапана.

Таким образом, исходя из анализа полученных результатов удалось провести идентификацию этиологического агента ИЭ при использовании бактериологического исследования в 52,8% случаев, молекулярно-биологического — 64,2%, а при использовании обоих методов — в 71,7%. Отсутствие крупных научных исследований по определению диагностической эффективности и особенностей идентификации возбудителей при ИЭ в крови определяет в настоящее время место молекулярно-биологических методов как дополнительных при получении отрицательных результатов бактериологического исследования. Однако нам представляется актуальным расширение показаний к выполнению данного теста, учитывая его более широкие диагностические возможности. В связи с малой изученностью проблемы для окончательного определения значения современных методов в диагностике ИЭ необходимо продолжить исследования по изучению особенностей использования молекулярно-биологического анализа при идентификации этиологического агента в различном биологическом материале.

Сохраняется значительный тренд в этиологической структуре ИЭ в сторону преобладания доли стафилококков и энтерококков и уменьшения доли стрептококков. Сочетанное применение бактериологических и молекулярно-биологических методов значительно увеличивает возможность прижизненной идентификации этиологического агента в крови 52,8—71,7% случаев. Дискордантные результаты при сравнении бактериологических и молекулярно-биологических методов в крови (13,2%) обусловлены техническими особенностями обоих методов и определяют трудности этиологической диагностики И.Э. Актуально расширение показаний к применению молекулярно-биологических методов, не только при культуронегативном ИЭ, но в качестве метода контроля за достоверностью результатов, полученных с использованием бактериологических методов диагностики в крови. Изучение тканей пораженного клапана при ИЭ остается «золотым стандартом» достоверной этиологической диагностики.

Конфликт интересов отсутствует.